親和嫁接技術1 親和膜過濾

比較?解決之道?1 親和膜過濾設計比較:柱高/直徑=250/4.6 =54.3

柱高/直徑=200/252 =0.794Cu-IDA-Seph-aroseCL-6Bφ252×200

IDA-Sepha-roseCL-6Bφ252×100

design?1 親和膜過濾.如柱體積一定(即料液處理能力一定)降低柱高增大柱徑p不變流速提高分離速度提高“短粗”型親和柱為使分離速度達到極限值，“理想”的層析柱幾何形狀應該是柱高等于介質直徑結果?1 親和膜過濾

親和膜(Affinitymembrane)利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是固定床親和層析的變型。所以，利用親和膜的純化方法又稱membrane-basedaffinitychromatography結果=親和膜親和膜吸附分離的原理時間比較1st

外擴散-吸附時間比較:利用BSA抗體修飾的Sepharose為介質吸附BSA，基于二級反應動力學常數(shù)計算的擴散-吸附反應時間為

5s.

2nd

內擴散-吸附時間:利用tD=L2D/D

計算,BSA在粒徑為100umSepharose中擴散-吸附所需平均時間為(5010-4)2/(610-7)=41s，實驗材料比較優(yōu)點1st

傳質阻力小,達到吸附平衡的時間短;2nd

壓降小，流速快;3rd

設備體積小;4th

配基利用率高,配基用量低.缺點:1st

從分離效率的角度，因膜的厚度(柱高)很小(一般為10~100um)，理論板數(shù)很低;2nd

膜的污染和膜孔的堵塞使操作速度、吸附效率和親和膜的壽命下降.1 親和膜過濾

結果:利用含10cm3膜材料的小型親和膜設備可在15分鐘內完成1.2dm3粗料液的純化處理，單抗回收率為97%，其中除去了95%的核酸和99.5%的牛血清白蛋白3rd

Sepracor公司實驗結果表明，利用300美元A蛋白可純化8萬美元的單抗。由于該純化系統(tǒng)將除菌、純化和濃縮操作一步完成，分離速度可達到傳統(tǒng)層析法的100倍。

應用1st

螺旋卷式膜組件(美國CunoCo.)

膜材料:

纖維素一A蛋白/

乙烯配基

操作方式:

流體沿徑透過膜組件，中心管流出，

操作壓:低于0.07MPa,透過流量達100~1000cm3/min

結果:

利用固定化A蛋白吸附各種來源不同的IgG實驗表明，每克膜材料吸附7~19mgIgG，回收率為91~100%。

2nd

中空纖維型微濾膜組件(美國Sepracor公司):

膜材料:

纖維素一A蛋白實驗:

純化含血清培養(yǎng)液中的小鼠單抗的實驗Why?2 親和過濾4th

利用CibacronblueF3G-A修飾的微濾膜(膜厚210um，孔徑0.45um，修飾密度為7umol/cm3)吸附葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)

動力學實驗結果:

當料液中含有相當于膜吸附容量約67%G6PDH時，0.25s(壓力=0.4MPa，線速度=5cm/min)的平均停留時間就足以使吸附達到飽合。當G6PDH含量達到膜吸附容量的130%時，所需的平均停留時間不超過1s。

純化結果:

利用體積僅4.83cm3的親和膜在9分鐘內即完成了0.6dm3料液的純化處理，G6PDH收率達82%，比活提高27倍。非常有用的實驗技術2 親和錯流過濾超濾膜/微濾膜存在問題:

孔徑有很寬的分布范圍，因此，單純的超濾/微濾分離蛋白質等生物大分子的選擇性很低，一般只有當兩種組分的分子量相差10倍以上時才有可能得到完全分離。辦法:

親和錯流過濾(affinitycross-flowfiltration,ACFF)or親和過濾(affinityfiltration),or親和超濾(affinityultrafiltration).是親和技術與膜分離相結合的分離純化技術，是親和層析的另一種變形.操作:

2 親和錯流過濾優(yōu)點(兼?zhèn)溆H和吸附與膜分離):1st

親和作用高選擇性+不溶性微粒固定相的親和配基，從而增大目標分子與雜分子的尺寸差別，大大提高膜分離的選擇性。使親和過濾的純化水平可接近或達到親和層析；2nd

膜分離以壓差為傳質推動力，速度快，易于放大和實現(xiàn)連續(xù)化操作;3rd

制備親和過濾介質所用的載體一般為水溶性聚合物(如聚丙烯酰胺)或無孔微粒(如聚合脂質體、納米硅膠)，無內擴散傳質阻力，目標分子的親和結合速度快，從而可最大程度地分揮膜分離法速度快的優(yōu)勢.4th

傳統(tǒng)的親和吸附介質(如瓊脂糖凝膠)也可用做親和過濾介質，此時內擴散傳質阻力可能成為分離操作的速度控制步驟。但是，由于膜分離法易于放大，只要保證在吸附過程中目標分子與親和過濾介質有足夠長的接觸時間，利用較大的吸附接觸器仍可在較高的過濾速度下操作.缺點:單板性

目標分子與親和過濾介質的接觸在全混槽中進行，最多只能達到一級吸附平衡，相當于層析過程的一個塔板。這一單板屬性決定了其分離效率不如親和層析，特別是對于親和常數(shù)小于105dm3/mol的親和體系.2 親和錯流過濾應用:1st

酵母細胞特點:直徑約5um,表面含有多糖殘基2nd

應用:用高溫死的酵母細胞為親和過濾介質進行親和過濾純化伴刀豆球蛋白A(conA)。3rd

右圖為利用中空纖維膜組件的間歇親和過濾流程親和吸附conA。Why?2 親和錯流過濾4th

結果:

圖為從Jack豆抽提液中純化conA的實驗結果。經(jīng)一步親和過濾，conA的收率為70%，產(chǎn)品(右圖的第2個峰)經(jīng)凝膠電泳分析僅顯示一條電泳帶.3 親和雙水相分配

傳統(tǒng)的雙水相體系親和分配(Affinitypartitioning):

利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚合物進行目標產(chǎn)物的雙水相萃取，可在配基的親和作用下促進目標產(chǎn)物在PEG相的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。這就是親和萃取，又稱親和分配.

PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)DX=葡聚糖(dextran)3 親和雙水相分配

機理:對于多效價目標分子與配基結合,P-目標分子，L-配基，PLn-單目標分子與n配基形成的復合體.影響因素:1st

Kd2nd[L]/or[PEG–L]3 親和雙水相分配

3rd[PEG-L]/{[PEG-L]+[PEG]}4th

配基種類操作:

與其他親和純化技術一樣，親和分配純化過程也可經(jīng)過三步:

親和分配(進料)，雜蛋白質反萃取(清洗)

目標產(chǎn)物反萃取(洗脫)。3 親和雙水相分配應用 圖為利用PEG-色素/Aquaphase-PPT(一種淀粉的羥丙基衍生物的商品名)系統(tǒng)從豬肌組織中連續(xù)萃取LDH的流程。豬肌組織直接在成相系統(tǒng)中勻漿，固形物分配在下相，而目標產(chǎn)物分配在上相。用離心機分相后，上相用純下相溶液清洗一次，進入第二個離心機。從第二個離心機流出的上相與磷酸鈉溶液(50%，pH6.9~7.0)混合，形成PEG/磷酸鈉雙水相系統(tǒng)。由于LDH與色素的親和作用下降，LDH被反萃到下相(磷鈉溶液)中得到回收，而上相的PEG和PEG-色素返回勻漿機中循環(huán)再利用。

4 親和反膠團萃取膠束(micelles):

向水中加入S,水溶液的

隨[S]增大而下降。當[S]達到一定值后，S締合形成水溶性膠束,溶液的表面張力不再隨表面活性劑濃度的增大而降低。親和反膠團萃取(Affinity-basedreversedmicellarextraction)

是指在反膠團相中除通常的表面活性劑（如AOT）以外，添加另一種助表面活性劑(cosurfactant):

S-配基，通過配基與目標分子的親和作用，促進目標產(chǎn)物在反膠團相的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和反膠團萃取分離的選擇性。一般將含有配基的助表面活性劑稱為親和助表面活性劑(affinityco-surafctant)。理論親和反膠團萃取的分配系數(shù)其中mL為親和助表面活性劑的分配系數(shù)。如果親和助表面活性劑主要存在于反膠團相，則mL非常大，上式簡化為意義:影響因素實驗:

正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(octyl-β-D-glucopyra-noside，OGP)萃取conA.4 親和反膠團萃取1st

提高conA的萃取率和選擇性

如圖示，在OGP的存在下conA的萃取率增大，而與OGP無親和結合作用的核糖核酸酶A的萃取率不變。2nd

配基濃度對mA作用 圖為OGP濃度對conA分配系數(shù)的影響，隨著OGP濃度增大，conA的分配系數(shù)增大4 親和反膠團萃取3rd

對適應pH范圍的作用 圖示:通過添加親和助表面活性劑可使目標產(chǎn)物的萃取pH范圍增寬。因此利用親和反膠團萃取不僅可以提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)，(回收率),而且由于萃取操作的pH范圍較寬，便于通過調節(jié)pH值提高萃取分離的選擇性。意義?4 親和反膠團萃取4th鹽濃度的影響

引入親和助表面活性劑無疑是提高反膠團萃取選擇性的有效手段。與一般的反膠團萃取一樣，親和反膠團萃取的目標產(chǎn)物也可通過調節(jié)水相pH和鹽濃度進行反萃取。如圖8.37所示，隨著水相鹽濃度的增大，不管親和助表面活性劑添加與否，反膠團相的對蛋白質的空間排阻作用增大的結果。

意義4 親和反膠團萃取5th

葡萄糖 向水相中添加目標產(chǎn)物的水溶性親和配基，也可抑制目標產(chǎn)物向反膠團相反分配。例如，葡萄糖與conA具有親和結合作用，在利用OGP進行conA的反膠團萃取時，隨著水相葡萄糖濃度增大，conA的萃取率下降。利用目標產(chǎn)物親和配基的以萃取法相當于親和層析的特異洗脫，有利于提高目標產(chǎn)物的純度。

意義?5 親和沉淀

現(xiàn)象

免疫擴散沉淀:血型檢查:親和沉淀(Affinityprecipitation)

生物親和相互作用與沉淀分離相結合的蛋白質類生物大分子的分離純化技術。一次作用親和沉淀

水溶性化合物分子上偶聯(lián)有兩個或兩個以上的親和配基，形成雙配基/或多配基(polyligand)。雙或多配基可與含有兩上以上親和結合部位的多價蛋白質)產(chǎn)生和交聯(lián)，形成交聯(lián)網(wǎng)絡而沉淀。這

與抗原-抗體的沉淀作用相似.當配基與蛋白質的親和結合部位的效價比為1時沉淀率最高.一次親和沉淀的應用1stin1983,利用bis-NAD從牛心組織抽提液中純化了LDH，收率為90%，純化倍數(shù)達48。但NAD價格較高，且易生物降解，難于實現(xiàn)大規(guī)模應用。2nd1983年后，人們開始研究利用三嗪色素為配基的一次作用親和沉淀法，其中的代表性工作是利用ProconBlueH-B的類似物制備雙配基，一次作用親和沉淀化免肌LDH，收率達97%，純度達電泳純.5 親和沉淀存在問題1stNAD價格較高，且易生物降解，難于實現(xiàn)大規(guī)模應用;2nd

一次作用親和沉淀雖然簡單，但僅適用于多價、特別是4價以上的蛋白質，要求配基與目標分子的親和結合常數(shù)較高，沉淀條件難于掌握，3rd

沉淀的目標分子與雙配基的分離需要透析或凝膠過濾等難于大規(guī)模應用的附加工具，實用上存在較大難度。解決辦法二次作用親和沉淀

可溶性結合(一次沉淀)場致沉淀(二次沉淀)離心洗脫目標分子5 親和沉淀例1:胰蛋白酶純化 芐脒基為胰蛋白酶的親和配基，而苯甲酸基為pH敏感基團，影響聚合物的溶解度。該聚合物可溶解于pH>6的水溶液，但當pH<5時即可發(fā)生完全的沉淀。 將該聚合物加入到pH8.0的牛胰抽提液中，充分混合后加酸至pH4.0，則聚合物-胰蛋白質酶復合物沉淀。離心回收沉淀并用pH為4.0的水溶液清洗后，再加酸至pH2.0，即可洗脫回收胰蛋白酶。利用該方法純化牛胰蛋白酶的收率為76%，純度提高5.4倍，達92%

5 親和沉淀例2聚合脂質體特性

二十五-10，12-二炔-1-醇磷脂乙醇胺為含有共軛二炔結構單元的雙親性化合物，其水懸浮液在超聲波處理下形成0.1~0.2um的球形液泡狀磷脂雙分子膜，即脂質體(liposome，見圖)，表面為親水性乙醇胺基團。該脂質體溶液在紫外線照射下可發(fā)生聚合反應，形成聚合脂質體(polymerizedliposome，PLS)。 向PLS溶液加入NaCl，當NaCl濃度超過0.17mol/dm3時，在滲透壓作