侵襲性肺真菌病的實驗室診斷進展2026隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進步，長期的癌癥治療、異基因器官、造血細胞移植和長期使用皮質(zhì)類固醇治療等免疫抑制人群逐年增多［1］。免疫抑制人群是侵襲性肺真菌?。╥nvasivepulmonarymycosis，IPM）的高危群體，若未能及時且規(guī)范地進行診斷和治療，可能會導(dǎo)致病情迅速惡化，甚至危及生命［2］。長期以來，診斷感染病原微生物的檢測主要依賴于痰液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）標(biāo)本的涂片、培養(yǎng)，以及血清學(xué)（1，3）-β-D葡聚糖試驗（G試驗）、半乳甘露聚糖抗原試驗（GM試驗）和組織病理學(xué)等方法。然而，這些方法常因陽性率低、特異性差及等待時間長等原因，導(dǎo)致診斷和治療的延誤。因此，早期、快速且準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷對于指導(dǎo)抗生素治療、改善預(yù)后及降低病死率具有重要意義。近年來，PCR、靶向高通量測序和宏基因組二代測序（metagenomicsnext-generationsequencing，mNGS）等分子檢測技術(shù)發(fā)展迅速，在一定程度上加快了侵襲性真菌病診斷方法的進展。本文對IPM的實驗室診斷進展進行綜述，以期為臨床醫(yī)生和研究人員提供有價值的參考。1實驗室診斷方法在IPM中的應(yīng)用1.1

肺念珠菌病念珠菌是BALF和痰液標(biāo)本中常見的真菌，主要包括白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等。通過傳統(tǒng)檢測方法確診肺念珠菌病較為少見，如何區(qū)分念珠菌定植、感染和污染仍是臨床中的一大難題［3］。G試驗是提示念珠菌感染的重要線索，不同標(biāo)本的G試驗對念珠菌感染診斷價值不同。Su等［4］在對比血清標(biāo)本G試驗和氣管內(nèi)吸引物及BALF標(biāo)本G試驗對于檢測肺念珠菌病的診斷效能時發(fā)現(xiàn)，血清標(biāo)本G試驗不具備診斷價值，而氣管內(nèi)吸引物及BALF標(biāo)本G試驗的診斷效能相對較好。念珠菌甘露聚糖檢測是一種通過對甘露聚糖的定量檢測以診斷早期念珠菌感染的方法，但存在樣本污染等可能，導(dǎo)致假陽性及假陰性。T2磁共振（T2magneticresonance，T2MR）是一種新型念珠菌分子檢測方法。有研究發(fā)現(xiàn)T2MR診斷腹腔念珠菌的靈敏度和特異度分別為33%和93%，并認為該法可作為血培養(yǎng)陰性的補充診斷手段［5］。目前國內(nèi)外檢測念珠菌的主流PCR法包括實時熒光定量PCR、多重實時PCR、多重串聯(lián)PCR等，不同PCR方法的特點各異。Zhang等［6］對比了鏡檢法、培養(yǎng)法和PCR診斷肺念珠菌病的能力，發(fā)現(xiàn)PCR的靈敏度最高。mNGS在檢測肺念珠菌病中表現(xiàn)良好，但難以區(qū)分定植與感染。一項納入了310例參與者的研究發(fā)現(xiàn)，通過mNGS檢測到51例參與者BALF中存在念珠菌，但此51例均考慮為疑似念珠菌定植［3］。單獨檢測在區(qū)分定植與感染中仍存在一定難度，因此應(yīng)結(jié)合患者免疫狀態(tài)、臨床特點和影像表現(xiàn)進行區(qū)分，在實驗室條件允許情況下，可通過G試驗或念珠菌甘露聚糖檢測聯(lián)合PCR或基因測序技術(shù)等聯(lián)合檢測方式加以鑒別。1.2

肺曲霉?。呵忠u性肺曲霉?。╥nvasivepulmonaryaspergillosis，IPA）是我國最常見的IPM，在血液系統(tǒng)疾病患者中，90d病死率高達59.3%［7］。涂片鏡檢和培養(yǎng)是最簡單、直接的曲霉菌診斷方法，但存在著陽性率低、等待時間長的問題。G試驗是最常規(guī)的檢測方法，但由于其非特異性，通常用于曲霉菌感染的病情監(jiān)測和療效觀察。半乳甘露聚糖是曲霉菌細胞壁特有的多糖成分，但由于中性粒細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)會清除相應(yīng)抗原，導(dǎo)致血清學(xué)GM試驗診斷的靈敏度低于BALF。歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組診斷指南建議GM試驗結(jié)果滿足下列任意一項即可診斷為侵襲性曲霉?。海?）單次血清或血漿標(biāo)本GM試驗值≥1.0；（2）BALF的GM試驗值≥1.0；（3）單次腦脊液GM試驗值≥1.0；（4）同時檢測血清和BALF時，血清GM試驗值≥0.7并且BALF的GM試驗值≥0.8［8］。曲霉菌特異性抗體免疫球蛋白G/免疫球蛋白E是檢測曲霉菌感染的重要方法。其中，免疫球蛋白G抗體在慢性肺曲霉病中有接近確診價值，并可通過動態(tài)檢測該指標(biāo)反映病情變化。免疫球蛋白E抗體則在變應(yīng)性支氣管肺曲霉病中表現(xiàn)出良好的診斷價值。一項meta分析報道：曲霉特異性免疫球蛋白E診斷變應(yīng)性支氣管肺曲霉病的總體靈敏度和特異度分別為0.83和0.89［9］。PCR的方法學(xué)、試劑的標(biāo)準(zhǔn)性和可靠性對結(jié)果影響較大，不同研究之間在診斷效能上存在較大差異［10］。Erman-Daloglu等［11］的報道評估了不同PCR檢測對曲霉菌的診斷價值，結(jié)果顯示ArtusRGPCR檢測的靈敏度僅為47.6%，而MycAssayPCR檢測的靈敏度為61.9%。曲霉菌的檢測在聯(lián)合應(yīng)用背景下表現(xiàn)出較高的應(yīng)用價值，Boch等［12］發(fā)現(xiàn)G試驗或GM試驗聯(lián)合PCR可以提高曲霉菌的檢測效能。歐洲曲霉菌PCR倡議工作組規(guī)范了曲霉菌PCR檢測方法的實施標(biāo)準(zhǔn)，在對全血、血清和血漿進行PCR檢測時應(yīng)參照此標(biāo)準(zhǔn)實施檢測［13］。mNGS檢測曲霉菌表現(xiàn)出較高的診斷效能。Shi等［14］發(fā)現(xiàn)，mNGS診斷曲霉菌的靈敏度、特異度和正確率分別為82.6%、97.7%和92.5%。與涂片、培養(yǎng)、GM試驗比較，mNGS的靈敏度優(yōu)于任何單一傳統(tǒng)檢測方法。Ao等［15］的研究則報道在26例IPA患者中，GM試驗檢測曲霉菌的靈敏度最高（57.7%），其次是mNGS、培養(yǎng)和涂片。Wang等［16］在惡性腫瘤合并重癥肺炎患者中對比了同一BALF標(biāo)本的mNGS與培養(yǎng)法的診斷效能，發(fā)現(xiàn)mNGS的陽性檢出率明顯高于培養(yǎng)法（91.94%比51.61%），并且在混合感染檢出率中更有優(yōu)勢。另外，由于絲狀真菌主要分布在肺組織表面，使得BALF難以取到病原體，加之核酸提取困難的因素，導(dǎo)致應(yīng)用BALF標(biāo)本進行mNGS檢測到的真菌序列數(shù)較低［17］。相比于傳統(tǒng)檢測方法，mNGS在混合感染中優(yōu)勢明顯，選定診斷方法應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)貙嶒炇议_展項目、患者免疫狀態(tài)、影像表現(xiàn)和病情嚴(yán)重程度作出最優(yōu)選擇，必要時可選用BALF標(biāo)本和血清標(biāo)本GM試驗互相聯(lián)合或GM試驗聯(lián)合分子檢測等方法。1.3

肺隱球菌病肺隱球菌病是由新型隱球菌和格特隱球菌引起的IPM，診斷延誤易引發(fā)隱球菌性腦膜炎。由于隱球菌的細胞壁缺乏（1，3）-β-D葡聚糖抗原，莢膜中也含有與GM呈交叉反應(yīng)的表位，導(dǎo)致G試驗和GM試驗并不能提示隱球菌感染。隱球菌涂片及培養(yǎng)陽性率較低且結(jié)果獲取時間較長。隱球菌莢膜抗原（CrAg）檢測是隱球菌的重要檢測方法，診斷效能較高。有研究指出，隱球菌性腦膜炎和播散性隱球菌感染中血清標(biāo)本CrAg檢測方法的靈敏度和特異度可達93%～100%和93%～98%［18］。但人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）陰性的單純肺隱球菌病患者的靈敏度僅為25%～56%，提示該方法的檢測效能可能與患者免疫狀態(tài)相關(guān)［19］。此外，隱球菌載量過低、類風(fēng)濕因子陽性及少數(shù)病原菌感染也會導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果［20］。Tay等［21］報道了一種實時PCR檢測方法，具有更佳的隱球菌診斷效能，其檢測靈敏度（96.4%）優(yōu)于全真菌PCR和培養(yǎng)，檢測特異度為100%。相比而言，mNGS技術(shù)能夠一次性檢測出所有潛在感染病原體，可顯著減少診斷時間。由于隱球菌厚莢膜的存在導(dǎo)致核酸提取障礙的可能，從而出現(xiàn)低序列數(shù)甚至假陰性的情況［22］。mNGS和部分PCR技術(shù)檢測隱球菌感染的優(yōu)勢在于能夠區(qū)分隱球菌的分型及亞型，對選擇抗隱球菌治療方案具有重要的指導(dǎo)意義［23］。綜上，CrAg檢測是一種診斷肺隱球菌病的重要非侵入式檢測手段，但因其僅能測定隱球菌，在臨床應(yīng)用中受到限制，而多重PCR、mNGS分子檢測方法在混合感染檢測中存在優(yōu)勢。1.4

肺孢子菌肺炎（pneumocystispneumonia，PCP）PCP是由肺孢子菌引起的IPM，通常發(fā)生在HIV感染及惡性腫瘤等免疫功能低下的患者中［24］。G試驗在PCP患者中的靈敏度和陰性預(yù)測值較高，當(dāng)G試驗陰性時，幾乎可以排除PCP的可能性［25］。聯(lián)合應(yīng)用mNGS與G試驗?zāi)軌蝻@著提高診斷效能，并能區(qū)分定植與感染。Huang等［26］研究認為mNGS區(qū)分肺孢子菌感染的最佳閾值為序列數(shù)6，G試驗為47.6ng/L。染色鏡檢是肺孢子菌主要的傳統(tǒng)檢測方法之一。六胺銀染色對包囊染色特異性好，對比性強，在臨床得到廣泛應(yīng)用，但因標(biāo)本質(zhì)量差、肺孢子菌的載量低等原因?qū)е聶z出率較低從而漏診。Jiang等［27］的研究發(fā)現(xiàn)，mNGS診斷PCP的靈敏度為100%，顯著高于六胺銀染色（25.0%）和血清G試驗（67.4%），且mNGS的特異度（96.3%）高于G試驗（81.4%）。Lin等［28］的研究報道，盡管采用六胺銀染色聯(lián)合G試驗，但其對PCP的診斷能力依然低于單獨的mNGS檢測。Wang等［29］的研究發(fā)現(xiàn)，mNGS診斷PCP的靈敏度明顯高于單獨使用六胺銀染色。與mNGS相同，PCR存在難以區(qū)分定植與感染的問題，有報道發(fā)現(xiàn)PCR聯(lián)合G試驗可以區(qū)分定植和感染［30］。目前mNGS與PCR技術(shù)在對PCP診斷能力上的對比研究較少，存在一定的爭議。Liu等［31］的研究發(fā)現(xiàn)，mNGS與PCR的靈敏度和特異度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Chen等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，PCR的靈敏度（84.85%）與mNGS（85.86%）相似，而特異度與mNGS相同。而Li等［33］則認為mNGS在靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值上均優(yōu)于PCR技術(shù)。Xie等［34］評估了mNGS在HIV合并肺部混合感染患者中的診斷效能，其中檢出的前三種病原體分別為EB病毒（43例）、巨細胞病毒（34例）、肺孢子菌（33例），結(jié)果提示mNGS在真菌檢測中的正確率高于傳統(tǒng)檢測方法。在臨床中PCP常發(fā)生于免疫低下人群，易出現(xiàn)以合并病毒感染（EB病毒、巨細胞病毒等）為主的多重肺部感染，建議當(dāng)考慮存在肺孢子菌感染時，應(yīng)盡早行包含肺孢子菌在內(nèi)的真菌PCR聯(lián)合呼吸道病毒檢測或mNGS檢測。1.5

肺毛霉菌?。悍蚊咕∈呛币姷摹⒅滤缆瘦^高的IPM。研究表明，我國毛霉菌感染的病死率高達37.2%［35］。毛霉菌的診斷以直接鏡檢、培養(yǎng)和組織病理學(xué)為主，存在著靈敏度低、特異度差、等待時間長等問題。由于在組織病理學(xué)中曲霉菌與毛霉菌難以區(qū)分，從而導(dǎo)致誤診的情況時有發(fā)生［36］。由于毛霉菌細胞壁不含（1，3）-β-D葡聚糖，導(dǎo)致G試驗難以提示毛霉菌感染。法國一項前瞻性研究發(fā)現(xiàn)PCR的診斷能力從2012年的16%上升至2022年的91%［37］。雖然PCR擁有較高的病原微生物診斷能力，但PCR需要預(yù)先推測病原體，而毛霉菌等罕見病原體往往不被首先推測，在一定程度上延長了診斷時間。相比之下，mNGS無須推測潛在病原體，可以更快、更早，無偏倚地明確罕見病原體及混合感染，并可將病原菌鑒定至屬種級別，這對臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。Zhang等［38］報道了通過mNGS診斷的13例合并血液系統(tǒng)腫瘤的毛霉菌感染病例，其中7例檢出合并細菌感染，5例檢出合并病毒感染。毛霉菌感染為罕見真菌感染，傳統(tǒng)檢測方法檢測手段較少，且陽性率低。另外，由于市場驅(qū)動性等原因，毛霉菌PCR試劑盒較為少見，而mNGS能更早、更精準(zhǔn)地檢出此類罕見病原體，在肺毛霉菌病的病原體檢測中占有舉足輕重的地位。2新型分子診斷方法的不足以mNGS為代表的新型分子診斷方法在IPM的診斷中表現(xiàn)出不俗優(yōu)勢。然而，該方法存在一些不足。（1）宿主因素干擾：呼吸道樣本通常含有大量的人類核酸，降低了對低豐度病原體檢測的靈敏度［39］。（2）核酸污染：采集標(biāo)本、運輸標(biāo)本、處理標(biāo)本過程中的不規(guī)范，以及實驗者身體、實驗室環(huán)境和所需試劑的干擾，都可能出現(xiàn)核酸污染，進而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生［40］。（3）核酸提取困難：由于破壁困難的因素，曲霉菌、毛霉菌和隱球菌等真菌感染存在出現(xiàn)假陰性的可能，目前可采用物理破壁、機械破壁、化學(xué)破壁或者多種破壁方法聯(lián)合應(yīng)用的手段，在一定程度上提高破壁困難病原菌的檢出率［17］。（4）結(jié)果解讀的欠規(guī)范：由于上述因素的制約，以及定植與感染區(qū)分存在一定難度等因素的影響，使得對于mNGS結(jié)果的解讀更加困難。區(qū)分定植與感染可參考mNGS結(jié)果中病原菌的序列數(shù)、相對豐度，并需要結(jié)合患者的臨床特征、免疫狀態(tài)和其他檢測方法的結(jié)果［41］。（5）價格昂貴：單次mNGS檢測的成本約為3000元人民幣，高于任何單一的傳統(tǒng)病原體檢測方法（培養(yǎng)試驗為600～700元，CrAg檢測約為320元，血清學(xué)GM試驗約為600元，G試驗約為200元），成為限制該法在臨床中應(yīng)用的主要原因之一［42］。3前沿技術(shù)近年來，新型技術(shù)如納米技術(shù)、人工智能技術(shù)在各個領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，現(xiàn)已逐漸應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。由于納米顆粒獨特的物理、化學(xué)和光學(xué)的理化性質(zhì)，使得該技術(shù)具有較高的靈敏度與特異度，可用于復(fù)雜感染的診斷［43］。Wang等［44］的研究顯示，基于納米顆粒的橫向流動生物傳感器可用于檢測白色念珠菌，與傳統(tǒng)臨床檢測方法相比，該法的診斷正確率達100%。人工智能是如今的熱點話題，在肺部感染領(lǐng)域，根據(jù)胸部影像學(xué)早期診斷新型冠狀病毒感染時表現(xiàn)優(yōu)異。Wang等［45］構(gòu)建的DL模型通過對2447例新型冠狀病毒感染患者的CT數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)學(xué)習(xí)，經(jīng)過訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)該算法模型對新型冠狀病毒感染患者診斷的靈敏度為92%，特異度為85%。Mei等［46］收集了905例患者的胸部CT和臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用人工智能識別新型冠狀病毒感染患者受試者操作特征曲線的曲線下面積為0.92，并且其診斷靈敏度與高級胸部放射科醫(yī)生相當(dāng)。目前各級醫(yī)院在區(qū)分真菌感染的定植與感染時缺乏統(tǒng)一性，隨著人工智能技術(shù)的發(fā)展，有望克服人工區(qū)分時存在的