微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范一、概述

微生物檢驗(yàn)是確保產(chǎn)品質(zhì)量、食品安全及環(huán)境安全的重要手段。本規(guī)范旨在提供一套標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，以規(guī)范微生物檢驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。規(guī)范內(nèi)容涵蓋檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備、樣品處理、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及結(jié)果分析等關(guān)鍵步驟，適用于各類微生物檢驗(yàn)工作。

二、檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備

（一）環(huán)境要求

1.檢驗(yàn)環(huán)境應(yīng)在潔凈、通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，避免交叉污染。

2.實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)定期使用75%乙醇或消毒劑進(jìn)行清潔消毒。

3.工作人員需佩戴潔凈工作服、口罩和手套，操作前后需洗手消毒。

（二）設(shè)備與試劑

1.主要設(shè)備：高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、顯微鏡、菌落計(jì)數(shù)器等。

2.試劑：無菌生理鹽水、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂（TSB）等。

3.設(shè)備需定期校準(zhǔn)，確保運(yùn)行正常。

（三）培養(yǎng)基制備

1.按照標(biāo)準(zhǔn)配方稱量培養(yǎng)基原料，如營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

2.將培養(yǎng)基溶解后分裝至無菌培養(yǎng)皿或試管中。

3.高壓滅菌（通常121℃，15-20分鐘）。

4.冷卻后備用，培養(yǎng)皿需倒置放置以防水分蒸發(fā)。

三、樣品處理

（一）樣品采集

1.使用無菌采樣工具（如無菌棉簽、取樣勺）采集樣品。

2.采集部位應(yīng)隨機(jī)分布，避免污染。

3.樣品量應(yīng)滿足檢驗(yàn)需求（如液體樣品5mL，固體樣品10g）。

（二）樣品前處理

1.液體樣品：混勻后取適量稀釋。

2.固體樣品：剪碎混勻，取適量加入無菌生理鹽水中研磨。

3.稀釋系列：采用梯度稀釋法（如10?1、10?2、10?3等），確保菌落計(jì)數(shù)在30-300CFU/mL范圍內(nèi)。

四、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

（一）培養(yǎng)條件

1.將處理后的樣品接種至無菌培養(yǎng)基上，每皿接種0.1mL-1mL。

2.培養(yǎng)溫度：35-37℃，培養(yǎng)時(shí)間18-24小時(shí)。

3.嗜冷菌檢驗(yàn)需在25-28℃培養(yǎng)。

（二）菌落計(jì)數(shù)

1.選用平板計(jì)數(shù)法（MPN法或平板法）。

2.平板法：計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算CFU/g或CFU/mL。

3.MPN法：根據(jù)稀釋液和培養(yǎng)管中的菌落數(shù)，查表計(jì)算估計(jì)值。

五、結(jié)果分析

（一）菌落形態(tài)觀察

1.使用顯微鏡觀察菌落大小、顏色、邊緣形態(tài)等特征。

2.必要時(shí)進(jìn)行革蘭染色，區(qū)分革蘭氏陽性菌和陰性菌。

（二）數(shù)據(jù)記錄與報(bào)告

1.記錄菌落數(shù)、稀釋倍數(shù)及檢驗(yàn)時(shí)間。

2.結(jié)果以CFU/g或CFU/mL表示，超過標(biāo)準(zhǔn)限值需標(biāo)注。

3.編制檢驗(yàn)報(bào)告，注明樣品類型、檢驗(yàn)方法及結(jié)論。

六、注意事項(xiàng)

（一）無菌操作

1.所有接觸樣品的工具和容器必須無菌。

2.操作過程中避免空氣流動(dòng)，減少污染風(fēng)險(xiǎn)。

（二）安全防護(hù)

1.污染培養(yǎng)基需高壓滅菌后丟棄。

2.操作完成后徹底清潔消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及設(shè)備。

（三）質(zhì)量控制

1.每批檢驗(yàn)需使用陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

2.定期進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

一、概述

微生物檢驗(yàn)是確保產(chǎn)品質(zhì)量、食品安全及環(huán)境安全的重要手段。本規(guī)范旨在提供一套標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，以規(guī)范微生物檢驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。規(guī)范內(nèi)容涵蓋檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備、樣品處理、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及結(jié)果分析等關(guān)鍵步驟，適用于各類微生物檢驗(yàn)工作。

本規(guī)范強(qiáng)調(diào)操作的嚴(yán)謹(jǐn)性、無菌控制和細(xì)節(jié)管理，以最大限度地減少人為誤差和環(huán)境污染。所有檢驗(yàn)人員必須經(jīng)過培訓(xùn)并熟悉本規(guī)范，嚴(yán)格按照流程執(zhí)行。檢驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢棄物需按無菌和生物安全要求處理，以防止交叉污染和安全事故。

二、檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備

（一）環(huán)境要求

1.檢驗(yàn)環(huán)境：應(yīng)在生物安全柜內(nèi)或經(jīng)過認(rèn)證的潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。生物安全柜應(yīng)定期進(jìn)行性能驗(yàn)證（如風(fēng)量、風(fēng)速、沉降菌測(cè)試），確保運(yùn)行符合要求。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)使用中性清潔劑和消毒劑（如70-75%乙醇或含氯消毒液）每日至少清潔消毒兩次，并在每次使用后進(jìn)行表面消毒。

2.空氣凈化：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持正壓，空氣過濾系統(tǒng)應(yīng)定期檢查和維護(hù)，確?？諝鉂崈舳取２僮鲄^(qū)域應(yīng)盡量減少不必要的人員走動(dòng)，以降低空氣擾動(dòng)。

3.溫濕度控制：實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)維持在18-26℃，相對(duì)濕度控制在40%-60%。培養(yǎng)箱等設(shè)備應(yīng)放置在遠(yuǎn)離熱源和陽光直射的位置，確保其工作穩(wěn)定。

（二）設(shè)備與試劑

1.主要設(shè)備：

(1)高壓滅菌鍋：應(yīng)能承受至少121℃、15磅/英寸2（約1.05kg/cm2）壓力。使用前需檢查壓力表、安全閥是否正常，定期進(jìn)行滅菌效果驗(yàn)證（如使用嗜熱脂肪芽孢菌片）。

(2)培養(yǎng)箱：需配備溫控器，能精確維持35-37℃（常規(guī)菌）或特定溫度（如25-28℃用于嗜冷菌）。使用前需進(jìn)行空載校準(zhǔn)，定期檢查溫度均勻性。

(3)超凈工作臺(tái)/生物安全柜：使用前需進(jìn)行紫外線照射消毒30分鐘，然后開啟通風(fēng)15-30分鐘，檢查風(fēng)速和過濾效果。

(4)顯微鏡：應(yīng)配備不同倍數(shù)物鏡，用于菌落形態(tài)觀察和革蘭染色后細(xì)菌鑒定。

(5)菌落計(jì)數(shù)器：電子或手動(dòng)計(jì)數(shù)器，需定期校準(zhǔn)以確保計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

(6)天平：精度達(dá)到0.1g，用于稱量培養(yǎng)基和樣品。

(7)恒溫水浴鍋：用于樣品處理（如研磨）或試劑加熱。

2.試劑與培養(yǎng)基：

(1)無菌生理鹽水：使用前需確認(rèn)包裝完好，未開封或經(jīng)高壓滅菌處理。用于樣品稀釋和沖洗。

(2)營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用于通用菌的分離和培養(yǎng)。需按說明書比例稱量、溶解、分裝、高壓滅菌。

(3)胰酪大豆胨瓊脂（TSB）：用于增菌和保存。需按說明書比例稱量、溶解、分裝、高壓滅菌。

(4)革蘭氏染色試劑：包括結(jié)晶紫、碘液、酒精脫色劑、復(fù)紅。需檢查試劑有效期和濃度，按標(biāo)準(zhǔn)流程使用。

(5)其他特定培養(yǎng)基：根據(jù)檢驗(yàn)對(duì)象選擇，如沙氏培養(yǎng)基（用于真菌）、血瓊脂（用于需氧菌增菌或鑒定）等。所有培養(yǎng)基制備后均需進(jìn)行無菌試驗(yàn)和凝固性檢查。

3.個(gè)人防護(hù)用品（PPE）：

(1)潔凈工作服：進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿戴，避免污染。

(2)口罩：能有效遮蓋口鼻，操作時(shí)佩戴。

(3)無菌手套：接觸樣品、培養(yǎng)基等操作時(shí)佩戴，一次性使用，用后立即丟棄。

(4)護(hù)目鏡/面屏：操作可能產(chǎn)生飛濺時(shí)佩戴，保護(hù)眼睛和面部。

（三）培養(yǎng)基制備（詳細(xì)步驟）

1.稱量：根據(jù)培養(yǎng)基總重量和所需配方，精確稱量各組分（如瓊脂粉、蛋白胨、牛肉提取物等）。例如，制備1L營(yíng)養(yǎng)瓊脂，通常稱量15g瓊脂粉和20g蛋白胨、10g牛肉提取物。

2.溶解：將稱量好的組分加入適量蒸餾水或去離子水中，在攪拌器上攪拌或加熱助溶，直至完全溶解。確保無沉淀或未融化的瓊脂顆粒。

3.分裝：待培養(yǎng)基冷卻至60-65℃（不燙手）時(shí)，將其倒入無菌培養(yǎng)皿（約15-20mL/皿）或無菌試管/三角瓶中。分裝量應(yīng)考慮冷卻后培養(yǎng)基收縮及培養(yǎng)時(shí)菌落生長(zhǎng)空間。

4.無菌封口與滅菌：對(duì)于試管，用棉塞或硅膠塞封口；對(duì)于三角瓶，可用牛皮紙封口或直接高壓滅菌。高壓滅菌參數(shù)通常為121℃、15-20分鐘。注意排盡瓶?jī)?nèi)空氣，防止培養(yǎng)基爆沸。

5.冷卻與儲(chǔ)存：滅菌后，將培養(yǎng)皿倒置放置在超凈工作臺(tái)或無菌環(huán)境中冷卻至室溫。試管可靜置冷卻。冷卻后的培養(yǎng)基應(yīng)密封保存于4℃冰箱，標(biāo)注名稱、制備日期和有效期（通常為2-4周）。

三、樣品處理

（一）樣品采集

1.采樣工具：必須使用無菌采樣工具，如無菌棉簽（不同規(guī)格）、無菌取樣勺/鏟、無菌注射器等。采樣工具使用前需在酒精燈火焰上燒灼滅菌或使用一次性無菌工具。

2.采樣計(jì)劃：根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠诽匦?，制定采樣?jì)劃。確保樣品能代表整體批次的狀況。采樣點(diǎn)應(yīng)具有代表性，如液體樣品取不同批次、不同位置；固體樣品取表面、內(nèi)部、不同包裝等。

3.樣品量：采集的樣品量應(yīng)足以進(jìn)行所有必要的檢驗(yàn)項(xiàng)目，并留有備份。參考如下示例：

(1)液體食品（如飲料、醬料）：每份樣品取5mL-10mL。

(2)固體食品（如肉制品、糕點(diǎn)）：每份樣品取10g-20g。

(3)空氣樣品：使用撞擊式采樣器，撞擊面積通常為38cm2。

(4)表面樣品：使用無菌棉簽擦拭規(guī)定面積（如5cmx5cm）。

4.樣品標(biāo)識(shí)與保存：采集的樣品應(yīng)立即貼上標(biāo)簽，注明樣品名稱、編號(hào)、采集日期、采集人等信息。根據(jù)樣品類型和待檢微生物，選擇合適的保存條件（如4℃冷藏、冷凍或加入無菌稀釋液）。盡快進(jìn)行檢驗(yàn)，一般不超過4-6小時(shí)。

（二）樣品前處理（詳細(xì)步驟）

1.液體樣品處理：

(1)混勻：輕輕搖動(dòng)或攪拌樣品，確保均勻。

(2)稀釋：根據(jù)初步估計(jì)的污染水平，選擇合適的稀釋液（通常是無菌生理鹽水）進(jìn)行系列稀釋。例如：

-取1mL樣品加入9mL生理鹽水中，混勻（10?1稀釋）。

-取1mL10?1稀釋液加入9mL生理鹽水中，混勻（10?2稀釋）。

-依此類推，直至稀釋液中的菌落數(shù)在30-300CFU/mL范圍內(nèi)。

(3)取樣接種：根據(jù)后續(xù)檢驗(yàn)方法（平板法或MPN法）和所需接種量，從合適的稀釋梯度中取0.1mL-1mL樣品接種至培養(yǎng)基。

2.固體樣品處理：

(1)剪碎混勻：對(duì)于大塊固體樣品（如肉塊、蔬菜），將其剪成小塊（約2-5mm），充分混勻。

(2)選擇性稀釋：取10g-20g樣品加入90mL-180mL無菌生理鹽水中，使用組織搗碎器或研缽充分研磨，制成勻漿。此勻漿液可作為10?1稀釋液。

(3)稀釋系列制備：參照液體樣品處理方法，對(duì)勻漿液進(jìn)行系列稀釋。

3.表面樣品處理：

(1)擦拭：將無菌棉簽在樣品表面按規(guī)定方式擦拭（如旋轉(zhuǎn)擦拭5次），確保棉簽充分吸收表面微生物。

(2)洗脫：將棉簽放入含有一定體積無菌生理鹽水（如10mL）的試管中，使用無菌玻璃珠或勻漿器充分振蕩洗脫。

(3)稀釋：取適量洗脫液進(jìn)行系列稀釋。

4.嗜冷菌處理：對(duì)于檢驗(yàn)嗜冷菌（如某些李斯特菌），樣品采集后應(yīng)立即在4℃條件下處理，并使用適合嗜冷菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基（如TSB或特殊嗜冷菌培養(yǎng)基），在25-28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

四、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

（一）培養(yǎng)條件

1.接種：根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目和稀釋倍數(shù)，將樣品接種至合適的無菌培養(yǎng)基中。

(1)平板法：將0.1mL-0.2mL稀釋液滴加到無菌培養(yǎng)皿中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，使用無菌玻璃刮刀或涂布棒均勻涂布。

(2)顯微鏡接種：對(duì)于鏡檢，將樣品涂布在載玻片上，干燥后染色。

(3)增菌培養(yǎng)：將樣品接種至TSB等增菌液中，用于提高目標(biāo)菌濃度。

2.培養(yǎng)箱培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)皿或試管放入培養(yǎng)箱中。

(1)溫度：根據(jù)待檢微生物種類設(shè)定培養(yǎng)溫度。常用溫度為35-37℃（需氧菌），35-30℃（兼性厭氧菌），25-28℃（嗜冷菌）。使用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，確保穩(wěn)定。

(2)時(shí)間：培養(yǎng)時(shí)間通常為18-24小時(shí)，某些特殊微生物（如分枝桿菌）可能需要48-72小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)束后檢查培養(yǎng)基顏色和透明度。

3.嗜冷菌特殊培養(yǎng)：如前所述，在較高溫度（如25-28℃）下培養(yǎng)，并可能需要更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間（如48小時(shí)）。

（二）菌落計(jì)數(shù)（詳細(xì)步驟）

1.平板計(jì)數(shù)法（典型平板法）：

(1)觀察與選擇：培養(yǎng)后，觀察平板上菌落的生長(zhǎng)情況。選擇菌落數(shù)在30-300個(gè)/皿的稀釋液平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。若菌落數(shù)過多，需進(jìn)行下一級(jí)稀釋后再計(jì)數(shù)；若菌落數(shù)過少，則需計(jì)數(shù)原始稀釋液或更高稀釋度的平板（根據(jù)實(shí)際稀釋倍數(shù)計(jì)算）。

(2)計(jì)數(shù)：采用菌落計(jì)數(shù)器逐個(gè)計(jì)數(shù)選定平板上的獨(dú)立菌落。對(duì)于難以區(qū)分的連片菌落，可挑取部分進(jìn)行分離。

(3)計(jì)算：CFU/g或CFU/mL=(平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/接種量（mL或g）。例如，在10?3稀釋液中，1個(gè)平板計(jì)數(shù)為50CFU，接種量為0.1mL，則細(xì)菌數(shù)為(50×103)/0.1=5×10?CFU/mL。

2.轉(zhuǎn)移平板法（用于選擇特定菌落）：

(1)操作：在菌落計(jì)數(shù)前，將平板上的單個(gè)菌落用接種環(huán)或涂布棒挑取，轉(zhuǎn)移到新的無菌平板上，進(jìn)行劃線分離或點(diǎn)種。

(2)目的：用于獲得純培養(yǎng)物，用于后續(xù)鑒定或藥敏試驗(yàn)。

3.MPN（MostProbableNumber，最可能數(shù)）法：

(1)適用：適用于樣品中微生物數(shù)量較低，難以在平板上形成可見菌落的情況，常用于水樣或食品中大腸菌群等的估計(jì)。

(2)操作：將三個(gè)不同稀釋度的樣品分別接種于三個(gè)裝有液體培養(yǎng)基（如MPN肉湯管）的試管中。同時(shí)設(shè)置三個(gè)不接種樣品的空白對(duì)照管。培養(yǎng)后，記錄每個(gè)管中是否有菌生長(zhǎng)（陽性或陰性）。

(3)查表計(jì)算：根據(jù)各稀釋度管的陽性/陰性結(jié)果，查閱MPN表（根據(jù)所用培養(yǎng)基和稀釋度），得到該樣品的MPN估計(jì)值（單位通常是MPN/100mL或MPN/g）。

五、結(jié)果分析

（一）菌落形態(tài)觀察

1.宏觀觀察：記錄菌落的大小、形狀（圓形、橢圓形等）、顏色（白色、黃色、粉色等）、邊緣形態(tài)（光滑、粗糙、絲狀）、表面光澤（濕潤(rùn)、干燥、黏液狀）、透明度（透明、半透明、不透明）以及培養(yǎng)特性（如產(chǎn)氣、溶血）。

2.顯微鏡檢查：制備菌懸液（革蘭染色或美蘭染色），在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)（球狀、桿狀、螺旋狀）、大小、顏色（革蘭染色后G?為紫色，G?為紅色）、排列方式（單個(gè)、成對(duì)、鏈狀、簇狀）以及特殊結(jié)構(gòu)（如莢膜、鞭毛、芽孢）。

3.鑒定線索：結(jié)合菌落形態(tài)和顯微鏡下的菌體形態(tài)，初步判斷可能的微生物種類。例如，葡萄狀、成對(duì)或鏈狀的球菌可能是鏈球菌屬；桿狀菌、兩端鈍圓可能是大腸桿菌；絲狀菌可能是放線菌屬。

（二）數(shù)據(jù)記錄與報(bào)告

1.數(shù)據(jù)記錄：詳細(xì)記錄檢驗(yàn)過程中的所有信息，包括：

(1)樣品信息：來源、編號(hào)、類型、采集日期等。

(2)檢驗(yàn)項(xiàng)目：具體的微生物指標(biāo)。

(3)檢驗(yàn)方法：所使用的培養(yǎng)基、稀釋液、培養(yǎng)條件、計(jì)數(shù)方法等。

(4)檢驗(yàn)結(jié)果：各指標(biāo)的菌落數(shù)或MPN值、菌落形態(tài)特征、顯微鏡觀察結(jié)果等。

(5)質(zhì)量控制：陽性對(duì)照、陰性對(duì)照的結(jié)果。

2.報(bào)告編制：根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，按照實(shí)驗(yàn)室報(bào)告模板編制檢驗(yàn)報(bào)告。報(bào)告內(nèi)容應(yīng)包括：

(1)樣品標(biāo)識(shí)信息。

(2)檢驗(yàn)?zāi)康暮晚?xiàng)目。

(3)檢驗(yàn)依據(jù)（如內(nèi)部SOP、參考方法）。

(4)檢驗(yàn)過程簡(jiǎn)述（關(guān)鍵步驟）。

(5)檢驗(yàn)結(jié)果（明確指出是否合格，如菌落數(shù)低于/高于某個(gè)限值）。

(6)菌落形態(tài)特征描述。

(7)結(jié)論和建議（如有必要，如需進(jìn)一步鑒定或采取控制措施）。

(8)檢驗(yàn)人、審核人簽名及日期。

3.結(jié)果解釋：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)限值或客戶要求，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解釋。例如，若大腸菌群MPN值超過標(biāo)準(zhǔn)限值，則表明樣品衛(wèi)生狀況可能存在問題。

六、注意事項(xiàng)

（一）無菌操作

1.環(huán)境控制：在超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行所有無菌操作。操作前開啟通風(fēng)，確保潔凈環(huán)境。

2.工具使用：所有接觸樣品和培養(yǎng)基的工具必須無菌。使用前檢查包裝完整性，必要時(shí)高壓滅菌。使用一次性無菌工具可減少污染風(fēng)險(xiǎn)。

3.手部衛(wèi)生：操作前必須用肥皂和流動(dòng)水洗手，并用70-75%乙醇消毒。避免手直接接觸培養(yǎng)基和樣品。

4.培養(yǎng)皿處理：傾倒培養(yǎng)基時(shí)避免培養(yǎng)基濺出皿外。培養(yǎng)皿應(yīng)倒置放置，防止冷凝水滴落污染菌落。

5.去除污染：操作過程中如發(fā)生污染（如培養(yǎng)基被污染），應(yīng)立即停止檢驗(yàn)，分析污染原因，并對(duì)受影響的培養(yǎng)基、設(shè)備進(jìn)行徹底清潔消毒或廢棄處理。

（二）安全防護(hù)

1.污染物處理：所有可能被微生物污染的廢棄物（如培養(yǎng)基、試管、手套等）必須先高壓滅菌（121℃，15-20分鐘）后才能丟棄。銳器（如接種環(huán)、針頭）應(yīng)放入銳器盒中。

2.消毒：操作結(jié)束后，使用合適的消毒劑（如70-75%乙醇或含氯消毒液）清潔工作臺(tái)面、設(shè)備表面及地面。定期對(duì)生物安全柜進(jìn)行表面消毒和空氣濾網(wǎng)更換。

3.個(gè)人防護(hù)：根據(jù)操作風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，佩戴適當(dāng)級(jí)別的個(gè)人防護(hù)用品（PPE）。處理潛在生物危害樣品時(shí)，應(yīng)佩戴防護(hù)服、手套、口罩，必要時(shí)佩戴護(hù)目鏡或面屏。

（三）質(zhì)量控制

1.陽性對(duì)照：每次檢驗(yàn)批必須設(shè)置陽性對(duì)照，接種已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)菌（如大腸桿菌），確保培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等能支持目標(biāo)微生物生長(zhǎng)。陽性對(duì)照結(jié)果應(yīng)為陽性，否則檢驗(yàn)無效。

2.陰性對(duì)照：設(shè)置無菌對(duì)照（未接種樣品的培養(yǎng)基），檢驗(yàn)過程是否存在污染。陰性對(duì)照結(jié)果應(yīng)為無菌或無污染菌落，否則檢驗(yàn)無效。

3.內(nèi)部質(zhì)控：定期使用內(nèi)部質(zhì)控菌株，檢驗(yàn)檢驗(yàn)方法和設(shè)備的可靠性。記錄并分析質(zhì)控結(jié)果，發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)調(diào)查和糾正。

4.室內(nèi)實(shí)驗(yàn)：定期參加實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)（如能力驗(yàn)證計(jì)劃），與其他實(shí)驗(yàn)室比較檢驗(yàn)結(jié)果，評(píng)估自身檢驗(yàn)水平。

5.記錄審核：所有檢驗(yàn)記錄必須真實(shí)、完整、及時(shí)，并由專人定期審核，確保記錄的準(zhǔn)確性和規(guī)范性。

一、概述

微生物檢驗(yàn)是確保產(chǎn)品質(zhì)量、食品安全及環(huán)境安全的重要手段。本規(guī)范旨在提供一套標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，以規(guī)范微生物檢驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。規(guī)范內(nèi)容涵蓋檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備、樣品處理、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及結(jié)果分析等關(guān)鍵步驟，適用于各類微生物檢驗(yàn)工作。

二、檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備

（一）環(huán)境要求

1.檢驗(yàn)環(huán)境應(yīng)在潔凈、通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，避免交叉污染。

2.實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)定期使用75%乙醇或消毒劑進(jìn)行清潔消毒。

3.工作人員需佩戴潔凈工作服、口罩和手套，操作前后需洗手消毒。

（二）設(shè)備與試劑

1.主要設(shè)備：高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、顯微鏡、菌落計(jì)數(shù)器等。

2.試劑：無菌生理鹽水、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂（TSB）等。

3.設(shè)備需定期校準(zhǔn)，確保運(yùn)行正常。

（三）培養(yǎng)基制備

1.按照標(biāo)準(zhǔn)配方稱量培養(yǎng)基原料，如營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

2.將培養(yǎng)基溶解后分裝至無菌培養(yǎng)皿或試管中。

3.高壓滅菌（通常121℃，15-20分鐘）。

4.冷卻后備用，培養(yǎng)皿需倒置放置以防水分蒸發(fā)。

三、樣品處理

（一）樣品采集

1.使用無菌采樣工具（如無菌棉簽、取樣勺）采集樣品。

2.采集部位應(yīng)隨機(jī)分布，避免污染。

3.樣品量應(yīng)滿足檢驗(yàn)需求（如液體樣品5mL，固體樣品10g）。

（二）樣品前處理

1.液體樣品：混勻后取適量稀釋。

2.固體樣品：剪碎混勻，取適量加入無菌生理鹽水中研磨。

3.稀釋系列：采用梯度稀釋法（如10?1、10?2、10?3等），確保菌落計(jì)數(shù)在30-300CFU/mL范圍內(nèi)。

四、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

（一）培養(yǎng)條件

1.將處理后的樣品接種至無菌培養(yǎng)基上，每皿接種0.1mL-1mL。

2.培養(yǎng)溫度：35-37℃，培養(yǎng)時(shí)間18-24小時(shí)。

3.嗜冷菌檢驗(yàn)需在25-28℃培養(yǎng)。

（二）菌落計(jì)數(shù)

1.選用平板計(jì)數(shù)法（MPN法或平板法）。

2.平板法：計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算CFU/g或CFU/mL。

3.MPN法：根據(jù)稀釋液和培養(yǎng)管中的菌落數(shù)，查表計(jì)算估計(jì)值。

五、結(jié)果分析

（一）菌落形態(tài)觀察

1.使用顯微鏡觀察菌落大小、顏色、邊緣形態(tài)等特征。

2.必要時(shí)進(jìn)行革蘭染色，區(qū)分革蘭氏陽性菌和陰性菌。

（二）數(shù)據(jù)記錄與報(bào)告

1.記錄菌落數(shù)、稀釋倍數(shù)及檢驗(yàn)時(shí)間。

2.結(jié)果以CFU/g或CFU/mL表示，超過標(biāo)準(zhǔn)限值需標(biāo)注。

3.編制檢驗(yàn)報(bào)告，注明樣品類型、檢驗(yàn)方法及結(jié)論。

六、注意事項(xiàng)

（一）無菌操作

1.所有接觸樣品的工具和容器必須無菌。

2.操作過程中避免空氣流動(dòng)，減少污染風(fēng)險(xiǎn)。

（二）安全防護(hù)

1.污染培養(yǎng)基需高壓滅菌后丟棄。

2.操作完成后徹底清潔消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及設(shè)備。

（三）質(zhì)量控制

1.每批檢驗(yàn)需使用陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

2.定期進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

一、概述

微生物檢驗(yàn)是確保產(chǎn)品質(zhì)量、食品安全及環(huán)境安全的重要手段。本規(guī)范旨在提供一套標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，以規(guī)范微生物檢驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。規(guī)范內(nèi)容涵蓋檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備、樣品處理、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及結(jié)果分析等關(guān)鍵步驟，適用于各類微生物檢驗(yàn)工作。

本規(guī)范強(qiáng)調(diào)操作的嚴(yán)謹(jǐn)性、無菌控制和細(xì)節(jié)管理，以最大限度地減少人為誤差和環(huán)境污染。所有檢驗(yàn)人員必須經(jīng)過培訓(xùn)并熟悉本規(guī)范，嚴(yán)格按照流程執(zhí)行。檢驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢棄物需按無菌和生物安全要求處理，以防止交叉污染和安全事故。

二、檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備

（一）環(huán)境要求

1.檢驗(yàn)環(huán)境：應(yīng)在生物安全柜內(nèi)或經(jīng)過認(rèn)證的潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。生物安全柜應(yīng)定期進(jìn)行性能驗(yàn)證（如風(fēng)量、風(fēng)速、沉降菌測(cè)試），確保運(yùn)行符合要求。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)使用中性清潔劑和消毒劑（如70-75%乙醇或含氯消毒液）每日至少清潔消毒兩次，并在每次使用后進(jìn)行表面消毒。

2.空氣凈化：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持正壓，空氣過濾系統(tǒng)應(yīng)定期檢查和維護(hù)，確?？諝鉂崈舳?。操作區(qū)域應(yīng)盡量減少不必要的人員走動(dòng)，以降低空氣擾動(dòng)。

3.溫濕度控制：實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)維持在18-26℃，相對(duì)濕度控制在40%-60%。培養(yǎng)箱等設(shè)備應(yīng)放置在遠(yuǎn)離熱源和陽光直射的位置，確保其工作穩(wěn)定。

（二）設(shè)備與試劑

1.主要設(shè)備：

(1)高壓滅菌鍋：應(yīng)能承受至少121℃、15磅/英寸2（約1.05kg/cm2）壓力。使用前需檢查壓力表、安全閥是否正常，定期進(jìn)行滅菌效果驗(yàn)證（如使用嗜熱脂肪芽孢菌片）。

(2)培養(yǎng)箱：需配備溫控器，能精確維持35-37℃（常規(guī)菌）或特定溫度（如25-28℃用于嗜冷菌）。使用前需進(jìn)行空載校準(zhǔn)，定期檢查溫度均勻性。

(3)超凈工作臺(tái)/生物安全柜：使用前需進(jìn)行紫外線照射消毒30分鐘，然后開啟通風(fēng)15-30分鐘，檢查風(fēng)速和過濾效果。

(4)顯微鏡：應(yīng)配備不同倍數(shù)物鏡，用于菌落形態(tài)觀察和革蘭染色后細(xì)菌鑒定。

(5)菌落計(jì)數(shù)器：電子或手動(dòng)計(jì)數(shù)器，需定期校準(zhǔn)以確保計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

(6)天平：精度達(dá)到0.1g，用于稱量培養(yǎng)基和樣品。

(7)恒溫水浴鍋：用于樣品處理（如研磨）或試劑加熱。

2.試劑與培養(yǎng)基：

(1)無菌生理鹽水：使用前需確認(rèn)包裝完好，未開封或經(jīng)高壓滅菌處理。用于樣品稀釋和沖洗。

(2)營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用于通用菌的分離和培養(yǎng)。需按說明書比例稱量、溶解、分裝、高壓滅菌。

(3)胰酪大豆胨瓊脂（TSB）：用于增菌和保存。需按說明書比例稱量、溶解、分裝、高壓滅菌。

(4)革蘭氏染色試劑：包括結(jié)晶紫、碘液、酒精脫色劑、復(fù)紅。需檢查試劑有效期和濃度，按標(biāo)準(zhǔn)流程使用。

(5)其他特定培養(yǎng)基：根據(jù)檢驗(yàn)對(duì)象選擇，如沙氏培養(yǎng)基（用于真菌）、血瓊脂（用于需氧菌增菌或鑒定）等。所有培養(yǎng)基制備后均需進(jìn)行無菌試驗(yàn)和凝固性檢查。

3.個(gè)人防護(hù)用品（PPE）：

(1)潔凈工作服：進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿戴，避免污染。

(2)口罩：能有效遮蓋口鼻，操作時(shí)佩戴。

(3)無菌手套：接觸樣品、培養(yǎng)基等操作時(shí)佩戴，一次性使用，用后立即丟棄。

(4)護(hù)目鏡/面屏：操作可能產(chǎn)生飛濺時(shí)佩戴，保護(hù)眼睛和面部。

（三）培養(yǎng)基制備（詳細(xì)步驟）

1.稱量：根據(jù)培養(yǎng)基總重量和所需配方，精確稱量各組分（如瓊脂粉、蛋白胨、牛肉提取物等）。例如，制備1L營(yíng)養(yǎng)瓊脂，通常稱量15g瓊脂粉和20g蛋白胨、10g牛肉提取物。

2.溶解：將稱量好的組分加入適量蒸餾水或去離子水中，在攪拌器上攪拌或加熱助溶，直至完全溶解。確保無沉淀或未融化的瓊脂顆粒。

3.分裝：待培養(yǎng)基冷卻至60-65℃（不燙手）時(shí)，將其倒入無菌培養(yǎng)皿（約15-20mL/皿）或無菌試管/三角瓶中。分裝量應(yīng)考慮冷卻后培養(yǎng)基收縮及培養(yǎng)時(shí)菌落生長(zhǎng)空間。

4.無菌封口與滅菌：對(duì)于試管，用棉塞或硅膠塞封口；對(duì)于三角瓶，可用牛皮紙封口或直接高壓滅菌。高壓滅菌參數(shù)通常為121℃、15-20分鐘。注意排盡瓶?jī)?nèi)空氣，防止培養(yǎng)基爆沸。

5.冷卻與儲(chǔ)存：滅菌后，將培養(yǎng)皿倒置放置在超凈工作臺(tái)或無菌環(huán)境中冷卻至室溫。試管可靜置冷卻。冷卻后的培養(yǎng)基應(yīng)密封保存于4℃冰箱，標(biāo)注名稱、制備日期和有效期（通常為2-4周）。

三、樣品處理

（一）樣品采集

1.采樣工具：必須使用無菌采樣工具，如無菌棉簽（不同規(guī)格）、無菌取樣勺/鏟、無菌注射器等。采樣工具使用前需在酒精燈火焰上燒灼滅菌或使用一次性無菌工具。

2.采樣計(jì)劃：根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠诽匦裕贫ú蓸佑?jì)劃。確保樣品能代表整體批次的狀況。采樣點(diǎn)應(yīng)具有代表性，如液體樣品取不同批次、不同位置；固體樣品取表面、內(nèi)部、不同包裝等。

3.樣品量：采集的樣品量應(yīng)足以進(jìn)行所有必要的檢驗(yàn)項(xiàng)目，并留有備份。參考如下示例：

(1)液體食品（如飲料、醬料）：每份樣品取5mL-10mL。

(2)固體食品（如肉制品、糕點(diǎn)）：每份樣品取10g-20g。

(3)空氣樣品：使用撞擊式采樣器，撞擊面積通常為38cm2。

(4)表面樣品：使用無菌棉簽擦拭規(guī)定面積（如5cmx5cm）。

4.樣品標(biāo)識(shí)與保存：采集的樣品應(yīng)立即貼上標(biāo)簽，注明樣品名稱、編號(hào)、采集日期、采集人等信息。根據(jù)樣品類型和待檢微生物，選擇合適的保存條件（如4℃冷藏、冷凍或加入無菌稀釋液）。盡快進(jìn)行檢驗(yàn)，一般不超過4-6小時(shí)。

（二）樣品前處理（詳細(xì)步驟）

1.液體樣品處理：

(1)混勻：輕輕搖動(dòng)或攪拌樣品，確保均勻。

(2)稀釋：根據(jù)初步估計(jì)的污染水平，選擇合適的稀釋液（通常是無菌生理鹽水）進(jìn)行系列稀釋。例如：

-取1mL樣品加入9mL生理鹽水中，混勻（10?1稀釋）。

-取1mL10?1稀釋液加入9mL生理鹽水中，混勻（10?2稀釋）。

-依此類推，直至稀釋液中的菌落數(shù)在30-300CFU/mL范圍內(nèi)。

(3)取樣接種：根據(jù)后續(xù)檢驗(yàn)方法（平板法或MPN法）和所需接種量，從合適的稀釋梯度中取0.1mL-1mL樣品接種至培養(yǎng)基。

2.固體樣品處理：

(1)剪碎混勻：對(duì)于大塊固體樣品（如肉塊、蔬菜），將其剪成小塊（約2-5mm），充分混勻。

(2)選擇性稀釋：取10g-20g樣品加入90mL-180mL無菌生理鹽水中，使用組織搗碎器或研缽充分研磨，制成勻漿。此勻漿液可作為10?1稀釋液。

(3)稀釋系列制備：參照液體樣品處理方法，對(duì)勻漿液進(jìn)行系列稀釋。

3.表面樣品處理：

(1)擦拭：將無菌棉簽在樣品表面按規(guī)定方式擦拭（如旋轉(zhuǎn)擦拭5次），確保棉簽充分吸收表面微生物。

(2)洗脫：將棉簽放入含有一定體積無菌生理鹽水（如10mL）的試管中，使用無菌玻璃珠或勻漿器充分振蕩洗脫。

(3)稀釋：取適量洗脫液進(jìn)行系列稀釋。

4.嗜冷菌處理：對(duì)于檢驗(yàn)嗜冷菌（如某些李斯特菌），樣品采集后應(yīng)立即在4℃條件下處理，并使用適合嗜冷菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基（如TSB或特殊嗜冷菌培養(yǎng)基），在25-28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

四、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

（一）培養(yǎng)條件

1.接種：根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目和稀釋倍數(shù)，將樣品接種至合適的無菌培養(yǎng)基中。

(1)平板法：將0.1mL-0.2mL稀釋液滴加到無菌培養(yǎng)皿中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，使用無菌玻璃刮刀或涂布棒均勻涂布。

(2)顯微鏡接種：對(duì)于鏡檢，將樣品涂布在載玻片上，干燥后染色。

(3)增菌培養(yǎng)：將樣品接種至TSB等增菌液中，用于提高目標(biāo)菌濃度。

2.培養(yǎng)箱培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)皿或試管放入培養(yǎng)箱中。

(1)溫度：根據(jù)待檢微生物種類設(shè)定培養(yǎng)溫度。常用溫度為35-37℃（需氧菌），35-30℃（兼性厭氧菌），25-28℃（嗜冷菌）。使用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，確保穩(wěn)定。

(2)時(shí)間：培養(yǎng)時(shí)間通常為18-24小時(shí)，某些特殊微生物（如分枝桿菌）可能需要48-72小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)束后檢查培養(yǎng)基顏色和透明度。

3.嗜冷菌特殊培養(yǎng)：如前所述，在較高溫度（如25-28℃）下培養(yǎng)，并可能需要更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間（如48小時(shí)）。

（二）菌落計(jì)數(shù)（詳細(xì)步驟）

1.平板計(jì)數(shù)法（典型平板法）：

(1)觀察與選擇：培養(yǎng)后，觀察平板上菌落的生長(zhǎng)情況。選擇菌落數(shù)在30-300個(gè)/皿的稀釋液平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。若菌落數(shù)過多，需進(jìn)行下一級(jí)稀釋后再計(jì)數(shù)；若菌落數(shù)過少，則需計(jì)數(shù)原始稀釋液或更高稀釋度的平板（根據(jù)實(shí)際稀釋倍數(shù)計(jì)算）。

(2)計(jì)數(shù)：采用菌落計(jì)數(shù)器逐個(gè)計(jì)數(shù)選定平板上的獨(dú)立菌落。對(duì)于難以區(qū)分的連片菌落，可挑取部分進(jìn)行分離。

(3)計(jì)算：CFU/g或CFU/mL=(平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/接種量（mL或g）。例如，在10?3稀釋液中，1個(gè)平板計(jì)數(shù)為50CFU，接種量為0.1mL，則細(xì)菌數(shù)為(50×103)/0.1=5×10?CFU/mL。

2.轉(zhuǎn)移平板法（用于選擇特定菌落）：

(1)操作：在菌落計(jì)數(shù)前，將平板上的單個(gè)菌落用接種環(huán)或涂布棒挑取，轉(zhuǎn)移到新的無菌平板上，進(jìn)行劃線分離或點(diǎn)種。

(2)目的：用于獲得純培養(yǎng)物，用于后續(xù)鑒定或藥敏試驗(yàn)。

3.MPN（MostProbableNumber，最可能數(shù)）法：

(1)適用：適用于樣品中微生物數(shù)量較低，難以在平板上形成可見菌落的情況，常用于水樣或食品中大腸菌群等的估計(jì)。

(2)操作：將三個(gè)不同稀釋度的樣品分別接種于三個(gè)裝有液體培養(yǎng)基（如MPN肉湯管）的試管中。同時(shí)設(shè)置三個(gè)不接種樣品的空白對(duì)照管。培養(yǎng)后，記錄每個(gè)管中是否有菌生長(zhǎng)（陽性或陰性）。

(3)查表計(jì)算：根據(jù)各稀釋度管的陽性/陰性結(jié)果，查閱MPN表（根據(jù)所用培養(yǎng)基和稀釋度），得到該樣品的MPN估計(jì)值（單位通常是MPN/100mL或MPN/g）。

五、結(jié)果分析

（一）菌落形態(tài)觀察

1.宏觀觀察：記錄菌落的大小、形狀（圓形、橢圓形等）、顏色（白色、黃色、粉色等）、邊緣形態(tài)（光滑、粗糙、絲狀）、表面光澤（濕潤(rùn)、干燥、黏液狀）、透明度（透明、半透明、不透明）以及培養(yǎng)特性（如產(chǎn)氣、溶血）。

2.顯微鏡檢查：制備菌懸液（革蘭染色或美蘭染色），在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)（球狀、桿狀、螺旋狀）、大小、顏色（革蘭染色后G?為紫色，G?為紅色）、排列方式（單個(gè)、成對(duì)、鏈狀、簇狀）以及特殊結(jié)構(gòu)（如莢膜、鞭毛、芽孢）。

3.鑒定線索：結(jié)合菌落形態(tài)和顯微鏡下的菌體形態(tài)，初步判斷可能的