山東地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的深度解析：分離鑒定、ORF2基因克隆與表達(dá)研究一、引言1.1研究背景與意義豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2），作為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，是一種共價(jià)閉合、單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，其病毒粒子呈二十面體對(duì)稱且無囊膜，直徑僅約17nm，基因組大小約1.7kb，是目前已知最小的動(dòng)物病毒之一。PCV2主要感染豬，可導(dǎo)致豬圓環(huán)病毒病（Porcinecircovirusdesease，PCVD）。PCVD是一種多系統(tǒng)功能障礙性疾病，感染豬群常表現(xiàn)出多系統(tǒng)衰竭、呼吸道癥狀、繁殖障礙、皮炎與腎病綜合征等多種臨床癥狀，嚴(yán)重影響豬只的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖性能和免疫力，導(dǎo)致豬只生長(zhǎng)緩慢、死亡率增加，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在全球范圍內(nèi)，PCV2的感染極為普遍，幾乎100%的商品化養(yǎng)豬場(chǎng)都存在PCV2感染的情況。自1991年在加拿大首次發(fā)現(xiàn)PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS）的病原后，隨后在世界各養(yǎng)豬國(guó)家均有豬只感染PCV2的報(bào)道，并呈現(xiàn)廣泛流行趨勢(shì)。在我國(guó)，PCV2的感染也十分廣泛，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。研究表明，PCV2感染可以破壞動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)，造成嚴(yán)重的免疫抑制，使得豬只對(duì)其他病原體的易感性增高，容易誘發(fā)多種細(xì)菌及病毒的混合感染與繼發(fā)感染，如豬藍(lán)耳病病毒、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌等，進(jìn)一步加重了病情和經(jīng)濟(jì)損失，也給疾病的診斷和治療帶來了巨大的困難。山東省作為我國(guó)的養(yǎng)豬大省，生豬養(yǎng)殖規(guī)模龐大，養(yǎng)豬業(yè)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位。然而，近年來山東地區(qū)豬場(chǎng)中PCV2的感染情況較為嚴(yán)重。據(jù)相關(guān)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山東省豬群中豬圓環(huán)病毒2型的發(fā)病率較高，許多豬群陽性率高達(dá)70%以上，目前還沒有發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒2型抗體陰性的豬場(chǎng)。PCV2的感染給山東養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。不同地區(qū)的PCV2毒株在基因序列和生物學(xué)特性上可能存在差異，山東株的PCV2可能具有其獨(dú)特的遺傳特征和致病性。對(duì)豬圓環(huán)病毒2型山東株進(jìn)行分離鑒定，能夠明確該地區(qū)PCV2的流行毒株類型和特性，為山東地區(qū)豬圓環(huán)病毒病的防控提供準(zhǔn)確的病原學(xué)依據(jù)。通過研究山東株P(guān)CV2的分子特征，可以深入了解其遺傳演化規(guī)律和變異趨勢(shì)，有助于預(yù)測(cè)病毒的流行趨勢(shì)，為制定科學(xué)有效的防控策略提供理論支持。ORF2基因是PCV2的重要基因之一，其編碼的Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，是PCV2的主要免疫保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，在PCV2的診斷、疫苗研發(fā)和免疫機(jī)制研究等方面具有重要作用?？寺CV2山東株的ORF2基因，并進(jìn)行表達(dá)和研究，不僅可以為建立基于ORF2基因的PCV2診斷方法提供基礎(chǔ)，有助于快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)PCV2感染，還能為研發(fā)針對(duì)山東地區(qū)PCV2流行毒株的新型疫苗奠定基礎(chǔ)，提高疫苗的免疫效果，有效預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒病的發(fā)生和傳播。此外，對(duì)ORF2基因表達(dá)產(chǎn)物的研究，有助于深入了解PCV2的免疫機(jī)制，為豬圓環(huán)病毒病的防控提供新的思路和方法。綜上所述，開展豬圓環(huán)病毒2型山東株的分離鑒定及其ORF2基因的克隆與表達(dá)研究，對(duì)于了解山東地區(qū)PCV2的流行特點(diǎn)和分子特征，防控豬圓環(huán)病毒病在山東地區(qū)的傳播與流行，以及推動(dòng)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀自1974年德國(guó)學(xué)者Tischer首次從PK-15細(xì)胞系中分離到豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV）后，科研人員對(duì)PCV的研究不斷深入。起初發(fā)現(xiàn)的PCV為無致病性的PCV1，1991年在加拿大首次發(fā)現(xiàn)PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的病原，隨后PCV2在世界各養(yǎng)豬國(guó)家均被報(bào)道，呈現(xiàn)廣泛流行趨勢(shì)。在PCV2的分離鑒定方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了大量工作。國(guó)外早在20世紀(jì)90年代就開始對(duì)PCV2進(jìn)行分離與鑒定研究，明確了PCV2的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和基本生物學(xué)特性。國(guó)內(nèi)對(duì)PCV2的分離鑒定研究起步稍晚，但發(fā)展迅速。2000年以后，國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)相繼開展了PCV2的分離鑒定工作，從臨床發(fā)病豬群中成功分離出多株P(guān)CV2。通過對(duì)分離毒株的研究，了解到我國(guó)PCV2的流行毒株類型多樣，主要包括PCV2a、PCV2b和PCV2d等亞型。不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)流行亞型存在差異，且隨著時(shí)間推移，PCV2的流行毒株也在發(fā)生變化。例如，早期PCV2a亞型較為常見，近年來PCV2b和PCV2d亞型的流行趨勢(shì)逐漸增加。關(guān)于PCV2基因克隆與表達(dá)的研究，國(guó)外在20世紀(jì)末就已開展，成功克隆了PCV2的多個(gè)基因，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了功能研究。其中，ORF2基因編碼的Cap蛋白作為主要免疫保護(hù)性抗原，是研究的重點(diǎn)。通過基因工程技術(shù)，將ORF2基因在不同表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，為PCV2診斷方法的建立和疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)在這方面的研究也取得了顯著成果，眾多科研團(tuán)隊(duì)對(duì)PCV2不同毒株的ORF2基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，分析了其遺傳變異特征，同時(shí)探索了提高Cap蛋白表達(dá)量和免疫原性的方法。在山東地區(qū)，雖然對(duì)PCV2的研究有一定的報(bào)道，但仍存在不足與空白。目前關(guān)于山東株P(guān)CV2的分離鑒定研究相對(duì)較少，對(duì)其病毒特性、流行規(guī)律和遺傳演化的了解還不夠全面和深入。在ORF2基因的克隆與表達(dá)方面，針對(duì)山東株P(guān)CV2的研究也不夠系統(tǒng)，尚未充分挖掘山東株P(guān)CV2的ORF2基因在診斷和疫苗研發(fā)中的應(yīng)用潛力。因此，開展豬圓環(huán)病毒2型山東株的分離鑒定及其ORF2基因的克隆與表達(dá)研究，對(duì)于填補(bǔ)山東地區(qū)在這方面的研究空白，完善我國(guó)PCV2的研究體系具有重要意義。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在從山東地區(qū)臨床發(fā)病豬的樣本中成功分離鑒定豬圓環(huán)病毒2型（PCV2），獲得具有代表性的山東株P(guān)CV2毒株。通過對(duì)分離毒株的生物學(xué)特性和基因序列進(jìn)行分析，明確山東地區(qū)PCV2的流行特點(diǎn)和遺傳演化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，克隆PCV2山東株的ORF2基因，并實(shí)現(xiàn)其在合適表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的特性和免疫原性進(jìn)行深入研究，為建立基于ORF2基因的PCV2診斷方法和研發(fā)新型疫苗奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，為山東地區(qū)豬圓環(huán)病毒病的防控提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。1.3.2研究?jī)?nèi)容PCV2山東株的分離與鑒定：從山東地區(qū)多個(gè)豬場(chǎng)采集疑似感染PCV2的臨床發(fā)病豬的樣本，包括血清、組織等。采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將處理后的樣本接種到對(duì)PCV2敏感的細(xì)胞系（如PK-15細(xì)胞）中進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，通過盲傳多代以獲得純凈的病毒毒株。利用PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)PCV2特異性引物，對(duì)分離培養(yǎng)的病毒進(jìn)行核酸檢測(cè)，確定其是否為PCV2。通過測(cè)序分析，明確分離毒株的基因序列，并與GenBank中已有的PCV2毒株序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定山東株P(guān)CV2的基因亞型和遺傳進(jìn)化地位，分析其與其他地區(qū)毒株的親緣關(guān)系。PCV2山東株ORF2基因的克隆：根據(jù)已獲得的PCV2山東株全基因組序列，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增ORF2基因片段。提取PCV2山東株的病毒DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得ORF2基因。將擴(kuò)增得到的ORF2基因片段與合適的克隆載體（如pMD18-T載體）進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，篩選出陽性克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證ORF2基因序列的準(zhǔn)確性，分析其與其他PCV2毒株ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列差異，研究其遺傳變異特征。PCV2山東株ORF2基因的表達(dá)及產(chǎn)物分析：選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)），將克隆得到的ORF2基因與相應(yīng)的表達(dá)載體進(jìn)行重組，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主細(xì)胞中，通過誘導(dǎo)表達(dá)，獲得ORF2基因的表達(dá)產(chǎn)物。利用SDS和Westernblot等技術(shù)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，確定其分子量大小和表達(dá)量，檢測(cè)其抗原性和特異性。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性進(jìn)行研究，將表達(dá)產(chǎn)物免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如小鼠），檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中特異性抗體的產(chǎn)生情況，分析抗體效價(jià)和免疫保護(hù)效果，為PCV2疫苗的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、豬圓環(huán)病毒2型概述2.1PCV2的生物學(xué)特性PCV2的病毒粒子極其微小，直徑約為17nm，呈正二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無囊膜包裹。其基因組為共價(jià)閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA，大小約1.7kb，相對(duì)分子質(zhì)量約為5.8×105u。在病毒的基因組中，包含多個(gè)開放閱讀框（ORF），這些ORF編碼著病毒復(fù)制、結(jié)構(gòu)蛋白合成等過程中所必需的多種蛋白質(zhì)。其中，ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep和Rep'蛋白，它們?cè)诓《镜纳芷谥邪l(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與病毒基因組的復(fù)制起始、延伸等過程，確保病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)高效地進(jìn)行自我復(fù)制。ORF2則編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap，該蛋白是構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分，不僅決定了病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，還在病毒感染宿主細(xì)胞以及誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要作用，是病毒的主要免疫保護(hù)性抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針對(duì)PCV2的抗體和免疫細(xì)胞，從而對(duì)病毒感染起到防御和清除作用。除了ORF1和ORF2外，PCV2基因組還包含其他一些開放閱讀框，它們編碼的蛋白質(zhì)雖然功能尚未完全明確，但推測(cè)在病毒的感染、致病以及與宿主細(xì)胞的相互作用等過程中也具有不可或缺的作用。PCV2對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，這使得其在自然環(huán)境中能夠存活較長(zhǎng)時(shí)間，增加了傳播和感染的風(fēng)險(xiǎn)。它可以在72℃的高溫下存活15-30分鐘，在56℃條件下無法被滅活，并且能夠抵抗pH3.0的酸性環(huán)境。由于PCV2無囊膜結(jié)構(gòu)，對(duì)氯仿、碘酒、酒精等有機(jī)溶劑不敏感，但對(duì)苯酚、季胺類化合物、氫氧化鈉和氧化劑等較為敏感，這些消毒劑能夠破壞病毒的結(jié)構(gòu)或干擾其生物學(xué)活性，從而達(dá)到殺滅病毒的目的。在培養(yǎng)特性方面，PCV2可以在多種細(xì)胞系中進(jìn)行培養(yǎng)，其中PK-15細(xì)胞是最常用的宿主細(xì)胞。PCV2在PK-15細(xì)胞中能夠進(jìn)行有效的復(fù)制，但病毒感染細(xì)胞后通常不引起明顯的細(xì)胞病變（CPE），這給病毒的分離和鑒定帶來了一定的困難。為了提高病毒的分離率和檢測(cè)靈敏度，通常需要采用盲傳的方法，將接種了病毒的細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)，以增加病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖數(shù)量和感染效率。在病毒培養(yǎng)過程中，還可以通過添加一些特定的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件，促進(jìn)PCV2在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)和繁殖。此外，也有研究嘗試使用其他細(xì)胞系來培養(yǎng)PCV2，如Vero細(xì)胞等，以探索更適合病毒生長(zhǎng)和研究的細(xì)胞模型。2.2PCV2的致病機(jī)制與流行病學(xué)PCV2的致病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)方面。病毒首先通過呼吸道、口腔等途徑侵入豬體，主要在扁桃體、肺、脾和淋巴結(jié)等免疫器官內(nèi)大量繁殖，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。PCV2具有免疫抑制特性，這是其致病的關(guān)鍵因素之一。它能夠侵害豬的免疫系統(tǒng)，損傷淋巴細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，抑制其增殖和分化，降低免疫細(xì)胞的活性和功能，導(dǎo)致機(jī)體的免疫應(yīng)答能力下降。PCV2還可以干擾細(xì)胞因子的正常表達(dá)和分泌，破壞免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，使得機(jī)體難以有效抵御其他病原體的入侵。例如，PCV2感染后，豬體內(nèi)的干擾素γ等細(xì)胞因子的分泌量會(huì)顯著減少，影響機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)。此外，PCV2感染還可能導(dǎo)致豬體的胸腺、脾臟等免疫器官發(fā)生萎縮，進(jìn)一步削弱機(jī)體的免疫功能。在組織損傷方面，PCV2感染可引發(fā)多種組織器官的病變。病毒在淋巴結(jié)內(nèi)大量復(fù)制，會(huì)導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大、發(fā)炎，出現(xiàn)肉芽腫性病變，影響淋巴結(jié)的正常免疫過濾和免疫應(yīng)答功能。在肺臟，PCV2感染可引起間質(zhì)性肺炎，導(dǎo)致肺泡間隔增寬、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，影響氣體交換，使豬出現(xiàn)呼吸困難等癥狀。在腎臟，可引發(fā)豬皮炎腎病綜合征（Porcinedermatitisandnephropathysyndrome，PDNS），表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)紅斑、丘疹、壞死等病變，同時(shí)腎臟出現(xiàn)腎小球腎炎、腎小管壞死等病理變化。PCV2還可能對(duì)心臟、肝臟等其他器官造成損害，引發(fā)心肌炎、肝炎等，導(dǎo)致器官功能障礙，嚴(yán)重影響豬只的健康和生長(zhǎng)發(fā)育。PCV2在全球范圍內(nèi)廣泛流行，幾乎所有養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)都有該病毒的存在。不同地區(qū)的PCV2感染率和檢出率存在較大差異，但總體處于較高水平。在美國(guó)，一項(xiàng)調(diào)查顯示PCV2的陽性率達(dá)23%。在韓國(guó)，針對(duì)農(nóng)場(chǎng)豬群的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCV2陽性率為53.8%，且PCV2a、PCV2b、PCV2d3個(gè)基因型之間混合感染情況嚴(yán)重。在我國(guó)，豬群中PCV2的感染也極為普遍，血清學(xué)陽性率較高。有研究通過回顧性調(diào)查PCV2在中國(guó)的流行情況，發(fā)現(xiàn)豬PCV2感染率為46.0%，PCV2在規(guī)?；i場(chǎng)中的感染率為50.1%，在散養(yǎng)戶的感染率為37.5%。通過對(duì)2015-2018年期間國(guó)內(nèi)的472份豬樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PCV2感染率為50.0%，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d三個(gè)基因型分別占總分離株的13.6%、25.8%和60.6%。2021-2022年對(duì)全國(guó)部分地區(qū)1000多份臨床樣品的調(diào)查顯示，全國(guó)25個(gè)省份總體陽性率為37.15%，其中PCV2a、PCV2b、PCV2d3種亞型混合感染尤為嚴(yán)重，PCV2d為主要的流行毒株。在山東省，作為養(yǎng)豬大省，PCV2的感染情況較為嚴(yán)峻。據(jù)調(diào)查，山東省豬群中豬圓環(huán)病毒2型的發(fā)病率較高，許多豬群陽性率高達(dá)70%以上，目前還未發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒2型抗體陰性的豬場(chǎng)。PCV2在山東地區(qū)的流行呈現(xiàn)出一定的特點(diǎn)，不同豬場(chǎng)之間的感染率存在差異，規(guī)?；i場(chǎng)和散養(yǎng)戶均有感染發(fā)生。從感染豬的年齡來看，各年齡段的豬均易感，但以哺乳期和育成期的仔豬更為常見，5-12周齡的仔豬感染后發(fā)病癥狀往往較為嚴(yán)重。在季節(jié)方面，雖然全年均可發(fā)生感染，但在春秋季節(jié)，由于氣候多變、豬只抵抗力相對(duì)較弱等原因，PCV2的感染率相對(duì)較高。PCV2的傳播途徑多樣，主要包括水平傳播和垂直傳播。水平傳播是PCV2傳播的重要方式，病毒可通過呼吸道傳播，感染豬咳嗽、打噴嚏時(shí)排出的含有病毒的飛沫，可被健康豬吸入而感染?？谇粋鞑ヒ彩浅Ｒ娡緩?，健康豬采食被病毒污染的飼料、飲水，或者接觸感染豬的糞便、尿液、鼻液等排泄物和分泌物，病毒經(jīng)口腔黏膜侵入機(jī)體。此外，PCV2還可以通過精液傳播，感染公豬的精液中含有病毒，在配種過程中可將病毒傳播給母豬。垂直傳播方面，感染PCV2的母豬可通過胎盤將病毒傳播給胎兒，導(dǎo)致胎兒在子宮內(nèi)感染，出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙癥狀，或者產(chǎn)出的仔豬體質(zhì)虛弱，易感染其他疾病。研究還發(fā)現(xiàn)，PCV2可在豬群中持續(xù)傳播，即使在疫苗免疫的情況下，由于病毒的變異和免疫逃逸等原因，仍難以完全杜絕感染的發(fā)生。2.3PCV2的檢測(cè)與防控現(xiàn)狀目前，針對(duì)PCV2的檢測(cè)方法眾多，主要包括血清學(xué)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法，每種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)缺點(diǎn)。血清學(xué)檢測(cè)方法中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）應(yīng)用廣泛。該方法利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，將PCV2的特異性抗原包被在酶標(biāo)板上，加入待檢血清，若血清中含有PCV2抗體，則會(huì)與抗原結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的二抗和底物，通過顯色反應(yīng)來檢測(cè)抗體的存在及含量。ELISA具有操作簡(jiǎn)便、快速、可同時(shí)檢測(cè)大量樣本的優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模的血清學(xué)調(diào)查和抗體監(jiān)測(cè)。然而，ELISA的檢測(cè)結(jié)果易受到非特異性反應(yīng)的干擾，如血清中的雜質(zhì)、交叉反應(yīng)抗體等，可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。而且，ELISA只能檢測(cè)抗體，無法直接檢測(cè)病毒，對(duì)于早期感染或隱性感染的診斷存在一定局限性。免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFA）也是常用的血清學(xué)檢測(cè)方法之一。IFA利用熒光素標(biāo)記的特異性抗體與PCV2抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察，若存在PCV2抗原，則會(huì)發(fā)出熒光。IFA具有較高的特異性和敏感性，能夠直觀地觀察到病毒抗原在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布情況。但是，IFA需要專業(yè)的熒光顯微鏡設(shè)備和技術(shù)人員進(jìn)行操作，檢測(cè)成本較高，檢測(cè)過程相對(duì)復(fù)雜，不利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。分子生物學(xué)檢測(cè)方法中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)是檢測(cè)PCV2的重要手段。PCR技術(shù)通過設(shè)計(jì)PCV2特異性引物，以病毒DNA為模板，在體外擴(kuò)增特定的基因片段，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物來判斷樣本中是否存在PCV2。常規(guī)PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出PCV2的核酸，尤其適用于早期感染和隱性感染的診斷。不過，常規(guī)PCR只能定性檢測(cè)，無法準(zhǔn)確測(cè)定病毒的含量，且操作過程中容易受到污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。為了克服常規(guī)PCR的局限性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。qPCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過程，能夠準(zhǔn)確地定量檢測(cè)樣本中的病毒核酸含量。qPCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)PCV2并評(píng)估病毒載量，對(duì)于疾病的診斷、病情監(jiān)測(cè)和防控具有重要意義。但是，qPCR需要專門的熒光定量PCR儀等設(shè)備，檢測(cè)成本較高，對(duì)操作人員的技術(shù)要求也較高。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種新型的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。LAMP利用4-6條特異性引物，在恒溫條件下（通常為60-65℃），通過BstDNA聚合酶的鏈置換活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的快速擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過肉眼觀察顏色變化或濁度變化來判斷，無需特殊的儀器設(shè)備。LAMP具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。然而，LAMP反應(yīng)條件較為苛刻，引物設(shè)計(jì)難度較大，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。在防控方面，疫苗接種是預(yù)防PCV2感染的關(guān)鍵措施。目前市場(chǎng)上的PCV2疫苗主要有滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗等。滅活疫苗是將PCV2病毒經(jīng)過培養(yǎng)、滅活等工藝制備而成，具有安全性高、免疫原性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但免疫效果相對(duì)較弱，需要多次免疫。亞單位疫苗是通過基因工程技術(shù)表達(dá)PCV2的主要免疫原性蛋白（如Cap蛋白），經(jīng)過純化后制備而成，具有純度高、免疫原性強(qiáng)、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，但生產(chǎn)成本較高?；蚬こ桃呙绨ê怂嵋呙纭⒅亟M活載體疫苗等，具有免疫效果好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但仍處于研究和開發(fā)階段，尚未大規(guī)模應(yīng)用。除了疫苗接種，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理也是防控PCV2的重要環(huán)節(jié)。保持豬舍的清潔衛(wèi)生，定期進(jìn)行消毒，可有效減少病毒在環(huán)境中的存活和傳播。合理控制豬群的飼養(yǎng)密度，避免豬只過于擁擠，減少應(yīng)激因素，有助于提高豬只的免疫力。提供營(yíng)養(yǎng)均衡的飼料，滿足豬只生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)需求，增強(qiáng)豬只的體質(zhì)和抵抗力。做好生物安全措施，如嚴(yán)格限制外來人員和車輛進(jìn)入豬場(chǎng)，對(duì)引進(jìn)的種豬進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫和隔離觀察，防止病毒傳入豬場(chǎng)。盡管采取了多種防控措施，但在山東地區(qū)，PCV2的防控仍面臨諸多問題。疫苗免疫效果參差不齊，部分豬場(chǎng)接種疫苗后仍發(fā)生PCV2感染，可能與疫苗質(zhì)量、免疫程序不合理、豬群健康狀況等因素有關(guān)。一些養(yǎng)殖戶對(duì)疫苗的選擇和使用缺乏科學(xué)認(rèn)識(shí)，盲目跟風(fēng)或選擇價(jià)格低廉的疫苗，導(dǎo)致免疫效果不佳。山東地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理水平差異較大，部分中小規(guī)模豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶的飼養(yǎng)管理較為粗放，生物安全意識(shí)淡薄，消毒、隔離等措施不到位，增加了PCV2的傳播風(fēng)險(xiǎn)。此外，PCV2與其他病原體的混合感染情況較為普遍，如與豬藍(lán)耳病病毒、豬肺炎支原體等混合感染，使得病情更加復(fù)雜，防控難度加大。三、豬圓環(huán)病毒2型山東株的分離鑒定3.1材料與方法3.1.1病料采集從山東省濟(jì)南、青島、濰坊、臨沂、菏澤等多個(gè)地區(qū)的規(guī)?；i場(chǎng)和散養(yǎng)戶中，采集了共計(jì)120份疑似感染豬圓環(huán)病毒2型的臨床發(fā)病豬樣本。這些豬主要表現(xiàn)出消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白、黃疸、腹瀉等典型的豬圓環(huán)病毒病癥狀，涵蓋了仔豬、育肥豬和母豬等不同生長(zhǎng)階段。樣本包括淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、肝臟、腎臟等組織以及血清，每份組織樣本采集量約為2-5g，血清樣本采集量為3-5mL。采集過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，使用無菌器械采集組織樣本，采集后立即放入無菌凍存管中，并標(biāo)記好樣本來源、采集時(shí)間和豬只基本信息。血清樣本采集后，室溫靜置1-2小時(shí)，待血液凝固后，3000r/min離心10分鐘，分離出血清，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。所有樣本采集后迅速放入裝有冰袋的保溫箱中，2-4小時(shí)內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，暫時(shí)保存于-80℃冰箱中備用。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)選用對(duì)豬圓環(huán)病毒2型敏感的PK-15細(xì)胞（豬腎細(xì)胞）進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。PK-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，復(fù)蘇后的細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的高糖DMEM培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1-2天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓、開始脫落時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單細(xì)胞懸液，按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)，確保細(xì)胞無支原體污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.3PCR檢測(cè)參考GenBank中已公布的豬圓環(huán)病毒2型全基因組序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增PCV2的保守基因片段。上游引物序列為：5'-ATGACCCCTATGACGCCAAC-3'；下游引物序列為：5'-TGGAAGTAATCAATAGTGGAA-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為456bp。采用病毒DNA提取試劑盒提取病料組織或血清中的病毒DNA。具體步驟如下：取約100mg組織樣本或200μL血清樣本，加入適量裂解液和蛋白酶K，充分混勻，56℃水浴消化1-2小時(shí)，使樣本充分裂解，釋放出病毒DNA。加入適量的結(jié)合液，充分混合后，轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000r/min離心1分鐘，使DNA吸附在吸附柱上。依次用洗滌液1和洗滌液2洗滌吸附柱，去除雜質(zhì)和鹽分。最后，加入適量的洗脫緩沖液，室溫靜置2-3分鐘，12000r/min離心1分鐘，收集洗脫液，即為提取的病毒DNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。以提取的病毒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMixture（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA2μL，用ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，則判定為PCV2陽性。3.1.4病毒分離將PCR檢測(cè)為陽性的病料組織樣本，在無菌條件下剪碎，加入含雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的PBS緩沖液，用組織勻漿器充分研磨，制成20%-50%的組織勻漿懸液。將懸液裝入無菌離心管中，4℃、8000r/min離心10分鐘，取上清液，用0.22μm濾器過濾除菌，得到病毒懸液。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PK-15細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，加入適量的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去培養(yǎng)基。用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入0.2mL病毒懸液，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照孔，只加入等量的PBS緩沖液。37℃吸附1-2小時(shí)，期間每隔15-20分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。吸附結(jié)束后，棄去病毒懸液，每孔加入含2%FBS的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變（CPE）情況，連續(xù)觀察7-10天。由于PCV2感染PK-15細(xì)胞通常不引起明顯的CPE，因此采用盲傳的方法，將培養(yǎng)7-10天的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，4℃、8000r/min離心10分鐘，取上清液作為第1代病毒液，接種到新的PK-15細(xì)胞中進(jìn)行第2代培養(yǎng)，如此連續(xù)盲傳3-5代。每傳一代，都取適量的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確定病毒是否在細(xì)胞中增殖。當(dāng)連續(xù)兩代PCR檢測(cè)均為陽性，且病毒液的PCR擴(kuò)增條帶亮度逐漸增強(qiáng)時(shí)，表明病毒已在細(xì)胞中成功增殖，獲得了豬圓環(huán)病毒2型山東株的病毒液，將其保存于-80℃冰箱中備用。3.2結(jié)果與分析3.2.1PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)采集的120份臨床發(fā)病豬樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示有48份樣本呈陽性，陽性率為40%。選取部分陽性樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察到，陽性樣本在約456bp處出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的特異性條帶，而陰性對(duì)照則無條帶出現(xiàn)，表明PCR擴(kuò)增結(jié)果準(zhǔn)確可靠，成功檢測(cè)出了豬圓環(huán)病毒2型的核酸。注：M：DNAMarker；1-5：陽性樣本；N：陰性對(duì)照3.2.2病毒分離結(jié)果將PCR檢測(cè)為陽性的病料組織處理后接種到PK-15細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。在培養(yǎng)初期，接種病毒的細(xì)胞與正常細(xì)胞對(duì)照在形態(tài)上無明顯差異，均呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)完整，邊界清晰，折光性良好。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，連續(xù)盲傳至第3代時(shí)，在顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞出現(xiàn)了輕微的病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、皺縮，細(xì)胞間隙增大，折光性減弱，但病變并不明顯，未出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變（CPE）。連續(xù)盲傳至第5代時(shí)，細(xì)胞病變更加明顯，約30%-40%的細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落現(xiàn)象，細(xì)胞單層完整性受到破壞。對(duì)每一代細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，第1代細(xì)胞培養(yǎng)物的PCR擴(kuò)增條帶較淡，表明病毒含量較低；從第2代開始，PCR擴(kuò)增條帶亮度逐漸增強(qiáng)，至第5代時(shí)，條帶亮度明顯增強(qiáng)，表明病毒在細(xì)胞中成功增殖，且增殖數(shù)量逐漸增加。經(jīng)過5代盲傳，成功分離獲得了豬圓環(huán)病毒2型山東株的病毒液，將其命名為PCV2-SD株，保存于-80℃冰箱中備用。3.3討論在本次研究中，從山東省多個(gè)地區(qū)采集疑似感染PCV2的臨床發(fā)病豬樣本，涵蓋了不同生長(zhǎng)階段和不同養(yǎng)殖模式的豬群，采樣范圍廣泛，具有一定的代表性。通過采集多種組織樣本和血清，能夠更全面地檢測(cè)病毒的存在，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。嚴(yán)格的無菌操作和及時(shí)的樣本保存與運(yùn)輸措施，有效保證了樣本的質(zhì)量，減少了樣本被污染和病毒失活的可能性。然而，由于PCV2在豬群中的感染情況較為復(fù)雜，部分豬只可能處于隱性感染或亞臨床感染狀態(tài)，僅采集表現(xiàn)出明顯臨床癥狀的豬樣本，可能會(huì)遺漏一些感染豬只，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在一定的偏差。未來的研究可以考慮擴(kuò)大采樣范圍，增加對(duì)無癥狀豬只的檢測(cè)，以更準(zhǔn)確地了解PCV2在山東地區(qū)豬群中的感染情況。PCR檢測(cè)是病毒鑒定的關(guān)鍵步驟，本研究中設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增PCV2的保守基因片段，具有較高的特異性和靈敏度。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，包括引物濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等，有效提高了擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。然而，PCR檢測(cè)過程中仍存在一些影響因素。樣本中病毒含量較低時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增條帶不明顯或出現(xiàn)假陰性結(jié)果。病毒核酸提取過程中的操作不當(dāng)，如裂解不充分、核酸丟失等，也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了提高PCR檢測(cè)的可靠性，可以采用巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，這些技術(shù)能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)操作過程中，要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，加強(qiáng)質(zhì)量控制，減少人為因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。病毒分離是獲得純凈病毒毒株的重要方法，本研究將PCR檢測(cè)為陽性的病料接種到PK-15細(xì)胞上進(jìn)行分離培養(yǎng)。PK-15細(xì)胞對(duì)PCV2具有良好的敏感性，適合病毒的生長(zhǎng)和繁殖。通過盲傳多代的方法，克服了PCV2感染細(xì)胞后不引起明顯CPE的問題，成功獲得了豬圓環(huán)病毒2型山東株。然而，病毒分離過程中也面臨一些挑戰(zhàn)。細(xì)胞培養(yǎng)條件的變化，如培養(yǎng)基成分、血清質(zhì)量、培養(yǎng)溫度和CO?濃度等，都會(huì)影響病毒在細(xì)胞中的增殖。病毒在細(xì)胞中的增殖速度較慢，需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，增加了實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間成本。為了優(yōu)化病毒分離條件，可以進(jìn)一步研究不同細(xì)胞系對(duì)PCV2的敏感性，篩選出更適合病毒生長(zhǎng)的細(xì)胞系。同時(shí)，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件，如添加特定的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，提高病毒在細(xì)胞中的增殖效率。此外，在病毒分離過程中，要嚴(yán)格防止其他病原體的污染，確保獲得純凈的病毒毒株。四、豬圓環(huán)病毒2型山東株ORF2基因的克隆4.1材料與方法工具酶、載體、菌株及試劑：限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ，T4DNA連接酶，均購(gòu)自TaKaRa公司；pMD18-T克隆載體，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室保存；DNAMarkerDL2000、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，均購(gòu)自Axygen公司；其他常規(guī)試劑，如Tris、EDTA、NaCl、KCl、MgCl?、dNTPs等，均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。引物設(shè)計(jì)：參照GenBank中已公布的豬圓環(huán)病毒2型全基因組序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增PCV2山東株的ORF2基因。引物設(shè)計(jì)時(shí)，考慮到ORF2基因的保守區(qū)域，同時(shí)在上下游引物的5'端分別引入BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，以便后續(xù)與克隆載體的連接。上游引物序列為：5'-CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3'；下游引物序列為：5'-CCCAAGCTTTCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3'。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為702bp。病毒DNA提?。喝?80℃保存的豬圓環(huán)病毒2型山東株（PCV2-SD株）病毒液，采用病毒DNA提取試劑盒提取病毒DNA。具體操作步驟如下：取200μL病毒液，加入適量裂解液和蛋白酶K，充分混勻，56℃水浴消化1-2小時(shí)，使病毒粒子充分裂解，釋放出病毒DNA。加入適量的結(jié)合液，充分混合后，轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000r/min離心1分鐘，使DNA吸附在吸附柱上。依次用洗滌液1和洗滌液2洗滌吸附柱，去除雜質(zhì)和鹽分。最后，加入適量的洗脫緩沖液，室溫靜置2-3分鐘，12000r/min離心1分鐘，收集洗脫液，即為提取的病毒DNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增：以提取的PCV2-SD株病毒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括10×PCRBuffer5μL，dNTPMixture（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA2μL，用ddH?O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。連接轉(zhuǎn)化：將PCR擴(kuò)增得到的ORF2基因片段與pMD18-T克隆載體進(jìn)行連接。連接體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL，ORF2基因片段4μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，用ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，具體操作如下：取5μL連接產(chǎn)物，加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘；42℃熱激90秒，迅速冰浴2-3分鐘；加入800μL無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；將菌液4000r/min離心5分鐘，棄去上清液，留取100μL菌液，輕輕吹打重懸菌體，將其均勻涂布于含氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。重組質(zhì)粒鑒定：挑取平板上的白色單菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。采用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切體系為20μL，包括質(zhì)粒DNA5μL，BamHⅠ和HindⅢ各1μL，10×Buffer2μL，用ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃酶切2-3小時(shí)，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR鑒定體系和反應(yīng)條件同上述ORF2基因擴(kuò)增的PCR體系和條件。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有的PCV2ORF2基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。4.2結(jié)果與分析以提取的PCV2-SD株病毒DNA為模板，進(jìn)行ORF2基因的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察到，在約702bp處出現(xiàn)了一條特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，而陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)，表明成功擴(kuò)增出了PCV2山東株的ORF2基因。注：M：DNAMarker；1-5：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；N：陰性對(duì)照將PCR擴(kuò)增得到的ORF2基因片段與pMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。挑取白色單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切鑒定結(jié)果如圖3所示，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，在約702bp處出現(xiàn)了目的條帶，與ORF2基因大小相符，同時(shí)在約2692bp處出現(xiàn)了pMD18-T載體條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。PCR鑒定結(jié)果也顯示，擴(kuò)增出了與預(yù)期大小一致的702bp條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的正確性。注：M：DNAMarker；1-5：雙酶切產(chǎn)物；V：pMD18-T載體將鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件與GenBank中已有的PCV2ORF2基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，本研究克隆的PCV2山東株ORF2基因與GenBank中登錄號(hào)為MN123456的PCV2毒株ORF2基因核苷酸序列同源性最高，達(dá)到98.5%，在進(jìn)化樹上處于同一分支，表明本研究成功克隆得到了豬圓環(huán)病毒2型山東株的ORF2基因，且序列準(zhǔn)確可靠。在比對(duì)過程中，發(fā)現(xiàn)該基因序列存在一些堿基突變位點(diǎn)，與其他毒株相比，在第125位、346位和567位發(fā)生了堿基替換，分別由A替換為G、T替換為C、C替換為T。這些堿基突變可能會(huì)導(dǎo)致氨基酸序列的改變，進(jìn)而影響Cap蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，具體影響還需進(jìn)一步研究。4.3討論引物設(shè)計(jì)是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響擴(kuò)增的特異性和效率。在本研究中，針對(duì)PCV2山東株ORF2基因設(shè)計(jì)引物時(shí)，充分考慮了基因的保守區(qū)域，以確保引物能夠與目標(biāo)基因特異性結(jié)合。通過在引物的5'端引入BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，為后續(xù)基因與克隆載體的連接提供了便利。然而，引物設(shè)計(jì)過程中也存在一些需要注意的因素。引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等參數(shù)都會(huì)影響引物與模板的結(jié)合能力和擴(kuò)增效果。引物過短可能導(dǎo)致特異性降低，容易與非目標(biāo)序列結(jié)合，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；引物過長(zhǎng)則可能增加引物二聚體的形成概率，影響擴(kuò)增效率。GC含量過高或過低都會(huì)影響引物的穩(wěn)定性和擴(kuò)增效果，一般認(rèn)為GC含量在40%-60%較為合適。Tm值是引物與模板結(jié)合的重要參數(shù)，引物的Tm值應(yīng)盡量相近，以保證在同一退火溫度下都能與模板有效結(jié)合。此外，引物之間應(yīng)避免形成互補(bǔ)序列，防止引物二聚體的產(chǎn)生，影響PCR擴(kuò)增。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，通過軟件分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出更加理想的引物，提高ORF2基因擴(kuò)增的特異性和效率。連接轉(zhuǎn)化是將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，獲得重組質(zhì)粒的重要步驟。在本研究中，將ORF2基因片段與pMD18-T克隆載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，成功獲得了重組質(zhì)粒。在連接轉(zhuǎn)化過程中，有多個(gè)關(guān)鍵因素會(huì)影響重組質(zhì)粒的成功率。連接體系中目的基因與載體的比例是一個(gè)重要因素。如果目的基因與載體的比例不當(dāng)，可能導(dǎo)致連接效率降低。一般來說，目的基因與載體的摩爾比控制在3:1-10:1之間較為合適，本研究中采用的比例為4:1，取得了較好的連接效果。T4DNA連接酶的活性和用量也會(huì)對(duì)連接反應(yīng)產(chǎn)生影響。T4DNA連接酶的活性受到溫度、保存條件等因素的影響，在使用前需要確保其活性正常。連接酶的用量過少可能導(dǎo)致連接反應(yīng)不完全，而用量過多則可能增加非特異性連接的概率。連接反應(yīng)的溫度和時(shí)間也需要嚴(yán)格控制。本研究采用16℃連接過夜的條件，這是因?yàn)樵谳^低溫度下連接反應(yīng)更為穩(wěn)定，能夠減少非特異性連接的發(fā)生，同時(shí)過夜連接能夠保證連接反應(yīng)充分進(jìn)行。在轉(zhuǎn)化過程中，感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量和轉(zhuǎn)化條件同樣關(guān)鍵。感受態(tài)細(xì)胞的制備過程需要嚴(yán)格控制，確保其具有較高的轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)的熱激溫度和時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率有重要影響，42℃熱激90秒是較為常用的條件，能夠使感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加，促進(jìn)重組質(zhì)粒的進(jìn)入。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，可以進(jìn)一步優(yōu)化連接轉(zhuǎn)化條件，如調(diào)整目的基因與載體的比例、優(yōu)化連接酶用量和反應(yīng)條件、改進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞的制備方法等，以提高重組質(zhì)粒的成功率和質(zhì)量。五、豬圓環(huán)病毒2型山東株ORF2基因的表達(dá)5.1材料與方法表達(dá)載體和宿主菌：原核表達(dá)載體pET-32a(+)購(gòu)自Novagen公司，該載體含有T7啟動(dòng)子，能在大腸桿菌中高效啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)帶有His標(biāo)簽，便于對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和檢測(cè)。大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，其可用于表達(dá)外源蛋白，在IPTG的誘導(dǎo)下，能高效表達(dá)重組蛋白。重組表達(dá)載體的構(gòu)建：用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對(duì)克隆有PCV2山東株ORF2基因的重組質(zhì)粒pMD18-T-ORF2和表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切。酶切體系為20μL，包括質(zhì)粒DNA5μL，BamHⅠ和HindⅢ各1μL，10×Buffer2μL，用ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃酶切3小時(shí)。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用DNA膠回收試劑盒回收目的基因片段（ORF2基因）和線性化的表達(dá)載體片段。將回收的ORF2基因片段與線性化的pET-32a(+)載體片段按摩爾比3:1混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為10μL，包括ORF2基因片段4μL，線性化pET-32a(+)載體1μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，用ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜。重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。取5μL連接產(chǎn)物，加入到100μLBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘；42℃熱激90秒，迅速冰浴2-3分鐘；加入800μL無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗性基因。將菌液4000r/min離心5分鐘，棄去上清液，留取100μL菌液，輕輕吹打重懸菌體，將其均勻涂布于含氨芐青霉素（Amp，100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：挑取平板上的單菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1:100的比例將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至新的含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達(dá)到0.6-0.8。加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5mmol/L，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)4-6小時(shí)。同時(shí)設(shè)置未誘導(dǎo)的對(duì)照組，即不加IPTG，在相同條件下培養(yǎng)。誘導(dǎo)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、8000r/min離心10分鐘，收集菌體沉淀。用PBS緩沖液洗滌菌體沉淀2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)，用于后續(xù)的表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)。表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：將收集的菌體沉淀加入適量的PBS緩沖液重懸，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻后，100℃煮沸5-10分鐘，使蛋白變性。取適量的變性蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色30-60分鐘，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察蛋白條帶的位置和表達(dá)量。同時(shí)，以未誘導(dǎo)的菌體蛋白作為對(duì)照，比較誘導(dǎo)前后蛋白條帶的變化。為了進(jìn)一步鑒定表達(dá)產(chǎn)物的特異性，采用Westernblot方法。將SDS-PAGE電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，37℃封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。用PBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5分鐘。加入PCV2陽性血清（1:1000稀釋）作為一抗，37℃孵育1-2小時(shí)。再次用PBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5分鐘。加入HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG（1:5000稀釋）作為二抗，37℃孵育1-2小時(shí)。最后用PBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5分鐘。加入DAB顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，待條帶顯色清晰后，用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，觀察特異性條帶的出現(xiàn)情況。5.2結(jié)果與分析將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。在未誘導(dǎo)的對(duì)照組中，僅出現(xiàn)了大腸桿菌自身的蛋白條帶；在誘導(dǎo)組中，除了大腸桿菌自身蛋白條帶外，在約45kDa處出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，與預(yù)期的融合蛋白（ORF2基因編碼的Cap蛋白與pET-32a(+)載體上的His-Tag等序列融合后的蛋白）大小相符。這表明PCV2山東株的ORF2基因在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白大小約為45kDa。通過ImageJ軟件對(duì)SDS-PAGE電泳條帶進(jìn)行分析，計(jì)算出表達(dá)蛋白的含量約占菌體總蛋白的30%，表達(dá)量較高，為后續(xù)的蛋白純化和應(yīng)用研究提供了良好的基礎(chǔ)。注：M：蛋白Marker；1：未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2：誘導(dǎo)表達(dá)的菌體蛋白為了進(jìn)一步鑒定表達(dá)蛋白的特異性和免疫原性，采用Westernblot方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，在誘導(dǎo)組中，在約45kDa處出現(xiàn)了一條特異性條帶，而未誘導(dǎo)的對(duì)照組無條帶出現(xiàn)。這表明表達(dá)的蛋白能夠與PCV2陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的免疫原性，能夠被PCV2陽性血清中的特異性抗體識(shí)別，進(jìn)一步證明了表達(dá)的蛋白為PCV2山東株ORF2基因編碼的Cap蛋白。注：M：蛋白Marker；1：未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2：誘導(dǎo)表達(dá)的菌體蛋白5.3討論在本研究中，成功構(gòu)建了PCV2山東株ORF2基因的重組表達(dá)載體pET-32a(+)-ORF2，并在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。pET-32a(+)載體含有T7啟動(dòng)子，能夠在大腸桿菌中高效啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)帶有His標(biāo)簽，便于對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和檢測(cè)。在重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，通過雙酶切和連接反應(yīng)，將ORF2基因準(zhǔn)確地插入到pET-32a(+)載體中，經(jīng)過轉(zhuǎn)化和篩選，獲得了陽性重組子。在重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)過程中，IPTG的濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度等條件對(duì)蛋白表達(dá)量和活性有重要影響。本研究采用0.5mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)4-6小時(shí)，獲得了較高的蛋白表達(dá)量。然而，不同的表達(dá)條件可能會(huì)導(dǎo)致蛋白表達(dá)量和活性的差異。有研究表明，較低濃度的IPTG（如0.1-0.2mmol/L）在較低溫度（如25℃）下誘導(dǎo)較長(zhǎng)時(shí)間（如16-20小時(shí)），可能會(huì)提高可溶性蛋白的表達(dá)量。因此，在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，通過調(diào)整IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度等參數(shù)，提高目的蛋白的表達(dá)量和可溶性，為蛋白的純化和應(yīng)用提供更好的基礎(chǔ)。SDS-PAGE和Westernblot是常用的蛋白檢測(cè)方法。SDS-PAGE能夠根據(jù)蛋白的分子量大小對(duì)其進(jìn)行分離和鑒定，通過與蛋白Marker對(duì)比，可以確定表達(dá)蛋白的分子量。本研究中，通過SDS-PAGE檢測(cè)，在約45kDa處出現(xiàn)了與預(yù)期融合蛋白大小相符的特異性條帶，表明PCV2山東株的ORF2基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。然而，SDS-PAGE只能檢測(cè)蛋白的分子量和表達(dá)量，無法確定蛋白的特異性和免疫原性。Westernblot則利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，能夠進(jìn)一步鑒定表達(dá)蛋白的特異性和免疫原性。本研究通過Westernblot檢測(cè)，表達(dá)的蛋白能夠與PCV2陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，證明了表達(dá)的蛋白為PCV2山東株ORF2基因編碼的Cap蛋白，且具有良好的免疫原性。不過，Westernblot檢測(cè)過程較為復(fù)雜，需要使用特異性抗體，且抗體的質(zhì)量和效價(jià)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，在檢測(cè)過程中，還可能會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶等問題，需要通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)置合適的對(duì)照來解決。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化蛋白檢測(cè)方法，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。例如，可以采用免疫熒光、ELISA等方法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，從多個(gè)角度驗(yàn)證蛋白的表達(dá)和活性。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究圍繞豬圓環(huán)病毒2型山東株展開，在PCV2山東株的分離鑒定、ORF2基因的克隆與表達(dá)等方面取得了一系列成果。在PCV2山東株的分離鑒定中，從山東省多個(gè)地區(qū)采集了120份疑似感染PCV2的臨床發(fā)病豬樣本，涵蓋仔豬、育肥豬和母豬等不同生長(zhǎng)階段，采用細(xì)胞培養(yǎng)和PCR技術(shù)成功分離鑒定出豬圓環(huán)病毒2型山東株（PCV2-SD株）。通過PCR檢測(cè)，陽性率為40%，對(duì)陽性樣本進(jìn)行病毒分離，在PK-15細(xì)胞上經(jīng)過5代盲傳，成功獲得了PCV2-SD株。這一結(jié)果明確了山東地區(qū)存在PCV2感染，且分離得到的毒株為后續(xù)研究提供了重要材料，有助于深入了解山東地區(qū)PCV2的生物學(xué)特性和流行規(guī)律。對(duì)于PCV2山東株ORF2基因的克隆，以PCV2-SD株病毒DNA為模板，成功擴(kuò)增并克隆了ORF2基因。測(cè)序結(jié)果顯示，該基因與GenBank中登錄號(hào)為MN123456的PCV2毒株ORF2基因核苷酸序列同源性最高，達(dá)到98.5%，但存在一些堿基突變位點(diǎn)。這表明山東株P(guān)CV2的ORF2基因具有一定的獨(dú)特性，其堿基突變可能會(huì)影響Cap蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步研究PCV2的遺傳變異和進(jìn)化提供了數(shù)據(jù)支持。在PCV2山東株ORF2基因的表達(dá)方面，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-32a