山東半島地區(qū)禽Ⅰ型副粘病毒毒力的多源差異與解析一、引言1.1研究背景與意義禽Ⅰ型副粘病毒（AvianParamyxovirusType1，APMV-1），又稱新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus，NDV），是一種對養(yǎng)禽業(yè)危害極為嚴重的病原體，被世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）列為法定報告的動物疫病。該病毒屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒亞科正禽腮腺炎病毒屬，是不分節(jié)段的單股RNA病毒，具有廣泛的宿主譜，可感染雞、鴨、鵝、鴿等多種禽類。自1926年首次在印度尼西亞的爪哇和英國的新城暴發(fā)以來，新城疫在全球范圍內(nèi)頻繁傳播，給各國養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。山東半島作為我國重要的養(yǎng)禽產(chǎn)區(qū)之一，家禽養(yǎng)殖規(guī)模龐大，涵蓋了雞、鴨、鵝、鴿等多個品種，在我國養(yǎng)禽業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。然而，長期以來，禽Ⅰ型副粘病毒在該地區(qū)的家禽養(yǎng)殖中頻繁出現(xiàn)，嚴重威脅著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。其引發(fā)的疫情不僅導致家禽的大量發(fā)病和死亡，增加了養(yǎng)殖成本，還使得禽產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量受到影響，降低了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益。此外，疫情的發(fā)生還可能引發(fā)消費者對禽產(chǎn)品安全性的擔憂，進而對整個養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)鏈造成沖擊。不同來源的禽Ⅰ型副粘病毒在毒力上存在顯著差異，這種差異直接影響著病毒的致病性、傳播能力以及對家禽健康的危害程度。例如，強毒株往往能夠引起家禽急性、高度致死性的感染，導致大批家禽迅速死亡；而弱毒株可能僅引起家禽輕微的癥狀或隱性感染，但在一定條件下也可能發(fā)生毒力返強，給養(yǎng)禽業(yè)帶來潛在的風險。因此，深入研究山東半島地區(qū)不同來源禽Ⅰ型副粘病毒的毒力差異，對于準確評估病毒的危害程度、制定科學有效的防控策略具有至關(guān)重要的意義。一方面，明確毒力差異有助于精準防控疫病。通過對不同毒力毒株的特性研究，能夠針對性地制定免疫程序和防控措施。對于強毒株流行區(qū)域，可以加強疫苗的免疫力度和監(jiān)測頻率，采用高效的疫苗株進行免疫接種，提高家禽的免疫力；對于弱毒株感染情況，可以采取更為靈活的防控策略，注重養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生管理和生物安全措施，降低病毒傳播的風險。另一方面，研究毒力差異還能為疫苗研發(fā)提供關(guān)鍵依據(jù)。了解不同毒株的毒力特點和免疫原性，有助于篩選出更合適的疫苗候選株，研發(fā)出更具針對性和有效性的疫苗，從而提高疫苗對不同毒株的保護效果，更好地保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。綜上所述，開展山東半島地區(qū)不同來源禽Ⅰ型副粘病毒毒力差異比較研究具有重要的現(xiàn)實意義和應用價值，對于有效防控禽Ⅰ型副粘病毒病、促進山東半島養(yǎng)禽業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有不可忽視的作用。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀禽Ⅰ型副粘病毒自被發(fā)現(xiàn)以來，一直是國內(nèi)外獸醫(yī)領域的研究熱點。在國外，早期的研究主要集中在病毒的分離鑒定、形態(tài)結(jié)構(gòu)和基本生物學特性方面。1926年首次暴發(fā)后，科研人員迅速對病毒進行了分離，明確了其對禽類的致病性，并初步了解了病毒的一些生物學特征，如病毒的傳播途徑、宿主范圍等。隨著研究的深入，對病毒分子生物學的研究逐漸展開，包括病毒基因組結(jié)構(gòu)、基因功能以及病毒與宿主細胞相互作用機制等方面。通過對病毒全基因組測序和分析，揭示了病毒基因的組成和排列方式，發(fā)現(xiàn)其編碼的6種結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的生命周期中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，融合蛋白（F）介導病毒入侵細胞和病毒粒子的組裝，其裂解位點處堿性氨基酸的數(shù)量決定著病毒致病性的強弱，強毒株和中等毒力毒株在F蛋白裂解位點存在多個堿性氨基酸，而弱毒株裂解位點多為中性氨基酸。在毒力研究方面，國外學者建立了多種評估病毒毒力的方法，如雞胚平均致死時間（MDT）、1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）和6周齡雞靜脈內(nèi)致病指數(shù)（IVPI）等指標的測定。這些方法為準確評估病毒毒力提供了科學依據(jù)，通過對不同毒株毒力指標的測定，發(fā)現(xiàn)病毒毒力存在明顯差異，且毒力差異與病毒的基因型、宿主適應性等因素密切相關(guān)。同時，對病毒的流行病學研究也在全球范圍內(nèi)廣泛開展，通過對不同地區(qū)、不同宿主中病毒的監(jiān)測和分析，繪制了病毒的全球傳播圖譜，明確了不同基因型病毒的地理分布特征和流行規(guī)律。國內(nèi)對禽Ⅰ型副粘病毒的研究起步相對較晚，但發(fā)展迅速。早期主要是對國內(nèi)疫情的調(diào)查和病毒的分離鑒定，明確了該病毒在我國的廣泛分布和對養(yǎng)禽業(yè)的嚴重危害。隨后，在病毒分子生物學、毒力特性和流行病學等方面的研究不斷深入。在分子生物學研究中，國內(nèi)學者對大量國內(nèi)分離株的基因序列進行了測定和分析，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，揭示了我國禽Ⅰ型副粘病毒的遺傳演化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)我國流行的毒株具有獨特的基因型分布特點，與國外部分地區(qū)的毒株存在明顯差異。在毒力研究方面，國內(nèi)也開展了大量工作，對不同來源、不同基因型的毒株進行了毒力測定和分析，探討了毒力差異與基因序列變異之間的關(guān)系。例如，通過對雞源、鴨源、鴿源等不同宿主來源毒株的研究，發(fā)現(xiàn)不同宿主來源的毒株在毒力上存在顯著差異，鴿源毒株對雞和鴿的致病性表現(xiàn)不同，雞源強毒株對雞具有較強的致病力。在流行病學研究中，國內(nèi)通過長期的監(jiān)測和調(diào)查，掌握了病毒在我國不同地區(qū)、不同季節(jié)的流行情況，為制定針對性的防控策略提供了重要依據(jù)。山東半島地區(qū)作為我國重要的養(yǎng)禽產(chǎn)區(qū)，針對禽Ⅰ型副粘病毒的研究也有一定的基礎。已有研究對該地區(qū)的病毒進行了分離鑒定和血清學特性分析，成功分離出多株禽Ⅰ型副粘病毒強毒株，并對其血清學特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)3株雞源禽Ⅰ型副粘病毒屬于強毒株，鴿源禽Ⅰ型副粘病毒對雞不發(fā)病，對鴿則表現(xiàn)為強毒株。然而，目前該地區(qū)的研究仍存在一些不足。在毒力差異研究方面，雖然已有部分毒株的毒力測定數(shù)據(jù)，但研究范圍相對較窄，缺乏對不同來源、不同基因型毒株全面系統(tǒng)的比較分析，未能充分揭示該地區(qū)病毒毒力的多樣性和分布規(guī)律。在病毒與宿主相互作用機制方面的研究也較為薄弱，對于不同毒力毒株感染宿主后引起的免疫反應差異、病毒在宿主體內(nèi)的復制和傳播規(guī)律等方面了解甚少。此外，在防控技術(shù)研究方面，雖然目前已經(jīng)有一些常規(guī)的防控措施，但針對該地區(qū)不同毒力毒株特點的精準防控技術(shù)和新型疫苗研發(fā)仍有待加強。本研究將針對山東半島地區(qū)研究的不足，全面系統(tǒng)地開展不同來源禽Ⅰ型副粘病毒毒力差異的比較研究，深入分析毒力差異與基因序列、宿主適應性等因素的關(guān)系，為該地區(qū)禽Ⅰ型副粘病毒病的精準防控和疫苗研發(fā)提供更為全面、深入的理論依據(jù)和技術(shù)支持。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在全面、系統(tǒng)地比較山東半島地區(qū)不同來源禽Ⅰ型副粘病毒的毒力差異，深入剖析毒力差異與病毒基因序列、宿主適應性等因素之間的內(nèi)在聯(lián)系，為該地區(qū)禽Ⅰ型副粘病毒病的精準防控和疫苗研發(fā)提供堅實的理論基礎和有力的技術(shù)支撐。具體研究內(nèi)容如下：病毒的分離與鑒定：在山東半島地區(qū)多個養(yǎng)禽場廣泛采集具有典型新城疫癥狀的家禽病料，包括雞、鴨、鵝、鴿等不同品種。運用經(jīng)典的病毒分離技術(shù)，將病料接種于SPF雞胚或敏感細胞系，如雞胚成纖維細胞（CEF），進行病毒的分離培養(yǎng)。通過觀察雞胚的病變特征，如雞胚的死亡時間、胚體的出血情況等，以及細胞的病變效應（CPE），如細胞的皺縮、融合、脫落等，初步判斷是否成功分離到病毒。隨后，利用血凝試驗（HA）檢測病毒是否具有血凝活性，若呈現(xiàn)陽性，則進一步采用血凝抑制試驗（HI），使用標準的禽Ⅰ型副粘病毒陽性血清進行鑒定，以確定所分離的病毒是否為禽Ⅰ型副粘病毒。毒力測定：對分離得到的禽Ⅰ型副粘病毒毒株，采用國際通用的毒力測定方法，包括雞胚平均致死時間（MDT）、1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）和6周齡雞靜脈內(nèi)致病指數(shù)（IVPI）的測定。在MDT測定中，將病毒稀釋成不同梯度，接種10日齡SPF雞胚，每個梯度接種5-10枚雞胚，觀察雞胚的死亡情況，記錄死亡時間，計算MDT，MDT越短，表明病毒毒力越強；ICPI測定時，選取健康的1日齡雛雞，腦內(nèi)接種病毒，每組接種10-20只雛雞，連續(xù)觀察8天，每天根據(jù)雛雞的發(fā)病癥狀進行評分，計算ICPI，ICPI值在0-2.0之間，數(shù)值越大，毒力越強；IVPI測定則是對6周齡雞進行靜脈內(nèi)接種病毒，每組接種10-20只雞，同樣連續(xù)觀察10天，每天根據(jù)雞的發(fā)病癥狀評分，計算IVPI，IVPI值在0-3.0之間，數(shù)值越大，毒力越強。通過這些指標的測定，準確評估不同來源毒株的毒力強弱?；蛐蛄蟹治觯禾崛「鞫局甑腞NA，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術(shù)，擴增病毒的全基因組或關(guān)鍵基因片段，如融合蛋白（F）基因、血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）基因等。對擴增得到的基因片段進行測序，將測序結(jié)果與GenBank中已公布的禽Ⅰ型副粘病毒基因序列進行比對分析，使用分子生物學軟件，如MEGA，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確不同毒株的基因型和遺傳演化關(guān)系。重點分析F基因裂解位點的氨基酸序列，強毒株和中等毒力毒株在F蛋白裂解位點通常存在多個堿性氨基酸，序列特征為112K/R-R-Q-R/K-R-F117，而弱毒株裂解位點多為中性氨基酸，通過分析裂解位點氨基酸序列，探討毒力差異與基因序列變異之間的關(guān)聯(lián)。宿主適應性研究：選取雞、鴨、鵝、鴿等不同宿主動物，分別用不同來源的禽Ⅰ型副粘病毒毒株進行人工感染試驗。設置感染組和對照組，每組動物數(shù)量根據(jù)實驗設計要求確定，一般不少于10只。觀察感染后動物的發(fā)病癥狀、發(fā)病率和死亡率，定期采集動物的組織器官，如肝臟、脾臟、肺臟、腦組織等，檢測病毒在宿主體內(nèi)的分布和復制情況，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測病毒核酸載量，通過免疫組化或Westernblot方法檢測病毒蛋白的表達。比較不同毒株在不同宿主中的感染情況，分析病毒的宿主適應性與毒力差異之間的關(guān)系。二、山東半島地區(qū)禽Ⅰ型副粘病毒研究概述2.1禽Ⅰ型副粘病毒簡介禽Ⅰ型副粘病毒（APMV-1），在病毒分類學上屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）禽腮腺炎病毒亞科（Avulavirinae）正禽腮腺炎病毒屬（Orthoa-vulavirus），是該屬的唯一成員，又稱新城疫病毒（NDV）。其具有獨特的形態(tài)結(jié)構(gòu)，成熟的病毒粒子多呈球形，直徑范圍在100-300nm之間，部分病毒粒子因囊膜受損而呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)。病毒粒子的最外層為脂質(zhì)雙層囊膜，囊膜上分布著約8-12nm長的纖突，這些纖突由血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）和融合蛋白（F）組成，在病毒感染宿主細胞的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HN蛋白能夠識別并結(jié)合宿主細胞表面的唾液酸受體，介導病毒粒子吸附到細胞表面；F蛋白則促使病毒囊膜與宿主細胞膜發(fā)生融合，使病毒核酸得以進入細胞內(nèi)，從而啟動病毒的復制過程。病毒粒子內(nèi)部的核心結(jié)構(gòu)為核衣殼，呈螺旋對稱排列，由單股負鏈RNA與核蛋白（NP）、磷蛋白（P）和大蛋白（L）緊密結(jié)合而成。其中，RNA是病毒的遺傳物質(zhì)，其長度約為15kb，編碼6種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別是NP、P、M（基質(zhì)蛋白）、F、HN和L。這些蛋白在病毒的生命周期中各自承擔著不可或缺的功能。NP蛋白負責包裹和保護病毒RNA，維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；P蛋白參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復制過程，協(xié)助L蛋白發(fā)揮作用；M蛋白位于囊膜內(nèi)側(cè)，與囊膜和核衣殼相互作用，在病毒粒子的組裝和出芽過程中發(fā)揮重要作用；F蛋白和HN蛋白如前所述，在病毒的吸附和侵入環(huán)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用；L蛋白則是一種依賴于RNA的RNA聚合酶，負責病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復制。APMV-1的基因組具有獨特的特性。其基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，這種結(jié)構(gòu)使得病毒在復制過程中具有較高的效率，但同時也增加了病毒變異的風險?；蚪M從3'端到5'端依次排列著6個基因，分別編碼NP、P、M、F、HN和L蛋白。基因之間存在非編碼的間隔區(qū)，這些間隔區(qū)在病毒基因的表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。例如，間隔區(qū)中的一些序列可以與宿主細胞的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響病毒基因的轉(zhuǎn)錄起始和終止，從而調(diào)節(jié)病毒蛋白的合成水平。此外，APMV-1的基因組具有高度的變異性，不同毒株之間的基因序列存在一定的差異，這種變異主要源于病毒在復制過程中RNA聚合酶缺乏校正功能，導致堿基錯配的概率增加，以及病毒在不同宿主之間傳播時受到的免疫選擇壓力?；虻淖儺悤绊懖《镜纳飳W特性，包括毒力、宿主范圍和免疫原性等。例如，F(xiàn)基因的變異可能導致F蛋白裂解位點的氨基酸序列發(fā)生改變，進而影響病毒的毒力；HN基因的變異可能影響病毒與宿主細胞受體的結(jié)合能力，從而改變病毒的宿主范圍。2.2山東半島地區(qū)研究現(xiàn)狀山東半島地區(qū)作為我國重要的養(yǎng)禽產(chǎn)區(qū)，家禽養(yǎng)殖種類豐富，包括雞、鴨、鵝、鴿等多個品種，養(yǎng)殖規(guī)模龐大，養(yǎng)禽業(yè)在當?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占據(jù)重要地位。然而，禽Ⅰ型副粘病毒在該地區(qū)的頻繁出現(xiàn)，對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重威脅。在病毒分離鑒定方面，已有研究成功從山東半島地區(qū)的病禽中分離出多株禽Ⅰ型副粘病毒。如程璐等人從該地區(qū)分離到4株禽Ⅰ型副粘病毒強毒株，其中3株雞源毒株和1株鴿源毒株，通過雞胚接種、血凝試驗和血凝抑制試驗等方法，確定了這些毒株的病毒特性。研究人員利用SPF雞胚進行病毒分離，將采集的病料接種于雞胚，觀察雞胚的死亡情況和病變特征，通過檢測尿囊液的血凝活性，確定是否分離到病毒，再使用標準陽性血清進行血凝抑制試驗，鑒定病毒的類型。這些研究為后續(xù)對該地區(qū)病毒的深入研究提供了基礎。在流行特點研究中，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)禽Ⅰ型副粘病毒的流行呈現(xiàn)出一定的季節(jié)性和區(qū)域性特征。一般來說，春秋季節(jié)是發(fā)病的高峰期，這可能與氣候變化、家禽的免疫狀態(tài)以及養(yǎng)殖管理等因素有關(guān)。在區(qū)域性方面，養(yǎng)殖密集區(qū)域的發(fā)病率相對較高，因為家禽數(shù)量多、密度大，病毒傳播的機會增加，一旦有疫情發(fā)生，容易迅速擴散。該地區(qū)的病毒流行還與家禽的品種和年齡有關(guān)，雞、鴨、鵝、鴿等不同家禽品種對病毒的易感性存在差異，幼齡家禽通常比成年家禽更容易感染發(fā)病，且病情更為嚴重。然而，目前山東半島地區(qū)關(guān)于禽Ⅰ型副粘病毒的研究仍存在一定的局限性。在毒力差異研究方面，雖然已有部分毒株的毒力測定數(shù)據(jù)，但研究范圍相對較窄，缺乏對不同來源、不同基因型毒株全面系統(tǒng)的比較分析?，F(xiàn)有研究未能充分揭示該地區(qū)病毒毒力的多樣性和分布規(guī)律，對于病毒毒力與基因序列、宿主適應性等因素之間的關(guān)系了解還不夠深入。在病毒與宿主相互作用機制方面的研究也較為薄弱，對于不同毒力毒株感染宿主后引起的免疫反應差異、病毒在宿主體內(nèi)的復制和傳播規(guī)律等方面的研究較少，這限制了對該病毒致病機制的深入理解。本研究將針對這些不足，全面系統(tǒng)地開展山東半島地區(qū)不同來源禽Ⅰ型副粘病毒毒力差異的比較研究。通過廣泛采集不同來源的病毒樣本，運用多種毒力測定方法和基因序列分析技術(shù)，深入研究毒力差異與基因序列、宿主適應性等因素的關(guān)系，旨在填補該地區(qū)在這方面研究的空白，為禽Ⅰ型副粘病毒病的精準防控和疫苗研發(fā)提供更為全面、深入的理論依據(jù)和技術(shù)支持。三、不同來源病毒樣本的采集與鑒定3.1樣本采集策略為全面獲取山東半島地區(qū)不同來源的禽Ⅰ型副粘病毒，本研究制定了科學合理的樣本采集策略。在2023年3月至2024年3月期間，對山東半島地區(qū)的青島、煙臺、威海、濰坊等主要養(yǎng)禽區(qū)域進行了廣泛的樣本采集。這些地區(qū)家禽養(yǎng)殖規(guī)模大、種類豐富，能夠為研究提供具有代表性的樣本。在采集地點的選擇上，涵蓋了規(guī)?；B(yǎng)殖場、小型養(yǎng)殖戶和散養(yǎng)戶。規(guī)?；B(yǎng)殖場具有養(yǎng)殖密度高、管理相對規(guī)范的特點，病毒傳播風險相對集中，且養(yǎng)殖過程中的數(shù)據(jù)記錄較為完善，便于后續(xù)對病毒傳播和感染情況進行分析；小型養(yǎng)殖戶和散養(yǎng)戶的養(yǎng)殖環(huán)境和管理水平參差不齊，病毒來源和傳播途徑可能更為復雜，有助于研究病毒在不同養(yǎng)殖模式下的流行情況。針對雞、鴨、鵝、鴿等不同禽類宿主，共采集樣本300份。其中，雞源樣本100份，鴨源樣本80份，鵝源樣本60份，鴿源樣本60份。在雞源樣本中，包括蛋雞、肉雞和種雞，分別采集30份、40份和30份。蛋雞養(yǎng)殖周期長，在產(chǎn)蛋期易受到病毒感染，影響產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)；肉雞生長速度快，養(yǎng)殖密度大，一旦感染病毒，傳播迅速，經(jīng)濟損失嚴重；種雞作為家禽繁育的源頭，其健康狀況直接關(guān)系到下一代雛雞的質(zhì)量，感染病毒可能導致垂直傳播，對家禽養(yǎng)殖業(yè)的長遠發(fā)展造成威脅。鴨源樣本涵蓋了肉鴨和蛋鴨，分別采集50份和30份，肉鴨和蛋鴨在養(yǎng)殖方式、生長周期和用途上存在差異，對病毒的易感性和感染后的表現(xiàn)也可能不同。鵝源樣本中，肉用鵝和種用鵝各采集30份，種用鵝的健康對于鵝群的繁殖和種群質(zhì)量至關(guān)重要，而肉用鵝的養(yǎng)殖規(guī)模也較大，在養(yǎng)禽業(yè)中占有一定比重。鴿源樣本則主要來自信鴿和肉鴿養(yǎng)殖場，各采集30份，信鴿由于其活動范圍廣，可能接觸到不同地區(qū)的病毒，增加了感染和傳播的風險；肉鴿養(yǎng)殖相對集中，在市場上有一定的需求，其感染病毒的情況也不容忽視。在采集樣本時，優(yōu)先選擇具有典型新城疫癥狀的家禽，如精神沉郁、呼吸困難、腹瀉、神經(jīng)癥狀（如頭頸扭曲、震顫）等。對于病死家禽，及時采集其腦、肝、脾、肺、腎等組織器官，這些組織器官是病毒感染和復制的主要場所，能夠提高病毒的分離率。對于活禽，采集其咽喉拭子和泄殖腔拭子，咽喉拭子可檢測呼吸道感染的病毒，泄殖腔拭子則能反映腸道感染情況，通過同時采集這兩種拭子，可更全面地檢測家禽是否感染病毒。在采集過程中，嚴格遵守無菌操作原則，使用無菌采樣器具和保存液，以避免樣本受到污染。每個樣本均詳細記錄采集地點、家禽品種、日齡、臨床表現(xiàn)等信息，以便后續(xù)對樣本進行分析和研究。3.2病毒分離方法本研究采用雞胚接種法進行病毒分離，該方法具有操作相對簡便、成本較低、病毒增殖迅速等優(yōu)點，是禽Ⅰ型副粘病毒分離的常用方法。具體操作步驟如下：病料處理：將采集的家禽組織病料（腦、肝、脾、肺、腎等）或拭子樣本，立即放入裝有適量無菌PBS（磷酸鹽緩沖液）的離心管中，在冰盒中保存并盡快帶回實驗室處理。在生物安全柜內(nèi)，將組織病料用無菌PBS沖洗3次，去除表面雜質(zhì)和可能存在的污染物。用無菌剪刀將組織剪碎至約1mm3大小，放入無菌研磨器中，加入適量無菌PBS，按照1:5（w/v）的比例進行充分研磨，使組織勻漿化。將勻漿后的組織懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以3000rpm離心20min，去除組織殘渣。取上清液，用0.22μm濾器過濾除菌，得到的濾液即為待接種的病毒液。對于拭子樣本，將拭子在裝有1ml無菌PBS的離心管中反復涮洗，使樣本充分洗脫在PBS中，然后按照上述組織病料處理方法進行離心和過濾除菌。雞胚選擇與接種：選用10日齡SPF（無特定病原體）雞胚，購自正規(guī)的實驗動物供應商，確保雞胚無特定病原體感染，以避免其他病毒或病原體對實驗結(jié)果的干擾。在照蛋燈下觀察雞胚，標記出氣室和胚胎位置。用75%酒精棉球?qū)﹄u胚氣室端蛋殼進行消毒，待酒精揮發(fā)干燥后，用無菌鑷子在氣室端蛋殼上輕輕敲出一個小孔。用無菌注射器吸取0.1-0.2ml處理后的病毒液，通過小孔垂直刺入尿囊腔，注意避免損傷胚胎。接種完畢后，用石蠟將小孔密封，以防止細菌污染和水分蒸發(fā)。將接種后的雞胚放入37℃、5%CO?的恒溫孵箱中繼續(xù)孵育。觀察與收獲：接種后，每隔12h將雞胚取出，在照蛋燈下觀察雞胚的死亡情況和病變特征。如果雞胚死亡，觀察胚體是否有出血、水腫、蜷縮等病變，記錄死亡時間。一般來說，感染禽Ⅰ型副粘病毒的雞胚會在接種后24-72h內(nèi)出現(xiàn)死亡，且死亡雞胚的尿囊液會變得渾濁。對于24h內(nèi)死亡的雞胚，可能是由于接種操作不當或雞胚本身質(zhì)量問題導致，予以舍棄。收集24-72h內(nèi)死亡雞胚的尿囊液，將雞胚置于4℃冰箱中冷藏2-4h，使血液凝固，便于后續(xù)操作。在生物安全柜內(nèi)，用無菌鑷子去除雞胚氣室端的蛋殼，小心剪開尿囊膜，用無菌吸管吸取尿囊液，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。對收獲的尿囊液進行無菌檢查，取少量尿囊液接種于營養(yǎng)瓊脂平板和肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24-48h，觀察是否有細菌生長。若無菌檢查結(jié)果為陰性，說明尿囊液未被細菌污染，可用于后續(xù)實驗；若有細菌生長，則該尿囊液不能用于實驗，需重新進行病毒分離。將無菌檢查合格的尿囊液保存于-70℃冰箱中備用，用于病毒的鑒定和毒力測定等實驗。3.3病毒鑒定流程為了準確鑒定分離得到的病毒是否為禽Ⅰ型副粘病毒，本研究綜合運用了血清學和分子生物學等多種方法，具體鑒定流程如下：血清學鑒定：采用血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）進行初步的血清學鑒定。首先進行HA試驗，以檢測病毒是否具有血凝活性。取適量收獲的雞胚尿囊液，采用常規(guī)微量法在96孔微量凝集板上進行HA試驗。在96孔板的每孔中加入50μl生理鹽水，然后向第一排孔中加入50μl待檢尿囊液，進行倍比稀釋，使病毒液在各孔中的稀釋度依次為1:2、1:4、1:8……直至最后一排孔。隨后，向每孔中加入50μl1%雞紅細胞懸液，輕輕振蕩混勻，室溫靜置30-45min，觀察紅細胞的凝集情況。如果紅細胞均勻分布在孔底，形成一層薄膜，表明發(fā)生了血凝現(xiàn)象，該病毒具有血凝活性；若紅細胞在孔底聚集呈點狀，則為血凝陰性。對HA試驗呈陽性的樣本，進一步進行HI試驗，以確定病毒的血清型。在96孔板中，先加入50μl生理鹽水，再加入25μl已知的禽Ⅰ型副粘病毒陽性血清，然后加入25μlHA效價為4個單位的病毒液，充分混勻，室溫孵育30min。之后，加入50μl1%雞紅細胞懸液，振蕩混勻，室溫靜置30-45min，觀察結(jié)果。若紅細胞不發(fā)生凝集，說明病毒的血凝活性被陽性血清所抑制，可初步判定該病毒為禽Ⅰ型副粘病毒；若紅細胞仍發(fā)生凝集，則表明該病毒不是禽Ⅰ型副粘病毒或血清型與所用陽性血清不匹配。分子生物學鑒定：在血清學鑒定的基礎上，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術(shù)對病毒的核酸進行擴增和分析，以進一步確認病毒的種類。首先提取病毒的RNA，取200μl雞胚尿囊液，加入0.8μlTrizol試劑，充分吹勻，使病毒RNA釋放出來。再加入200μl氯仿溶液，劇烈震蕩30s，使溶液充分乳化，然后以12000rpm離心5min，此時溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機相。小心吸出上清液，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫下靜置5min，使RNA沉淀下來。接著以12000rpm離心5min，棄去上清液，用70%乙醇溶液洗滌沉淀兩次，以去除雜質(zhì)和鹽分。待乙醇揮發(fā)后，加入20μl無RNA酶的純水溶解提取的RNA。根據(jù)GenBank中已公布的禽Ⅰ型副粘病毒基因序列，設計并合成針對病毒F基因或其他保守基因片段的特異性引物。引物序列的設計遵循引物長度適中（一般為18-25bp）、GC含量在40%-60%之間、避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成等原則。取4μl提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應，反應體系為：總RNA4μl，引物1μl（25pmol/μl），5×AMVbuffer2μl，dNTP1μl（25mmol/Leach），AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μl。反應參數(shù)設置為：42℃反應1h，70℃作用10min以滅活AMV反轉(zhuǎn)錄酶，從而獲得cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行PCR反應，反應體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μl，上下游引物各1μl（25pmol/μl），ddH?O38μl，dNTP3μl（25mmol/Leach），10×buffer5μl，LATaqDNA聚合酶1μl。PCR反應參數(shù)為：94℃預變性5min，使模板DNA充分解鏈；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性50s，使DNA雙鏈解開；52℃退火1min，引物與模板DNA互補配對；72℃延伸3min，在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈；最后72℃延伸7min，使反應充分進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在電泳緩沖液中加入適量的溴化乙錠（EB），使EB嵌入DNA雙鏈中，在紫外燈下觀察結(jié)果。若在凝膠上出現(xiàn)與預期大小相符的特異性條帶，表明成功擴增出了禽Ⅰ型副粘病毒的基因片段，進一步證實所分離的病毒為禽Ⅰ型副粘病毒。為了確保鑒定結(jié)果的準確性，可對PCR產(chǎn)物進行測序分析，將測序結(jié)果與GenBank中已知的禽Ⅰ型副粘病毒基因序列進行比對，通過比對分析，確定所分離病毒的基因型和遺傳演化關(guān)系。四、毒力測定指標與方法4.1雞胚平均致死時間（MDT）雞胚平均致死時間（MeanDeathTime，MDT）是評估禽Ⅰ型副粘病毒毒力的重要指標之一，其測定原理基于病毒對雞胚的致死能力。一般來說，毒力越強的病毒，導致雞胚死亡的時間越短。本研究中MDT的測定方法如下：病毒稀釋：將分離并鑒定后的禽Ⅰ型副粘病毒毒株的雞胚尿囊液，用滅菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，從10?1至10??，每個稀釋度準備充足的病毒液，用于后續(xù)的雞胚接種。例如，取0.1ml病毒原液加入0.9ml滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到10?1稀釋度的病毒液；再從10?1稀釋度的病毒液中取0.1ml加入0.9ml滅菌生理鹽水中，得到10?2稀釋度的病毒液，依此類推，直至完成10??稀釋度的制備。雞胚接種：選用10日齡SPF雞胚，在使用前先在照蛋燈下觀察雞胚的活力和發(fā)育情況，確保雞胚健康無異常。將雞胚放置在無菌操作臺上，用75%酒精棉球?qū)﹄u胚氣室端蛋殼進行消毒，待酒精揮發(fā)干燥后，用無菌鑷子在氣室端蛋殼上輕輕敲出一個小孔。用無菌注射器吸取0.1ml不同稀釋度的病毒液，通過小孔垂直刺入尿囊腔，注意避開雞胚，接種完畢后，用石蠟將小孔密封，以防止細菌污染。每個稀釋度接種5-10枚雞胚，同時設置生理鹽水接種的對照組，每組雞胚接種后放入37℃、5%CO?的恒溫孵箱中繼續(xù)孵育。死亡時間記錄：接種后，每隔8-12h將雞胚取出，在照蛋燈下觀察雞胚的死亡情況。如果雞胚死亡，記錄死亡時間，精確到小時。對于24h內(nèi)死亡的雞胚，可能是由于接種操作不當、雞胚本身質(zhì)量問題或非病毒感染因素導致，予以舍棄。連續(xù)觀察雞胚72h，統(tǒng)計不同稀釋度下雞胚的死亡時間。MDT計算：根據(jù)記錄的雞胚死亡時間，計算每個稀釋度下雞胚的平均致死時間。例如，某稀釋度下接種的5枚雞胚，死亡時間分別為36h、40h、48h、52h、60h，則該稀釋度下雞胚的平均致死時間為（36+40+48+52+60）÷5=47.2h。選取能使至少50%雞胚死亡的最高稀釋度，計算該稀釋度下雞胚的平均致死時間，即為該病毒毒株的MDT。根據(jù)國際通用標準，MDT≤60h的毒株通常被判定為強毒株，表明其毒力較強，能夠在較短時間內(nèi)導致雞胚死亡；MDT在61-90h之間的為中等毒力毒株，毒力相對適中；MDT＞90h的則為弱毒株，毒力較弱，雞胚死亡所需時間較長。MDT在評估病毒毒力中具有重要作用。它能夠直觀地反映病毒對雞胚的致病能力，為判斷病毒毒力強弱提供了一個量化的指標。通過比較不同來源毒株的MDT，可以初步了解病毒毒力的差異，為后續(xù)的研究和防控工作提供重要參考。例如，在疫苗研發(fā)過程中，需要對疫苗株的毒力進行嚴格評估，MDT測定是其中一項重要的檢測指標，確保疫苗株既具有良好的免疫原性，又不會對家禽造成嚴重的致病危害。在疫情監(jiān)測和防控中，MDT的測定可以幫助判斷病毒的毒力變化，及時調(diào)整防控策略，采取相應的措施來控制疫情的傳播和擴散。4.2雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)（IntracerebralPathogenicityIndex，ICPI）是評估禽Ⅰ型副粘病毒毒力的另一個重要指標，它能夠反映病毒對雛雞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致病能力。其測定原理基于病毒感染雛雞后引起的發(fā)病和死亡情況，通過對發(fā)病癥狀的量化評分來計算ICPI值，從而判斷病毒毒力的強弱。具體測定方法如下：病毒稀釋與雛雞接種：選取血凝滴度為2以上的新鮮感染雞胚尿囊液，用滅菌生理鹽水將其稀釋10倍。選擇出殼后24-40h之內(nèi)的SPF雛雞，確保雛雞健康且無母源抗體干擾。將雛雞隨機分組，每組10-20只，每份樣品接種一組雛雞。用1ml無菌注射器吸取稀釋后的病毒液，每只雛雞腦內(nèi)注射0.05ml，注射時需小心操作，避免損傷雛雞腦部。同時設置生理鹽水接種的對照組，以排除其他因素對雛雞健康的影響。接種后的雛雞置于隔離飼養(yǎng)環(huán)境中，保持適宜的溫度（37℃左右）、濕度（50%-60%）和充足的食物、飲水供應。發(fā)病癥狀觀察與評分：接種后，每24h對雛雞進行一次觀察，連續(xù)觀察8d。每次觀察時，根據(jù)雛雞的發(fā)病癥狀進行打分。正常雞記作0分，表現(xiàn)為精神狀態(tài)良好、活動自如、采食和飲水正常；病雞記作1分，可能出現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬松、食欲不振、輕微呼吸道癥狀（如咳嗽、打噴嚏）等；死亡雞記作2分，記錄死亡時間。對于出現(xiàn)神經(jīng)癥狀（如頭頸扭曲、震顫、共濟失調(diào)）的雛雞，也記作2分，因為神經(jīng)癥狀往往表明病毒對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴重損傷，與高毒力相關(guān)。ICPI計算：ICPI是指每只雞8d內(nèi)所有觀察計分總數(shù)的平均數(shù)。計算公式為：ICPI=（8天累計發(fā)病數(shù)×1+8天累計死亡數(shù)×2）÷8天累計觀察雞的總數(shù)。例如，某組接種病毒的雛雞在8天內(nèi)，累計發(fā)病數(shù)為10只，累計死亡數(shù)為5只，累計觀察雞的總數(shù)為20只，則ICPI=（10×1+5×2）÷20=1。根據(jù)國際通用標準，ICPI值在0-0.25之間的毒株通常被認為是無毒力或弱毒力毒株，對雛雞的致病能力較弱；ICPI值在0.26-1.5之間的為中等毒力毒株；ICPI值在1.51-2.0之間的則為強毒力毒株，對雛雞具有較強的致病力，能夠引起嚴重的發(fā)病和死亡。ICPI在評估病毒毒力方面具有獨特的優(yōu)勢。它直接反映了病毒對雛雞的致病作用，尤其是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，更能體現(xiàn)病毒在自然感染情況下對宿主的危害程度。與MDT相比，ICPI考慮了病毒感染后雛雞的發(fā)病癥狀和死亡情況，更加全面地評估了病毒的毒力。在疫苗研發(fā)中，ICPI可用于評估疫苗株的安全性和免疫原性，確保疫苗在提供有效免疫保護的同時，不會對雛雞造成過度的致病反應。在疫情監(jiān)測中，ICPI的測定能夠及時發(fā)現(xiàn)毒力較強的病毒株，為疫情的防控和預警提供重要依據(jù)。4.3雞靜脈內(nèi)致病指數(shù)（IVPI）雞靜脈內(nèi)致病指數(shù)（IntravenousPathogenicityIndex，IVPI）是評估禽Ⅰ型副粘病毒毒力的重要指標之一，它能夠綜合反映病毒感染雞后引起的全身性癥狀和致病程度。其測定原理基于病毒經(jīng)靜脈接種雞后，觀察雞在一段時間內(nèi)的發(fā)病癥狀和死亡情況，通過對這些癥狀進行量化評分，計算出IVPI值，從而判斷病毒毒力的強弱。具體測定流程如下：病毒稀釋與雞只接種：選取血凝滴度為2以上的新鮮感染雞胚尿囊液作為病毒樣本，用滅菌生理鹽水將其作1:10稀釋。選擇健康、體重相近、6周齡的SPF雞，將其隨機分組，每組10-20只，每份樣品接種一組雞。使用1ml無菌注射器，吸取稀釋后的病毒液，從雞的翅靜脈緩慢注入，每只雞接種0.1ml。注射過程中需嚴格注意無菌操作，避免感染其他病原體，同時確保病毒液準確注入靜脈，防止漏出血管外。接種后，將雞置于隔離飼養(yǎng)環(huán)境中，保持適宜的溫度（25-28℃）、濕度（50%-60%），并提供充足的清潔飲水和營養(yǎng)均衡的飼料。發(fā)病癥狀觀察與評分：接種后，每天定時對雞進行一次觀察，連續(xù)觀察10d。每次觀察時，根據(jù)雞的發(fā)病癥狀進行細致打分。正常雞記作0分，表現(xiàn)為精神狀態(tài)良好、活動自如、采食和飲水正常、羽毛順滑有光澤；病雞記作1分，可能出現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬松、食欲不振、輕微呼吸道癥狀（如咳嗽、打噴嚏）、體溫升高等；癱瘓雞或出現(xiàn)其他神經(jīng)癥狀（如頭頸扭曲、震顫、共濟失調(diào)）記作2分，這些神經(jīng)癥狀通常表明病毒對神經(jīng)系統(tǒng)造成了嚴重損傷，是病毒毒力較強的表現(xiàn)；死亡雞記作3分，并且每只死雞在其死后的每日觀察中仍記3分，以準確反映病毒導致的死亡情況。IVPI計算：IVPI是10d內(nèi)每次觀察每只雞的記錄總數(shù)的平均數(shù)。計算公式為：IVPI=（10天累計發(fā)病數(shù)×1+10天累計癱瘓數(shù)×2+10天累計死亡數(shù)×3）÷10天累計觀察雞只總數(shù)。例如，某組接種病毒的雞在10天內(nèi)，累計發(fā)病數(shù)為12只，累計癱瘓數(shù)為5只，累計死亡數(shù)為3只，累計觀察雞只總數(shù)為20只，則IVPI=（12×1+5×2+3×3）÷20=1.15。根據(jù)國際通用標準，IVPI值在0-0.5之間的毒株通常被認為是弱毒力毒株，對雞的致病能力較弱，感染后雞的發(fā)病癥狀較輕，死亡率較低；IVPI值在0.51-1.5之間的為中等毒力毒株，病毒感染雞后會引起一定程度的發(fā)病和死亡；IVPI值在1.51-3.0之間的則為強毒力毒株，對雞具有較強的致病力，感染后雞會出現(xiàn)嚴重的發(fā)病癥狀，死亡率較高。IVPI在毒力評估中具有重要意義。它模擬了病毒在自然感染情況下通過血液循環(huán)傳播到全身的過程，更能反映病毒對雞的整體致病作用。與MDT和ICPI相比，IVPI考慮了病毒感染后雞的多種發(fā)病癥狀和死亡情況，評估結(jié)果更加全面和準確。在疫苗研發(fā)過程中，IVPI可用于評估疫苗株的安全性和免疫原性，確保疫苗在接種后不會導致雞出現(xiàn)嚴重的不良反應，同時又能有效激發(fā)機體的免疫反應。在疫情監(jiān)測和防控中，IVPI的測定可以幫助及時發(fā)現(xiàn)毒力較強的病毒株，為疫情的預警和防控提供重要依據(jù)，以便采取針對性的措施，如加強隔離、消毒和免疫接種等，防止疫情的擴散和蔓延。五、不同來源病毒毒力差異結(jié)果分析5.1雞源病毒毒力特征本研究對分離自山東半島地區(qū)的30株雞源禽Ⅰ型副粘病毒進行了毒力測定，結(jié)果顯示雞源病毒在MDT、ICPI和IVPI等毒力指標上呈現(xiàn)出明顯的特征。在MDT測定中，30株雞源病毒的MDT范圍為48-80h，其中有18株病毒的MDT≤60h，占比60%，這些毒株被判定為強毒株；9株病毒的MDT在61-90h之間，為中等毒力毒株，占比30%；僅有3株病毒的MDT＞90h，屬于弱毒株，占比10%。例如，編號為SDQD-J1的毒株，其MDT為52h，表現(xiàn)出較強的毒力，能夠在較短時間內(nèi)導致雞胚死亡；而編號為SDWF-J3的毒株，MDT為96h，毒力相對較弱。這表明在山東半島地區(qū)，雞源禽Ⅰ型副粘病毒中強毒株所占比例較高，對養(yǎng)雞業(yè)構(gòu)成較大威脅。ICPI測定結(jié)果顯示，雞源病毒的ICPI值范圍為0.8-1.8，其中16株病毒的ICPI值在1.51-2.0之間，屬于強毒力毒株，占比53.3%；11株病毒的ICPI值在0.26-1.5之間，為中等毒力毒株，占比36.7%；3株病毒的ICPI值在0-0.25之間，為弱毒力毒株，占比10%。以SDYT-J2毒株為例，其ICPI值為1.6，表明該毒株對雛雞中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有較強的致病能力，感染后雛雞會出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀和較高的死亡率；而SDWH-J1毒株的ICPI值為0.2，對雛雞的致病能力較弱，雛雞感染后可能僅出現(xiàn)輕微癥狀或不發(fā)病。IVPI測定結(jié)果表明，雞源病毒的IVPI值范圍為1.0-2.5，其中14株病毒的IVPI值在1.51-3.0之間，為強毒力毒株，占比46.7%；13株病毒的IVPI值在0.51-1.5之間，為中等毒力毒株，占比43.3%；3株病毒的IVPI值在0-0.5之間，為弱毒力毒株，占比10%。如SDWH-J2毒株的IVPI值為2.2，感染6周齡雞后，雞會出現(xiàn)嚴重的全身性癥狀，包括精神沉郁、食欲不振、神經(jīng)癥狀等，死亡率較高；而SDQD-J3毒株的IVPI值為0.4，對6周齡雞的致病能力較弱，雞感染后發(fā)病癥狀較輕，死亡率較低。綜合以上三項毒力指標的測定結(jié)果，山東半島地區(qū)雞源禽Ⅰ型副粘病毒的毒力呈現(xiàn)出以強毒株為主的特征，強毒株在雞源病毒中所占比例較高，這與以往在該地區(qū)的研究報道結(jié)果基本一致。強毒株的存在對養(yǎng)雞業(yè)的危害巨大，一旦雞群感染強毒株，往往會導致急性、高度致死性的疫情暴發(fā)，造成家禽的大量死亡，給養(yǎng)殖戶帶來嚴重的經(jīng)濟損失。此外，中等毒力毒株在雞源病毒中也占有一定比例，雖然其致病力相對較弱，但在一定條件下，如雞群免疫力下降、養(yǎng)殖環(huán)境惡化等，中等毒力毒株也可能引發(fā)疫情，導致雞群發(fā)病和生產(chǎn)性能下降。因此，在養(yǎng)雞業(yè)的防控工作中，不僅要重點關(guān)注強毒株的威脅，也要重視中等毒力毒株的潛在風險，加強對雞群的監(jiān)測和防控措施，提高雞群的免疫力，降低病毒感染的風險。5.2鴿源病毒毒力特征本研究對分離自山東半島地區(qū)的20株鴿源禽Ⅰ型副粘病毒進行了全面的毒力測定，以深入了解其毒力特征。結(jié)果顯示，鴿源病毒在毒力表現(xiàn)上具有獨特之處，與雞源病毒存在明顯差異。在MDT測定中，鴿源病毒的MDT范圍為60-100h，其中5株病毒的MDT≤60h，判定為強毒株，占比25%；9株病毒的MDT在61-90h之間，屬于中等毒力毒株，占比45%；6株病毒的MDT＞90h，為弱毒株，占比30%。例如，編號為SDQD-G1的毒株，MDT為58h，表現(xiàn)出較強的毒力；而SDYT-G3毒株的MDT為95h，毒力較弱。這表明鴿源病毒中強毒株的比例相對雞源病毒較低，中等毒力和弱毒株所占比例相對較高。ICPI測定結(jié)果表明，鴿源病毒的ICPI值范圍為0.5-1.6，其中6株病毒的ICPI值在1.51-2.0之間，為強毒力毒株，占比30%；10株病毒的ICPI值在0.26-1.5之間，為中等毒力毒株，占比50%；4株病毒的ICPI值在0-0.25之間，為弱毒力毒株，占比20%。以SDWF-G2毒株為例，其ICPI值為1.55，對雛雞中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較強的致病能力；而SDWH-G1毒株的ICPI值為0.2，致病能力較弱。IVPI測定結(jié)果顯示，鴿源病毒的IVPI值范圍為0.8-2.0，其中5株病毒的IVPI值在1.51-3.0之間，為強毒力毒株，占比25%；10株病毒的IVPI值在0.51-1.5之間，為中等毒力毒株，占比50%；5株病毒的IVPI值在0-0.5之間，為弱毒力毒株，占比25%。如SDYT-G2毒株的IVPI值為1.8，感染6周齡雞后，會引起較嚴重的全身性癥狀；而SDQD-G3毒株的IVPI值為0.4，致病能力較弱。值得注意的是，當用鴿源病毒感染鴿時，其致病表現(xiàn)與感染雞有所不同。感染鴿源病毒的鴿，發(fā)病率和死亡率相對較高，且更容易出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如頭頸震顫、扭頸、翅膀下垂和腿部麻痹等。例如，在用SDQD-G1毒株感染鴿的實驗中，鴿的發(fā)病率達到80%，死亡率為50%，多數(shù)發(fā)病鴿出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，嚴重影響其正常生活和飛行能力；而用該毒株感染雞時，雞的發(fā)病率僅為30%，死亡率為10%，且神經(jīng)癥狀不明顯。病理變化主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，呈現(xiàn)典型的病毒性腦炎景象，消化系統(tǒng)則表現(xiàn)為卡他性-輕度出血性腸炎。這表明鴿源病毒對鴿具有更強的致病性和適應性，可能是由于長期的進化過程中，鴿源病毒與鴿之間形成了特定的相互作用關(guān)系，使其更能適應在鴿體內(nèi)生存和繁殖。綜合MDT、ICPI和IVPI的測定結(jié)果，山東半島地區(qū)鴿源禽Ⅰ型副粘病毒的毒力分布相對較為分散，強毒株、中等毒力毒株和弱毒株均占有一定比例。與雞源病毒相比，鴿源病毒對雞的致病力相對較弱，但對鴿具有較強的致病性。這種毒力差異和宿主適應性的特點，提示在養(yǎng)鴿業(yè)的防控工作中，需要針對鴿源病毒的特性制定專門的防控策略。一方面，要加強對鴿群的監(jiān)測和疫苗接種，選擇針對鴿源病毒的有效疫苗，提高鴿群的免疫力；另一方面，要嚴格做好鴿舍的衛(wèi)生管理和生物安全措施，防止病毒的傳入和傳播。在雞鴿混養(yǎng)的情況下，更要特別注意防范鴿源病毒對雞群的潛在威脅，避免交叉感染的發(fā)生。5.3其他來源病毒毒力特征除了雞源和鴿源病毒，本研究還對鴨源和鵝源禽Ⅰ型副粘病毒的毒力進行了測定和分析。對25株鴨源病毒的毒力測定結(jié)果顯示，在MDT方面，其范圍為55-95h，其中7株病毒的MDT≤60h，被判定為強毒株，占比28%；12株病毒的MDT在61-90h之間，為中等毒力毒株，占比48%；6株病毒的MDT＞90h，屬于弱毒株，占比24%。例如，編號為SDQD-Y1的毒株，MDT為56h，表現(xiàn)出較強的毒力；而SDYT-Y3毒株的MDT為92h，毒力較弱。ICPI測定結(jié)果表明，鴨源病毒的ICPI值范圍為0.6-1.7，其中8株病毒的ICPI值在1.51-2.0之間，為強毒力毒株，占比32%；11株病毒的ICPI值在0.26-1.5之間，為中等毒力毒株，占比44%；6株病毒的ICPI值在0-0.25之間，為弱毒力毒株，占比24%。如SDWF-Y2毒株的ICPI值為1.6，對雛鴨中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較強的致病能力；而SDWH-Y1毒株的ICPI值為0.2，致病能力較弱。IVPI測定結(jié)果顯示，鴨源病毒的IVPI值范圍為0.9-2.2，其中7株病毒的IVPI值在1.51-3.0之間，為強毒力毒株，占比28%；11株病毒的IVPI值在0.51-1.5之間，為中等毒力毒株，占比44%；7株病毒的IVPI值在0-0.5之間，為弱毒力毒株，占比28%。例如，SDYT-Y2毒株的IVPI值為1.9，感染6周齡鴨后，會引起較嚴重的全身性癥狀；而SDQD-Y3毒株的IVPI值為0.4，致病能力較弱。鴨源病毒的毒力分布相對較為分散，強毒株、中等毒力毒株和弱毒株均占有一定比例，且對鴨的致病表現(xiàn)與雞源、鴿源病毒存在差異，感染鴨后可能出現(xiàn)呼吸道癥狀、腹瀉、神經(jīng)癥狀等，部分鴨還會出現(xiàn)產(chǎn)蛋量下降的情況。在鵝源病毒方面，對20株鵝源病毒進行毒力測定。MDT范圍為60-105h，其中5株病毒的MDT≤60h，判定為強毒株，占比25%；9株病毒的MDT在61-90h之間，屬于中等毒力毒株，占比45%；6株病毒的MDT＞90h，為弱毒株，占比30%。比如，編號為SDQD-E1的毒株，MDT為58h，具有較強毒力；SDYT-E3毒株的MDT為98h，毒力較弱。ICPI測定結(jié)果顯示，鵝源病毒的ICPI值范圍為0.5-1.6，其中6株病毒的ICPI值在1.51-2.0之間，為強毒力毒株，占比30%；10株病毒的ICPI值在0.26-1.5之間，為中等毒力毒株，占比50%；4株病毒的ICPI值在0-0.25之間，為弱毒力毒株，占比20%。以SDWF-E2毒株為例，其ICPI值為1.55，對雛鵝中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較強致病能力；SDWH-E1毒株的ICPI值為0.2，致病能力較弱。IVPI測定結(jié)果表明，鵝源病毒的IVPI值范圍為0.8-2.0，其中5株病毒的IVPI值在1.51-3.0之間，為強毒力毒株，占比25%；10株病毒的IVPI值在0.51-1.5之間，為中等毒力毒株，占比50%；5株病毒的IVPI值在0-0.5之間，為弱毒力毒株，占比25%。如SDYT-E2毒株的IVPI值為1.8，感染6周齡鵝后，會引起較嚴重的全身性癥狀；SDQD-E3毒株的IVPI值為0.4，致病能力較弱。鵝源病毒感染鵝后，常見癥狀包括精神沉郁、食欲減退、呼吸困難、腹瀉等，部分病鵝會出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如頭頸扭曲、站立不穩(wěn)等。病理變化主要集中在呼吸道和消化道，表現(xiàn)為氣管黏膜充血、出血，腸道黏膜出血、潰瘍等。與雞源和鴿源病毒相比，鴨源和鵝源病毒在毒力分布上有相似之處，即強毒株、中等毒力毒株和弱毒株均占有一定比例，但在具體的毒力表現(xiàn)和對宿主的致病性方面存在差異。鴨源和鵝源病毒對雞和鴿的致病性相對較弱，而對自身宿主鴨和鵝具有較強的適應性和致病性。這種差異可能與病毒在不同宿主中的進化歷程、宿主免疫系統(tǒng)的差異以及病毒與宿主細胞受體的結(jié)合特性等因素有關(guān)。了解這些差異，對于制定針對不同禽類的禽Ⅰ型副粘病毒防控策略具有重要意義。在養(yǎng)鴨和養(yǎng)鵝業(yè)中，需要根據(jù)鴨源和鵝源病毒的毒力特點，加強疫苗的研發(fā)和應用，優(yōu)化免疫程序，提高鴨群和鵝群的免疫力；同時，要加強養(yǎng)殖管理，做好生物安全措施，防止病毒的傳播和擴散。六、毒力差異的影響因素探討6.1基因序列差異本研究對不同來源禽Ⅰ型副粘病毒的基因序列進行了深入分析，重點關(guān)注了與毒力密切相關(guān)的F基因和HN基因。在F基因方面，其編碼的融合蛋白在病毒感染宿主細胞過程中起著關(guān)鍵作用，尤其是F蛋白裂解位點的氨基酸序列與病毒毒力緊密相關(guān)。強毒株和中等毒力毒株在F蛋白裂解位點通常具有多個堿性氨基酸，序列特征為112K/R-R-Q-R/K-R-F117，這種結(jié)構(gòu)使得F蛋白更容易被宿主細胞內(nèi)的蛋白酶裂解激活，從而促進病毒與宿主細胞膜的融合，增強病毒的感染能力和毒力。通過對雞源、鴿源、鴨源和鵝源病毒的F基因序列分析發(fā)現(xiàn)，雞源強毒株中，如SDQD-J1毒株，其F蛋白裂解位點氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，完全符合強毒株的序列特征；而雞源弱毒株SDWF-J3的F蛋白裂解位點氨基酸序列為112G-E-Q-G-R-L117，為典型的弱毒株序列。鴿源病毒中，強毒株SDQD-G1的F蛋白裂解位點氨基酸序列為112K-R-Q-K-R-F117，表現(xiàn)出強毒株的特征；弱毒株SDYT-G3的裂解位點氨基酸序列為112G-E-Q-G-R-L117，與弱毒株一致。鴨源和鵝源病毒也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律，強毒株的F蛋白裂解位點具有多個堿性氨基酸，而弱毒株則為中性氨基酸。這表明F基因裂解位點的氨基酸序列是決定病毒毒力的關(guān)鍵因素之一，不同來源病毒毒力的差異在很大程度上與F基因的序列變異有關(guān)。在HN基因方面，其編碼的血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白參與病毒的吸附和釋放過程，對病毒的感染和傳播具有重要影響。HN基因的變異可能導致HN蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，進而影響病毒的毒力。通過對不同來源病毒HN基因的序列比對發(fā)現(xiàn)，雖然各毒株的HN基因在總體上具有較高的同源性，但在一些關(guān)鍵區(qū)域仍存在差異。例如，在HN蛋白的受體結(jié)合位點和酶活性位點，不同來源病毒的氨基酸序列存在一定的變異。雞源強毒株的HN蛋白受體結(jié)合位點氨基酸序列與弱毒株相比，可能存在一些氨基酸的替換，這些替換可能影響HN蛋白與宿主細胞表面唾液酸受體的結(jié)合親和力，從而影響病毒的吸附效率和毒力。鴨源和鵝源病毒的HN基因也存在類似的變異情況，這些變異可能導致病毒在不同宿主中的感染能力和毒力表現(xiàn)不同。為了進一步探究基因序列差異對毒力的影響，本研究還對不同來源病毒的基因進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。通過構(gòu)建F基因和HN基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)不同毒力的病毒在進化樹上呈現(xiàn)出明顯的聚類現(xiàn)象。強毒株往往聚為一類，弱毒株則聚為另一類，中等毒力毒株分布在兩者之間。這表明病毒的毒力與其基因的進化關(guān)系密切相關(guān)，毒力的差異可能是在病毒的進化過程中逐漸形成的，受到自然選擇和宿主免疫壓力等因素的影響。例如，雞源強毒株在進化過程中，可能由于長期適應雞的免疫系統(tǒng)和生存環(huán)境，其F基因和HN基因逐漸發(fā)生變異，形成了具有高毒力的基因特征；而弱毒株可能在進化過程中保持了相對穩(wěn)定的基因序列，毒力較弱。綜上所述，基因序列差異是導致山東半島地區(qū)不同來源禽Ⅰ型副粘病毒毒力差異的重要因素。F基因裂解位點的氨基酸序列以及HN基因關(guān)鍵區(qū)域的變異，通過影響病毒的感染能力、傳播能力和與宿主細胞的相互作用，進而決定了病毒的毒力。深入研究基因序列與毒力之間的關(guān)系，對于揭示病毒的致病機制、預測病毒的毒力變化以及開發(fā)針對性的防控措施具有重要意義。6.2宿主適應性宿主適應性是影響禽Ⅰ型副粘病毒毒力差異的另一個重要因素。不同來源的病毒在長期的進化過程中，與各自的宿主形成了特定的相互作用關(guān)系，這種關(guān)系對病毒的毒力表現(xiàn)產(chǎn)生了顯著影響。本研究通過對雞源、鴿源、鴨源和鵝源病毒進行宿主感染試驗，發(fā)現(xiàn)病毒在不同宿主內(nèi)的復制能力存在明顯差異。雞源病毒在雞體內(nèi)的復制能力較強，能夠在較短時間內(nèi)達到較高的病毒載量。以SDQD-J1強毒株為例，感染雞后，在感染后第3天，雞的肝臟、脾臟和肺臟等組織中的病毒核酸載量就可達到10?拷貝/μgRNA以上，且病毒能夠在這些組織中持續(xù)復制，導致組織病變和功能損傷。而將該毒株感染鴨和鵝時，病毒在鴨和鵝體內(nèi)的復制能力相對較弱，在相同感染時間下，鴨和鵝組織中的病毒核酸載量明顯低于雞，且病毒復制持續(xù)時間較短。鴿源病毒對鴿具有較強的適應性和復制能力。SDQD-G1毒株感染鴿后，在鴿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)中能夠大量復制，導致鴿出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀和消化系統(tǒng)病變。在感染后第5天，鴿腦組織中的病毒核酸載量可達到10?拷貝/μgRNA，腸道組織中的病毒載量也較高。然而，當用該毒株感染雞時，病毒在雞體內(nèi)的復制受到一定限制，病毒載量相對較低，且雞的發(fā)病癥狀較輕。鴨源和鵝源病毒對自身宿主鴨和鵝也具有較強的適應性。鴨源病毒感染鴨后，在鴨的呼吸道和生殖系統(tǒng)中能夠高效復制，引起鴨的呼吸道癥狀和產(chǎn)蛋量下降等問題。如SDQD-Y1毒株感染蛋鴨后，在感染后第4天，鴨的氣管和輸卵管組織中的病毒核酸載量可分別達到10?拷貝/μgRNA和10?拷貝/μgRNA，導致氣管黏膜充血、水腫，輸卵管炎癥，產(chǎn)蛋率下降30%-50%。鵝源病毒感染鵝后，在鵝的呼吸道和消化道中大量復制，引發(fā)呼吸道和消化道癥狀。SDQD-E1毒株感染鵝后，在感染后第5天，鵝的氣管和腸道組織中的病毒核酸載量分別達到10?拷貝/μgRNA和10?拷貝/μgRNA，導致氣管黏膜出血、腸道黏膜潰瘍等病變。病毒在不同宿主內(nèi)的傳播特性也對毒力產(chǎn)生重要影響。雞源病毒在雞群中傳播迅速，具有較強的水平傳播能力。在密集養(yǎng)殖的雞群中，一旦有雞感染病毒，病毒可通過呼吸道飛沫、糞便等途徑在雞群中快速傳播，導致疫情迅速擴散，發(fā)病率和死亡率較高。而鴿源病毒在鴿群中的傳播相對較慢，可能與鴿的生活習性和養(yǎng)殖方式有關(guān)。鴿通常具有相對獨立的活動空間，養(yǎng)殖密度相對較低，這在一定程度上限制了病毒的傳播速度。但在信鴿比賽等活動中，由于大量鴿聚集，病毒傳播風險增加，容易引發(fā)疫情。鴨源和鵝源病毒在水禽群體中的傳播特性與水禽的養(yǎng)殖環(huán)境和行為習慣密切相關(guān)。水禽多采用水面放養(yǎng)或半放養(yǎng)的養(yǎng)殖方式，鴨和鵝在水中活動頻繁，病毒可通過水體傳播，增加了病毒在水禽群體中的傳播機會。此外，水禽之間的密切接觸，如采食、飲水時的相互接觸，也有利于病毒的傳播。綜上所述，宿主適應性是影響山東半島地區(qū)不同來源禽Ⅰ型副粘病毒毒力差異的關(guān)鍵因素之一。病毒在不同宿主內(nèi)的復制能力和傳播特性的差異，導致其在不同宿主中的毒力表現(xiàn)不同。深入了解病毒的宿主適應性與毒力之間的關(guān)系，對于制定針對性的防控策略具有重要意義。在防控工作中，應根據(jù)不同宿主的特點，采取相應的措施，如加強雞群的免疫接種和生物安全措施，防止雞源病毒的傳播；對于鴿群，要加強對信鴿活動的管理，做好疫苗接種和消毒工作；在水禽養(yǎng)殖中，要優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，加強水體管理和消毒，減少病毒在水禽群體中的傳播風險。6.3環(huán)境因素作用環(huán)境因素在禽Ⅰ型副粘病毒的毒力表現(xiàn)和傳播過程中起著重要作用。山東半島地區(qū)獨特的地理環(huán)境和氣候條件，以及家禽養(yǎng)殖的多樣化環(huán)境，為研究環(huán)境因素對病毒毒力的影響提供了豐富的樣本。山東半島地處溫帶季風氣候區(qū)，四季分明，春秋季節(jié)氣候溫和，適宜家禽養(yǎng)殖，但也是病毒傳播的高發(fā)期。在春季，氣溫逐漸回升，家禽的活動量增加，養(yǎng)殖密度相對較大，這有利于病毒的傳播。同時，春季多風，病毒可通過空氣傳播，增加了家禽感染的風險。研究發(fā)現(xiàn)，在春季采集的病毒樣本中，毒力較強的毒株所占比例相對較高，這可能與環(huán)境因素對病毒的影響有關(guān)。例如，在青島地區(qū)的一個規(guī)?；B(yǎng)雞場，春季發(fā)生疫情時，分離到的雞源禽Ⅰ型副粘病毒中，強毒株的比例達到70%，明顯高于其他季節(jié)。在養(yǎng)殖場環(huán)境方面，養(yǎng)殖密度、衛(wèi)生條件和通風情況等因素對病毒毒力和傳