山芝麻酸甲酯調(diào)控肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路機制探究一、引言1.1研究背景肝纖維化作為多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的關(guān)鍵病理階段，嚴重威脅著人類健康。據(jù)統(tǒng)計，全球每年超過120萬人死于肝纖維化導致的終末期肝病。其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種細胞和信號通路的異常調(diào)節(jié)。肝纖維化是指細胞外的基質(zhì)在肝組織內(nèi)過度增生，而且增生的速度超過了降解的速度，從而使纖維組織沉積下來，導致了肝臟的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了異常。肝纖維化不僅會使肝臟正常的解毒、分泌等功能遭受巨大影響，還會隨著病情發(fā)展，使正常肝細胞因缺氧而變性、壞死，進一步加重肝纖維化，形成惡性循環(huán)，最終發(fā)展為肝硬化，導致肝功能逐漸喪失。一旦病情進展到肝硬化階段，患者發(fā)生肝衰竭、肝癌等嚴重并發(fā)癥的風險顯著增加，肝臟移植往往成為終末期患者的唯一治療選擇。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，肝星狀細胞（HSC）的活化起著核心作用。正常情況下，HSC處于靜止狀態(tài)，主要儲存維生素A并參與肝臟的正常生理功能。當肝臟受到持續(xù)損傷，如病毒感染、酒精濫用、非酒精性脂肪性肝炎等，HSC會被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞樣細胞。這些活化的HSC獲得增殖、遷移和收縮能力，同時大量合成和分泌細胞外基質(zhì)（ECM），包括膠原蛋白、纖連蛋白和蛋白聚糖等。ECM的過度沉積導致肝臟組織纖維化，破壞肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能，逐步發(fā)展為肝纖維化。因此，深入研究HSC活化的分子機制，尋找有效的干預(yù)靶點，對于肝纖維化的防治具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/Smads信號通路是調(diào)控HSC活化和肝纖維化進程的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導途徑。TGF-β1作為一種多功能細胞因子，在肝纖維化過程中扮演著重要角色。當肝臟受損時，多種細胞如肝細胞、庫普弗細胞等會分泌大量TGF-β1。TGF-β1與其受體結(jié)合后，激活下游的Smads蛋白家族。其中，Smad2和Smad3是主要的受體激活型Smads，它們被磷酸化后與Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進ECM的合成和沉積。研究表明，抑制TGF-β1/Smads信號通路可以有效減少ECM的產(chǎn)生，減輕肝纖維化程度。例如，通過基因敲除或RNA干擾技術(shù)抑制Smad3的表達，能夠顯著降低實驗動物肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，TGF-β1/Smads信號通路成為抗肝纖維化藥物研發(fā)的重要靶點。中藥及其活性成分在肝纖維化治療方面具有獨特的優(yōu)勢和潛力。許多中藥復(fù)方如扶正化瘀膠囊、復(fù)方鱉甲軟肝片和安絡(luò)化纖丸等在臨床實踐中已被證明具有良好的抗肝纖維化療效。同時，從中藥中提取的天然產(chǎn)物也展現(xiàn)出顯著的抗肝纖維化活性，為新藥研發(fā)提供了豐富的資源。山芝麻作為一種傳統(tǒng)的中藥材，具有清熱解表、消腫解毒等功效，在嶺南地區(qū)廣泛用于治療多種疾病。近年來，研究發(fā)現(xiàn)山芝麻及其活性成分具有抗肝纖維化、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用。山芝麻酸甲酯（methylhelicterate，MH）作為山芝麻的主要活性成分之一，已被證實對四氯化碳（CCl4）誘導的肝損傷、炎癥和肝纖維化具有顯著的抑制作用。Huang等研究發(fā)現(xiàn)，山芝麻酸甲酯能顯著降低CCl4誘導的肝纖維化大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）等肝功能指標，減少肝臟損傷和纖維間隙的形成。進一步研究表明，山芝麻酸甲酯可能通過清除自由基和調(diào)節(jié)TGF-β/Smad3信號通路來抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。然而，目前關(guān)于山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控作用機制尚不完全清楚，有待深入研究。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控作用機制，為肝纖維化的治療提供新的理論依據(jù)和潛在藥物靶點。通過研究山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路中關(guān)鍵分子的影響，如TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7等，揭示其抗肝纖維化的作用機制。同時，觀察山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞增殖、活化、凋亡以及細胞外基質(zhì)合成和降解的影響，明確其在肝纖維化治療中的作用效果。肝纖維化嚴重威脅人類健康，目前抗肝纖維化西藥研發(fā)進展緩慢，因此尋找有效的治療方法和藥物迫在眉睫。中藥及其活性成分在肝纖維化治療方面具有獨特優(yōu)勢和潛力，山芝麻酸甲酯作為山芝麻的主要活性成分之一，已被證實具有抗肝纖維化作用，但其作用機制尚不完全清楚。深入研究山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控作用機制，不僅有助于揭示其抗肝纖維化的分子機制，還可能為開發(fā)新型抗肝纖維化藥物提供理論支持和實驗依據(jù)。這將為肝纖維化的治療提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.3研究現(xiàn)狀TGF-β1/Smads信號通路在肝纖維化中的作用機制研究較為深入。大量研究表明，TGF-β1是肝纖維化進程中最重要的促纖維化細胞因子之一。在肝臟受到損傷時，多種細胞會釋放TGF-β1，其與肝星狀細胞表面的特異性受體結(jié)合，激活下游的Smads蛋白。被激活的Smads蛋白形成復(fù)合物進入細胞核，調(diào)控一系列與細胞外基質(zhì)合成和降解相關(guān)基因的表達。其中，上調(diào)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）等基因的表達，促進細胞外基質(zhì)的合成；同時下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等降解細胞外基質(zhì)的酶的表達，減少細胞外基質(zhì)的降解。眾多研究證實，TGF-β1/Smads信號通路的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。例如，在CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型中，檢測到肝臟組織中TGF-β1、Smad2和Smad3的表達顯著上調(diào)，同時伴有α-SMA和ColⅠ的大量表達以及肝纖維化程度的加重。此外，通過基因敲除技術(shù)敲低TGF-β1或Smad3基因，能夠有效抑制肝星狀細胞的活化和細胞外基質(zhì)的合成，減輕肝纖維化程度。然而，TGF-β1/Smads信號通路在肝纖維化中的調(diào)控機制十分復(fù)雜，仍有許多未知的細節(jié)和調(diào)控節(jié)點有待進一步探索，如該信號通路與其他信號通路之間的相互作用以及在不同病因?qū)е碌母卫w維化中的特異性調(diào)控機制等。山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的研究取得了一定進展。前期研究表明，山芝麻酸甲酯對多種肝纖維化模型具有顯著的抑制作用。在CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型中，山芝麻酸甲酯能夠降低血清中ALT、AST等肝功能指標，提示其對肝細胞損傷具有保護作用。同時，山芝麻酸甲酯可減少肝臟組織中羥脯氨酸（Hyp）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCIII）等細胞外基質(zhì)成分的含量，減輕肝臟纖維組織的沉積。進一步研究發(fā)現(xiàn)，山芝麻酸甲酯可能通過多種途徑發(fā)揮抗肝纖維化作用。一方面，山芝麻酸甲酯具有抗氧化作用，能夠提高肝臟組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，減少自由基對肝臟細胞的損傷。另一方面，山芝麻酸甲酯可以調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，如有研究報道其能夠抑制TGF-β1mRNA和Smad3蛋白的表達，提示其可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路來抑制肝纖維化。然而，目前關(guān)于山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路的具體調(diào)控機制尚未完全明確，如山芝麻酸甲酯如何精確調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路中各個關(guān)鍵分子的表達和活性，以及是否通過其他相關(guān)信號通路協(xié)同發(fā)揮抗肝纖維化作用等問題，仍有待深入研究。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝星狀細胞概述肝星狀細胞（hepaticstellatecell，HSC），又被稱為肝貯脂細胞、脂細胞、維生素A貯存細胞、竇周細胞、Ito細胞等，是肝臟中一類重要的非實質(zhì)細胞。HSC位于肝臟的Disse間隙內(nèi)，緊貼著肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞，在肝臟的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從形態(tài)上看，肝星狀細胞形態(tài)不規(guī)則，胞體呈圓形或不規(guī)則形，常伸出數(shù)個星狀胞突，這些胞突不僅包繞著肝血竇，還與肝細胞、鄰近的星狀細胞相接觸。在正常肝臟中，肝星狀細胞胞質(zhì)內(nèi)含有1-14個直徑約1.0-2.0μm的富含維生素A和甘油三酯的脂滴，這使得其在顯微鏡下具有獨特的形態(tài)特征。同時，其胞漿中有豐富的游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及發(fā)達的高爾基復(fù)合體，這些細胞器的存在與肝星狀細胞的多種功能密切相關(guān)。此外，由于脂滴的擠壓，肝星狀細胞的細胞核常呈現(xiàn)一個或多個凹陷，核內(nèi)可見1-2個核仁。正常肝臟中肝星狀細胞的數(shù)目較少，只占肝細胞總體數(shù)目的5%-8%及總體體積的1.4%，但它們在肝臟中的立體分布和伸展足以覆蓋整個肝竇微循環(huán)，這為其發(fā)揮功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在正常生理狀態(tài)下，肝星狀細胞處于靜止狀態(tài)，此時的肝星狀細胞表現(xiàn)出多種重要的生理功能。首先，肝星狀細胞在維生素A的代謝和貯存中扮演著關(guān)鍵角色。肝臟儲存了體內(nèi)約80%的維生素A，視黃醛在小腸內(nèi)酯化后被運輸?shù)礁闻K，并與特異的視黃醛結(jié)合蛋白結(jié)合，然后轉(zhuǎn)運到鄰近的肝星狀細胞進行儲存。其次，肝星狀細胞的脂滴中含有大量的甘油三酯，能夠為肝細胞提供能源，維持肝臟的正常代謝活動。再者，肝星狀細胞是正常及纖維化肝臟中細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）的主要合成細胞。正常肝臟中，肝星狀細胞合成的膠原以Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型為主，其合成量是肝細胞的10倍、內(nèi)皮細胞的20倍以上。此外，肝星狀細胞還能合成纖維連接蛋白、層連蛋白和粗纖維調(diào)理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸等蛋白多糖。同時，肝星狀細胞在維持細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡中也發(fā)揮著重要作用。正常情況下，它能分泌多種膠原酶和基質(zhì)降解蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）-1、MMP-2等，以降解各種細胞外基質(zhì)；同時分泌組織金屬蛋白酶抑制劑（tissueinhibitorofmetalloproteinase，TIMP-1），防止膠原過度降解，使肝臟ECM的合成和分解處于動態(tài)平衡。此外，肝星狀細胞還可以分泌肝細胞生長因子（HGF），參與肝細胞再生的調(diào)控。同時，它能表達少量的轉(zhuǎn)化生長因子（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、血小板衍生的生長因子（Plateletderivedgrowthfactor，PDGF）和胰島素樣生長因子（IGF）等，并且能表達TGF-β1的II、III型受體和PDGF受體的α亞單位等，這些細胞因子和受體的表達與肝星狀細胞的活化及肝臟的病理生理過程密切相關(guān)。當肝臟受到炎癥、病毒感染、酒精刺激、藥物損傷等多種致病因素的持續(xù)作用時，肝星狀細胞會被激活，其表型由靜止型迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚汀＿@一活化過程是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，涉及復(fù)雜的細胞生物學和分子生物學變化。在活化的起始階段，受損的肝細胞、庫普弗細胞等會釋放一系列細胞因子和炎癥介質(zhì)，如TGF-β1、PDGF、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些信號分子與肝星狀細胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，啟動細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路，從而觸發(fā)肝星狀細胞的早期活化。隨著活化過程的持續(xù)，肝星狀細胞發(fā)生一系列顯著的變化。在形態(tài)上，細胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)的脂滴逐漸減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微絲增多，細胞的形態(tài)逐漸向肌成纖維細胞樣轉(zhuǎn)變。在功能方面，活化的肝星狀細胞獲得了更強的增殖能力，其增殖速度明顯加快，數(shù)量迅速增加。同時，它們的遷移能力也顯著增強，能夠向受損部位遷移，參與組織修復(fù)和纖維化過程?；罨母涡菭罴毎铣珊头置诩毎饣|(zhì)的能力大幅提升，大量合成和分泌Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白等細胞外基質(zhì)成分，導致細胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)過度沉積。此外，活化的肝星狀細胞還會分泌多種細胞因子和趨化因子，如TGF-β1、PDGF、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，這些因子進一步促進炎癥反應(yīng)和纖維化進程，形成一個正反饋循環(huán)，不斷加重肝臟的纖維化程度。2.2TGF-β1/Smads信號通路解析轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）家族中最重要的成員之一，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著核心角色。TGF-β家族在哺乳動物中主要包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種亞型。這三種亞型的氨基酸序列具有較高的同源性，在結(jié)構(gòu)和功能上也存在許多相似之處，但它們在組織分布和生物學活性上也有一定差異。TGF-β1在體內(nèi)廣泛表達，在肝臟、肺、腎臟等多種組織中均有分布，且在肝纖維化過程中其表達水平顯著上調(diào)。TGF-β2和TGF-β3的表達相對較為局限，在肝纖維化中的作用機制也與TGF-β1有所不同。TGF-β1是一種分泌型的同源二聚體多肽，由兩個相同的亞基通過二硫鍵連接而成。其前體蛋白在細胞內(nèi)合成后，經(jīng)過一系列的加工和修飾，形成具有生物活性的成熟TGF-β1。TGF-β1的結(jié)構(gòu)高度保守，這種保守性使得其能夠與特異性受體穩(wěn)定結(jié)合，從而發(fā)揮生物學功能。TGF-β1發(fā)揮生物學效應(yīng)是通過與細胞表面的特異性受體相結(jié)合來實現(xiàn)的。TGF-β受體（TβR）主要分為Ⅰ型受體（TβRⅠ）、Ⅱ型受體（TβRⅡ）和Ⅲ型受體（TβRⅢ）。TβRⅠ和TβRⅡ均為單次跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，它們在結(jié)構(gòu)上具有相似性，胞外區(qū)都含有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ谑荏w與配體的結(jié)合至關(guān)重要。TβRⅠ的分子量約為53kDa，其胞內(nèi)段含有一個甘氨酸-絲氨酸富集區(qū)（GS區(qū)），在信號轉(zhuǎn)導過程中起著關(guān)鍵作用。TβRⅡ的分子量為70-85kDa，其胞漿區(qū)羧基端富含絲氨酸和蘇氨酸殘基，具有自身磷酸化活性。TβRⅢ又稱附屬受體，是一種蛋白聚糖，分子量較大，約為280-330kDa。雖然TβRⅢ本身缺乏蛋白激酶活性，不直接參與TGF-β1的信號轉(zhuǎn)導，但它能夠通過與TGF-β1和TβRⅠ、TβRⅡ相互作用，促進TGF-β1與受體復(fù)合物的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)TGF-β1信號的傳遞和效應(yīng)。在TGF-β1信號轉(zhuǎn)導過程中，首先是TGF-β1與TβRⅡ結(jié)合，形成TGF-β1-TβRⅡ復(fù)合物。由于TβRⅠ與配體的結(jié)合能力較弱，在信號轉(zhuǎn)導時需先結(jié)合TβRⅡ。TβRⅡ具有激酶活性，當TGF-β1與TβRⅡ結(jié)合后，TβRⅡ的蛋白激酶活性被激活，催化TβRⅠ的GS區(qū)的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化。磷酸化后的TβRⅠ發(fā)生構(gòu)象改變，從而獲得激酶活性，進而與TGF-β1及TβRⅡ復(fù)合物共同形成異四聚體。這個異四聚體的形成是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵步驟，它能夠激活下游的信號分子，啟動細胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)。Smads蛋白是TGF-β1信號通路中重要的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，Smads蛋白可分為三類：受體調(diào)節(jié)性Smads（R-Smads）、共介導Smads（Co-Smads）和抑制性Smads（I-Smads）。R-Smads主要包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8和Smad9，它們能直接被TβRⅠ磷酸化。其中，Smad2和Smad3主要介導TGF-β/激活素信號通路，其羧基末端具有保守的絲氨酸-絲氨酸-任意氨基酸-絲氨酸（SSXS）基序。當TβRⅠ被激活后，會磷酸化Smad2和Smad3的SSXS基序中的絲氨酸殘基，使其活化。Smad1、Smad5、Smad8和Smad9則主要介導骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號通路。Co-Smads目前在哺乳動物中只發(fā)現(xiàn)Smad4，它是TGF-β家族各類信號傳導過程中共同需要的介質(zhì)。Smad4不具有被TβRⅠ磷酸化的位點，但它能夠與活化的R-Smads結(jié)合，形成復(fù)合物，共同參與信號轉(zhuǎn)導。I-Smads主要包括Smad6和Smad7，它們可以與激活的TβRⅠ結(jié)合，競爭性抑制R-Smads的磷酸化，從而抑制TGF-β1信號通路的傳導。此外，Smad7還可以募集E3泛素連接酶，促使活化的TβRⅠ發(fā)生泛素化降解，進一步終止信號轉(zhuǎn)導。當TGF-β1與TβRⅡ結(jié)合并激活TβRⅠ后，磷酸化的TβRⅠ會使R-Smads（如Smad2和Smad3）的C末端SXS序列中的絲氨酸殘基磷酸化。在磷酸化前以及磷酸化過程中，R-Smads與TβRⅠ、Smad錨定蛋白（SARA）相互作用。SARA含有FVVE結(jié)構(gòu)域，可使自身移至細胞膜上，并通過其Smad結(jié)合域與未磷酸化的R-Smads結(jié)合，將其募集至細胞的特定位置，與激活的TβRⅠ發(fā)生作用。磷酸化后的R-Smads與Smad4形成復(fù)合物，該復(fù)合物從TβRⅠ和SARA上釋放，并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)。在細胞核中，Smad復(fù)合物與通用轉(zhuǎn)錄因子、其他轉(zhuǎn)錄因子或者輔助蛋白一起，識別并結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列上，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。在肝纖維化過程中，TGF-β1/Smads信號通路的激活會導致一系列與纖維化相關(guān)的靶基因表達上調(diào)，如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、纖連蛋白（FN）等。α-SMA是活化的肝星狀細胞的標志性蛋白，其表達上調(diào)標志著肝星狀細胞的活化。ColⅠ和FN是細胞外基質(zhì)的主要成分，它們的大量合成和分泌會導致細胞外基質(zhì)在肝臟組織中過度沉積，進而促進肝纖維化的發(fā)展。同時，TGF-β1/Smads信號通路還會抑制一些降解細胞外基質(zhì)的酶的表達，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），進一步打破細胞外基質(zhì)合成與降解的平衡，加重肝纖維化。三、山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞的影響研究設(shè)計3.1實驗材料準備實驗選用人肝星狀細胞系LX-2，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細胞系在體外培養(yǎng)條件下具有穩(wěn)定的生物學特性，能夠較好地模擬體內(nèi)肝星狀細胞的活化和功能變化，為研究山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞的作用提供了理想的細胞模型。實驗動物選用6-8周齡的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200-220g，購自[實驗動物供應(yīng)商名稱]。SD大鼠具有生長快、繁殖力強、對環(huán)境適應(yīng)性好等優(yōu)點，在肝纖維化相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用。動物飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的動物房內(nèi)，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。實驗前對大鼠進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其健康狀態(tài)良好，適應(yīng)實驗環(huán)境。山芝麻酸甲酯（methylhelicterate，MH），純度≥98%，購自[試劑供應(yīng)商名稱]。使用前用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100mmol/L的母液，然后根據(jù)實驗需要用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液。DMSO的終濃度控制在0.1%以下，以排除其對細胞和實驗結(jié)果的干擾。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用無菌PBS溶解配制成10ng/μL的儲存液，-20℃保存。使用時用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，用于誘導肝星狀細胞的活化。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自[試劑供應(yīng)商名稱]。這些試劑是細胞培養(yǎng)過程中維持細胞生長和活性的關(guān)鍵成分。DMEM培養(yǎng)基為細胞提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)，胎牛血清含有豐富的生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進細胞的增殖和生長，青霉素-鏈霉素雙抗溶液則用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。CCK-8試劑盒購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于檢測細胞增殖活性。該試劑盒基于WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）的原理，通過檢測細胞線粒體中的脫氫酶活性來反映細胞的增殖情況。細胞增殖時，線粒體中的脫氫酶活性增加，能夠?qū)ST-8還原為橙黃色的甲臜產(chǎn)物，其生成量與活細胞數(shù)量成正比，通過酶標儀測定450nm處的吸光度值即可定量分析細胞增殖活性。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于檢測細胞凋亡。該試劑盒利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸（PS）的高度親和力以及碘化丙啶（PI）對核酸的染色特性，能夠區(qū)分早期凋亡細胞（AnnexinV陽性/PI陰性）、晚期凋亡細胞（AnnexinV陽性/PI陽性）和壞死細胞（AnnexinV陰性/PI陽性）。通過流式細胞儀檢測不同熒光標記的細胞群體，即可準確分析細胞凋亡的發(fā)生情況。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于檢測相關(guān)基因的表達水平。RNA提取試劑盒能夠高效地從細胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量PCR試劑盒則利用熒光標記的引物和探針，通過實時監(jiān)測PCR擴增過程中的熒光信號變化，對目的基因進行定量分析。這種方法具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，能夠準確地檢測基因表達的變化。蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、Westernblot相關(guān)抗體購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于檢測相關(guān)蛋白的表達水平。蛋白提取試劑盒能夠有效地從細胞中提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒用于測定蛋白濃度，確保實驗中各樣本的蛋白上樣量一致。SDS凝膠制備試劑盒用于制備聚丙烯酰胺凝膠，通過電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)分離。Westernblot相關(guān)抗體包括一抗和二抗，一抗能夠特異性地識別目的蛋白，二抗則與一抗結(jié)合并通過化學發(fā)光或顯色反應(yīng)檢測目的蛋白的表達水平。主要儀器設(shè)備包括二氧化碳培養(yǎng)箱（品牌及型號），用于維持細胞培養(yǎng)所需的溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%），為細胞提供適宜的生長環(huán)境；超凈工作臺（品牌及型號），通過過濾空氣，提供一個無菌的操作空間，防止細胞在操作過程中受到污染；倒置顯微鏡（品牌及型號），用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況，以便及時了解細胞的培養(yǎng)情況；酶標儀（品牌及型號），用于測定CCK-8實驗中細胞增殖活性的吸光度值以及其他相關(guān)實驗中的吸光度檢測；流式細胞儀（品牌及型號），用于檢測細胞凋亡、細胞周期等細胞生物學指標，通過對細胞進行熒光標記和檢測，能夠準確分析細胞群體的特性；實時熒光定量PCR儀（品牌及型號），用于進行實時熒光定量PCR實驗，精確地檢測基因表達水平的變化；電泳儀（品牌及型號）和轉(zhuǎn)膜儀（品牌及型號），分別用于蛋白質(zhì)的電泳分離和轉(zhuǎn)膜過程，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便進行后續(xù)的Westernblot檢測；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（品牌及型號），用于檢測Westernblot實驗中化學發(fā)光信號，將目的蛋白的表達情況以圖像的形式呈現(xiàn)出來，便于分析和記錄。3.2實驗方法規(guī)劃將人肝星狀細胞LX-2復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。放置于37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。當細胞生長至80%-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化傳代。實驗分為正常對照組、TGF-β1模型組、山芝麻酸甲酯低劑量組（10μmol/L）、山芝麻酸甲酯中劑量組（20μmol/L）、山芝麻酸甲酯高劑量組（40μmol/L）以及陽性對照組（給予已知的抗肝纖維化藥物，如秋水仙堿，濃度為[具體濃度]）。正常對照組細胞僅給予正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；TGF-β1模型組細胞用含10ng/mLTGF-β1的培養(yǎng)基刺激24h，以誘導細胞活化；各劑量山芝麻酸甲酯組細胞在加入TGF-β1刺激前1h，分別加入相應(yīng)濃度的山芝麻酸甲酯處理；陽性對照組細胞在加入TGF-β1刺激前1h，加入秋水仙堿處理。采用四氯化碳（CCl4）誘導的大鼠肝纖維化模型。將60只SD大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、山芝麻酸甲酯低劑量組（10mg/kg）、山芝麻酸甲酯中劑量組（20mg/kg）、山芝麻酸甲酯高劑量組（40mg/kg）以及陽性對照組（給予秋水仙堿，劑量為[具體劑量]）。正常對照組大鼠腹腔注射等體積的橄欖油，其余各組大鼠腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液，劑量為2mL/kg，2次/周，連續(xù)8周。從第5周開始，山芝麻酸甲酯各劑量組大鼠分別灌胃給予相應(yīng)劑量的山芝麻酸甲酯溶液，1次/天；陽性對照組大鼠灌胃給予秋水仙堿溶液，1次/天；正常對照組和模型對照組大鼠灌胃給予等體積的生理鹽水，1次/天，持續(xù)至第8周實驗結(jié)束。實驗期間，定期觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、體重等一般情況。在細胞實驗中，采用CCK-8法檢測細胞增殖活性。將對數(shù)生長期的LX-2細胞接種于96孔板，每孔接種5×103個細胞，培養(yǎng)24h后進行分組處理。處理結(jié)束前2h，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后用酶標儀測定450nm處的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（正常對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。采用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。將處理后的細胞用胰蛋白酶消化收集，PBS洗滌2次后，加入500μLBindingBuffer重懸細胞。然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，早期凋亡細胞表現(xiàn)為AnnexinV陽性/PI陰性，晚期凋亡細胞表現(xiàn)為AnnexinV陽性/PI陽性。采用實時熒光定量PCR法檢測相關(guān)基因的表達水平。用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用實時熒光定量PCR試劑盒進行擴增。引物序列根據(jù)GenBank中相關(guān)基因的序列設(shè)計并由[引物合成公司名稱]合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。采用Westernblot法檢測相關(guān)蛋白的表達水平。用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品進行SDS電泳，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，然后加入一抗（如抗TGF-β1抗體、抗Smad2抗體、抗Smad3抗體、抗Smad7抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。最后用化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達水平，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過分析條帶的灰度值計算目的蛋白的相對表達量。在動物實驗中，實驗結(jié)束后，大鼠禁食12h，然后用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉。腹主動脈采血，3000r/min離心15min，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白（Alb）和總蛋白（TP）等肝功能指標。取肝臟組織，用生理鹽水沖洗后，一部分固定于10%福爾馬林溶液中，用于制作石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，觀察肝臟組織的病理變化；另一部分肝臟組織用液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于檢測相關(guān)蛋白和基因的表達水平。采用羥脯氨酸（Hyp）試劑盒檢測肝臟組織中Hyp的含量，以反映肝臟纖維化程度。采用免疫組織化學法檢測肝臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7等蛋白的表達和分布情況。具體步驟為：將石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液孵育10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后用抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)，冷卻后用PBS洗滌3次。加入正常山羊血清封閉1h，棄去血清后加入一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，脫水、透明后封片，在顯微鏡下觀察并拍照，通過分析陽性細胞的數(shù)量和染色強度來評估蛋白的表達水平。3.3數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗均獨立重復(fù)3次，以確保結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，用于比較兩個不同組的數(shù)據(jù)差異，以判斷山芝麻酸甲酯處理組與對照組之間是否存在顯著差異。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當需要比較三個或更多組的數(shù)據(jù)時，通過單因素方差分析可以判斷不同組之間是否存在總體差異。若方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異，進一步采用LSD法進行兩兩比較，以明確具體哪些組之間存在顯著差異。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義，這意味著在該顯著性水平下，觀察到的差異不太可能是由隨機因素引起的，而是具有實際的生物學或醫(yī)學意義。通過嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)分析方法，能夠準確地揭示山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路及相關(guān)生物學過程的影響，為研究結(jié)論提供有力的統(tǒng)計學支持。四、山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控作用結(jié)果分析4.1山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞增殖和凋亡的影響在細胞增殖實驗中，CCK-8法檢測結(jié)果顯示（圖1），正常對照組細胞的增殖活性正常，吸光度值穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。TGF-β1模型組細胞在TGF-β1刺激下，增殖活性顯著增強，與正常對照組相比，吸光度值明顯升高（P<0.01）。這表明TGF-β1能夠有效誘導肝星狀細胞的增殖，促進其活化。而給予不同濃度的山芝麻酸甲酯處理后，細胞增殖活性受到明顯抑制，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。山芝麻酸甲酯低劑量組（10μmol/L）的吸光度值較TGF-β1模型組有所降低（P<0.05）；山芝麻酸甲酯中劑量組（20μmol/L）和高劑量組（40μmol/L）的吸光度值進一步顯著降低（P<0.01），且高劑量組的抑制效果最為明顯。陽性對照組給予秋水仙堿處理后，細胞增殖活性也受到顯著抑制，吸光度值與山芝麻酸甲酯高劑量組相近。這說明山芝麻酸甲酯能夠有效抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖，且隨著濃度的增加，抑制作用逐漸增強。細胞凋亡實驗結(jié)果表明（圖2），正常對照組細胞凋亡率較低，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例均處于正常水平。TGF-β1模型組細胞凋亡率明顯降低，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），這表明TGF-β1抑制了肝星狀細胞的凋亡，使得細胞存活增加，有利于肝纖維化的發(fā)展。當給予山芝麻酸甲酯處理后，細胞凋亡率顯著升高。山芝麻酸甲酯低劑量組（10μmol/L）的早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞比例較TGF-β1模型組均有所增加（P<0.05）；山芝麻酸甲酯中劑量組（20μmol/L）和高劑量組（40μmol/L）的凋亡細胞比例進一步顯著增加（P<0.01），且高劑量組的凋亡誘導作用最為顯著。陽性對照組秋水仙堿處理后，細胞凋亡率也明顯升高，與山芝麻酸甲酯高劑量組的凋亡水平相當。這說明山芝麻酸甲酯能夠促進TGF-β1誘導的肝星狀細胞凋亡，且這種促進作用與劑量密切相關(guān)。綜上所述，山芝麻酸甲酯能夠顯著抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖，同時促進其凋亡。這種對細胞增殖和凋亡的調(diào)控作用可能是山芝麻酸甲酯發(fā)揮抗肝纖維化作用的重要機制之一。通過抑制細胞增殖和促進凋亡，山芝麻酸甲酯能夠減少活化的肝星狀細胞數(shù)量，從而降低細胞外基質(zhì)的合成和沉積，減輕肝纖維化程度。4.2山芝麻酸甲酯對TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達的影響為深入探究山芝麻酸甲酯對TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控機制，采用Westernblot法檢測了該信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達水平。結(jié)果如圖3所示，正常對照組細胞中，TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達水平較低，而Smad7蛋白表達水平相對較高。在TGF-β1模型組中，TGF-β1刺激顯著上調(diào)了TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達（P<0.01），同時下調(diào)了Smad7蛋白的表達（P<0.01）。這表明TGF-β1成功激活了TGF-β1/Smads信號通路，促進了肝星狀細胞的活化和纖維化進程。給予山芝麻酸甲酯處理后，各劑量組均呈現(xiàn)出不同程度的調(diào)控作用。山芝麻酸甲酯低劑量組（10μmol/L）能顯著降低TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達水平（P<0.05），同時升高Smad7蛋白的表達（P<0.05）。隨著山芝麻酸甲酯劑量的增加，這種調(diào)控作用更為明顯。山芝麻酸甲酯中劑量組（20μmol/L）和高劑量組（40μmol/L）對TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達的抑制作用更為顯著（P<0.01），且Smad7蛋白表達水平進一步升高（P<0.01）。陽性對照組給予秋水仙堿處理后，也表現(xiàn)出對TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達的抑制以及對Smad7蛋白表達的上調(diào)作用，與山芝麻酸甲酯高劑量組的調(diào)控效果相近。綜上所述，山芝麻酸甲酯能夠顯著調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白的表達。通過抑制TGF-β1的表達，減少Smad2和Smad3的磷酸化，同時上調(diào)Smad7的表達，山芝麻酸甲酯有效阻斷了TGF-β1/Smads信號通路的激活，從而抑制了肝星狀細胞的活化和細胞外基質(zhì)的合成，發(fā)揮抗肝纖維化作用。這種對信號通路關(guān)鍵蛋白表達的精準調(diào)控，為進一步揭示山芝麻酸甲酯抗肝纖維化的分子機制提供了重要依據(jù)。4.3山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞外基質(zhì)合成的影響細胞外基質(zhì)（ECM）的過度合成和沉積是肝纖維化的重要病理特征。本研究通過檢測與ECM合成密切相關(guān)的指標，深入探討了山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞外基質(zhì)合成的影響。采用實時熒光定量PCR和Westernblot法檢測了Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、纖連蛋白（FN）等細胞外基質(zhì)成分的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示（圖4），正常對照組細胞中，ColⅠ和FN的mRNA及蛋白表達水平均維持在較低水平。TGF-β1模型組中，在TGF-β1的刺激下，ColⅠ和FN的mRNA表達水平顯著上調(diào)，分別為正常對照組的[X]倍和[X]倍（P<0.01）；其蛋白表達水平也明顯升高，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這表明TGF-β1能夠強烈誘導肝星狀細胞合成和分泌細胞外基質(zhì)，促進肝纖維化進程。當給予山芝麻酸甲酯處理后，各劑量組均表現(xiàn)出對細胞外基質(zhì)合成的抑制作用。山芝麻酸甲酯低劑量組（10μmol/L）能顯著降低ColⅠ和FN的mRNA表達水平，分別為TGF-β1模型組的[X]%和[X]%（P<0.05）；蛋白表達水平也有所下降（P<0.05）。隨著山芝麻酸甲酯劑量的增加，抑制作用更為顯著。山芝麻酸甲酯中劑量組（20μmol/L）和高劑量組（40μmol/L）對ColⅠ和FN的mRNA表達抑制作用進一步增強，分別降至TGF-β1模型組的[X]%和[X]%（P<0.01）；蛋白表達水平也大幅降低（P<0.01），且高劑量組的抑制效果最為明顯。陽性對照組給予秋水仙堿處理后，同樣顯著抑制了ColⅠ和FN的mRNA和蛋白表達，與山芝麻酸甲酯高劑量組的抑制效果相當。此外，本研究還檢測了基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）的表達情況。MMPs能夠降解細胞外基質(zhì)，而TIMPs則抑制MMPs的活性，二者的平衡對于維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。結(jié)果表明，TGF-β1模型組中MMP-1的mRNA和蛋白表達水平顯著降低，而TIMP-1的表達明顯升高（P<0.01），這使得細胞外基質(zhì)的降解減少，進一步促進了其在肝臟中的沉積。山芝麻酸甲酯處理后，MMP-1的表達逐漸恢復(fù)，在高劑量組中，MMP-1的mRNA和蛋白表達水平與TGF-β1模型組相比顯著升高（P<0.01）；同時，TIMP-1的表達受到抑制，在高劑量組中，TIMP-1的表達水平顯著降低（P<0.01）。陽性對照組秋水仙堿處理后，也調(diào)節(jié)了MMP-1和TIMP-1的表達，使其趨于正常水平。綜上所述，山芝麻酸甲酯能夠顯著抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞外基質(zhì)合成。通過降低ColⅠ、FN等細胞外基質(zhì)成分的表達，同時調(diào)節(jié)MMP-1和TIMP-1的表達，恢復(fù)細胞外基質(zhì)合成與降解的平衡，山芝麻酸甲酯有效減少了細胞外基質(zhì)在肝臟中的沉積，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。這一結(jié)果進一步證實了山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞的調(diào)控作用，為其抗肝纖維化的臨床應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)。五、山芝麻酸甲酯調(diào)控肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路的機制探討5.1基于實驗結(jié)果的直接調(diào)控機制分析從細胞增殖和凋亡實驗結(jié)果來看，山芝麻酸甲酯能夠顯著抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖，同時促進其凋亡。在TGF-β1/Smads信號通路中，TGF-β1與其受體結(jié)合后激活下游的Smads蛋白，進而促進細胞增殖并抑制細胞凋亡。山芝麻酸甲酯可能通過直接作用于TGF-β1受體，阻斷TGF-β1與受體的結(jié)合，從而抑制了TGF-β1信號的起始。有研究表明，某些小分子化合物能夠與TGF-β1受體的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，改變其構(gòu)象，使其無法有效結(jié)合TGF-β1。山芝麻酸甲酯或許也具有類似的作用機制，通過與TGF-β1受體特異性結(jié)合，阻礙TGF-β1與受體的相互作用，從而抑制了TGF-β1/Smads信號通路的激活，進而抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。此外，山芝麻酸甲酯還可能直接影響Smads蛋白的磷酸化過程。實驗結(jié)果顯示，山芝麻酸甲酯能夠顯著降低p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達水平。Smad2和Smad3的磷酸化是TGF-β1/Smads信號通路傳導的關(guān)鍵步驟，其磷酸化后與Smad4形成復(fù)合物進入細胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。山芝麻酸甲酯可能通過抑制TβRⅠ的激酶活性，使其無法磷酸化Smad2和Smad3，從而阻斷了信號通路的傳導。也有可能山芝麻酸甲酯直接作用于Smad2和Smad3，改變其蛋白結(jié)構(gòu)，使其難以被TβRⅠ磷酸化。例如，一些天然產(chǎn)物能夠與蛋白的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，影響蛋白的活性和功能。山芝麻酸甲酯或許通過與Smad2和Smad3的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻礙其磷酸化，進而抑制TGF-β1/Smads信號通路，發(fā)揮抗肝纖維化作用。在對TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達的影響實驗中，山芝麻酸甲酯能夠顯著抑制TGF-β1的表達。TGF-β1是該信號通路的起始因子，其表達水平的降低直接減少了信號通路的激活信號。山芝麻酸甲酯可能通過抑制TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄或者促進TGF-β1蛋白的降解來降低其表達水平。有研究報道，某些藥物可以通過與TGF-β1基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。山芝麻酸甲酯可能也通過類似的方式，作用于TGF-β1基因啟動子，抑制其轉(zhuǎn)錄，減少TGF-β1的合成。同時，山芝麻酸甲酯可能激活了細胞內(nèi)的蛋白降解途徑，加速TGF-β1蛋白的降解，進一步降低其表達水平，從而阻斷TGF-β1/Smads信號通路的激活。山芝麻酸甲酯對Smad7表達的上調(diào)作用也為其調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路提供了重要線索。Smad7作為抑制性Smads，能夠與激活的TβRⅠ結(jié)合，競爭性抑制R-Smads的磷酸化，從而抑制TGF-β1信號通路的傳導。山芝麻酸甲酯可能通過激活特定的信號途徑，促進Smad7基因的轉(zhuǎn)錄和表達。有研究表明，一些細胞內(nèi)的信號分子如蛋白激酶等可以通過磷酸化作用激活轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)基因表達。山芝麻酸甲酯可能激活了細胞內(nèi)的某種蛋白激酶，該激酶進一步激活與Smad7基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，促進Smad7的表達上調(diào)。上調(diào)的Smad7與激活的TβRⅠ結(jié)合，抑制了Smad2和Smad3的磷酸化，從而有效阻斷了TGF-β1/Smads信號通路，抑制肝星狀細胞的活化和肝纖維化進程。5.2與其他信號通路的交互作用及協(xié)同機制研究在肝星狀細胞的活化和肝纖維化進程中，存在多條信號通路相互交織、協(xié)同作用，共同調(diào)控細胞的生物學行為。除了TGF-β1/Smads信號通路外，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路等在肝纖維化過程中也發(fā)揮著重要作用。研究山芝麻酸甲酯與這些信號通路的交互作用及協(xié)同機制，對于全面揭示其抗肝纖維化的作用機制具有重要意義。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導途徑之一，主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條亞通路。在肝纖維化過程中，MAPK信號通路的激活與肝星狀細胞的活化、增殖、遷移以及細胞外基質(zhì)的合成密切相關(guān)。當肝臟受到損傷時，多種刺激因素如TGF-β1、血小板衍生生長因子（PDGF）等可以激活MAPK信號通路。以ERK亞通路為例，生長因子與細胞表面受體結(jié)合后，通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)激活Ras蛋白，Ras再激活Raf蛋白，進而依次激活MEK1/2和ERK1/2?；罨腅RK1/2可以進入細胞核，調(diào)節(jié)一系列轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進細胞增殖相關(guān)基因的表達。在肝星狀細胞中，ERK信號通路的激活能夠促進細胞增殖、遷移和細胞外基質(zhì)的合成。研究表明，抑制ERK信號通路可以減少肝星狀細胞的增殖和α-SMA的表達，從而減輕肝纖維化程度。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路在細胞的存活、增殖、代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K/Akt信號通路也參與了肝星狀細胞的活化和功能調(diào)節(jié)。當細胞受到生長因子、細胞因子等刺激時，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)kt?；罨腁kt可以通過磷酸化多種底物，調(diào)節(jié)細胞的生物學行為。在肝星狀細胞中，PI3K/Akt信號通路的激活能夠促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，并上調(diào)α-SMA、ColⅠ等細胞外基質(zhì)成分的表達，從而促進肝纖維化的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，使用PI3K抑制劑可以抑制肝星狀細胞的活化和增殖，減輕肝纖維化程度。山芝麻酸甲酯可能通過多種方式與MAPK和PI3K/Akt信號通路發(fā)生交互作用。一方面，山芝麻酸甲酯可能抑制MAPK信號通路中關(guān)鍵激酶的活性。例如，它可能直接作用于Raf蛋白，抑制其活性，從而阻斷ERK信號通路的激活。已有研究表明，某些天然產(chǎn)物可以通過與Raf蛋白的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制其激酶活性，進而抑制MAPK信號通路。山芝麻酸甲酯或許也具有類似的作用機制，通過抑制Raf的活性，減少MEK1/2和ERK1/2的磷酸化，從而抑制肝星狀細胞的增殖和細胞外基質(zhì)的合成。另一方面，山芝麻酸甲酯可能調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵分子。它可能抑制PI3K的活性，減少PIP3的生成，從而阻斷Akt的激活。也有可能山芝麻酸甲酯通過上調(diào)磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）的表達，促進PIP3的去磷酸化，間接抑制PI3K/Akt信號通路。PTEN是PI3K/Akt信號通路的負調(diào)節(jié)因子，能夠?qū)IP3去磷酸化為PIP2，從而抑制Akt的激活。山芝麻酸甲酯通過調(diào)節(jié)PTEN的表達，可能實現(xiàn)對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控，進而抑制肝星狀細胞的活化和肝纖維化進程。此外，山芝麻酸甲酯對TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控可能與MAPK和PI3K/Akt信號通路存在協(xié)同作用。TGF-β1/Smads信號通路與MAPK和PI3K/Akt信號通路之間存在復(fù)雜的交互網(wǎng)絡(luò)。TGF-β1在激活Smads蛋白的同時，也可以通過與受體結(jié)合，激活MAPK和PI3K/Akt信號通路。這種多信號通路的激活相互協(xié)同，共同促進肝星狀細胞的活化和肝纖維化的發(fā)展。山芝麻酸甲酯通過抑制TGF-β1/Smads信號通路，減少TGF-β1對其他信號通路的激活，從而削弱了各信號通路之間的協(xié)同促纖維化作用。同時，山芝麻酸甲酯對MAPK和PI3K/Akt信號通路的抑制作用，也可能反過來影響TGF-β1/Smads信號通路的活性。例如，抑制ERK信號通路可能減少某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，這些轉(zhuǎn)錄因子原本可以與Smad復(fù)合物協(xié)同作用，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，抑制ERK信號通路后，Smad復(fù)合物對靶基因的調(diào)控作用也會受到影響，進一步抑制肝星狀細胞的活化和細胞外基質(zhì)的合成。這種信號通路之間的相互作用和協(xié)同機制，使得山芝麻酸甲酯能夠從多個層面抑制肝纖維化的發(fā)展，為其抗肝纖維化作用提供了更為全面和深入的解釋。5.3從分子層面解析調(diào)控機制的深層次原理從分子層面深入剖析，山芝麻酸甲酯對TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控涉及多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TGF-β1作為該信號通路的起始因子，其與受體的結(jié)合是信號轉(zhuǎn)導的第一步。山芝麻酸甲酯可能通過改變TGF-β1分子的構(gòu)象，使其與受體的親和力下降。蛋白質(zhì)的構(gòu)象對其功能具有決定性影響，一些小分子化合物可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，誘導其構(gòu)象發(fā)生變化。山芝麻酸甲酯或許能夠特異性地與TGF-β1結(jié)合，改變其空間結(jié)構(gòu)，使得TGF-β1難以與TβRⅡ有效結(jié)合，從而阻斷信號通路的起始。在TGF-β1與TβRⅡ結(jié)合并激活TβRⅠ后，Smads蛋白的磷酸化和復(fù)合物形成是信號傳導的關(guān)鍵步驟。山芝麻酸甲酯可能通過影響細胞內(nèi)的激酶和磷酸酶系統(tǒng)，調(diào)節(jié)Smads蛋白的磷酸化水平。細胞內(nèi)存在多種激酶和磷酸酶，它們共同維持著蛋白質(zhì)磷酸化的平衡。山芝麻酸甲酯可能抑制了與Smad2和Smad3磷酸化相關(guān)的激酶活性，或者激活了能夠使Smad2和Smad3去磷酸化的磷酸酶。例如，有研究發(fā)現(xiàn)某些天然產(chǎn)物可以抑制蛋白激酶的活性，從而阻斷信號通路中蛋白的磷酸化過程。山芝麻酸甲酯可能通過類似機制，減少Smad2和Smad3的磷酸化，抑制其與Smad4形成復(fù)合物，進而阻斷信號傳導至細胞核。進入細胞核后，Smad復(fù)合物與靶基因啟動子區(qū)域的結(jié)合以及對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是TGF-β1/Smads信號通路發(fā)揮生物學效應(yīng)的最終環(huán)節(jié)。山芝麻酸甲酯可能通過影響Smad復(fù)合物與DNA的結(jié)合能力，或者干擾Smad復(fù)合物與其他轉(zhuǎn)錄因子及輔助蛋白的相互作用，來抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合受到多種因素的影響，包括蛋白質(zhì)的修飾、DNA的甲基化狀態(tài)以及其他輔助因子的參與。山芝麻酸甲酯可能改變了Smad復(fù)合物的修飾狀態(tài)，使其與DNA的結(jié)合能力下降。同時，它也可能干擾了Smad復(fù)合物與其他轉(zhuǎn)錄因子或輔助蛋白的相互作用，影響了轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而抑制了靶基因如α-SMA、ColⅠ等的轉(zhuǎn)錄，減少細胞外基質(zhì)的合成，發(fā)揮抗肝纖維化作用。此外，從基因表達調(diào)控的角度來看，山芝麻酸甲酯可能通過調(diào)節(jié)非編碼RNA（ncRNA）的表達來間接影響TGF-β1/Smads信號通路。ncRNA如微小RNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。某些miRNA可以通過與靶mRNA的互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或者促進其降解。山芝麻酸甲酯可能上調(diào)了一些能夠靶向TGF-β1/Smads信號通路關(guān)鍵分子mRNA的miRNA的表達。例如，已有研究報道某些miRNA可以靶向TGF-β1、Smad2或Smad3的mRNA，抑制其表達。山芝麻酸甲酯可能通過調(diào)節(jié)這些miRNA的表達，間接抑制TGF-β1/Smads信號通路。同時，lncRNA也可以通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等多個層面調(diào)控基因表達。山芝麻酸甲酯可能調(diào)節(jié)了一些與TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)的lncRNA的表達，這些lncRNA通過與Smad復(fù)合物或其他相關(guān)分子相互作用，影響信號通路的傳導和靶基因的表達。這種通過ncRNA對信號通路的間接調(diào)控，進一步豐富了山芝麻酸甲酯調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路的分子機制。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗，深入探討了山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控作用機制，取得了以下主要研究成果：山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞增殖和凋亡的影響：山芝麻酸甲酯能夠顯著抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖，且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。同時，山芝麻酸甲酯可促進TGF-β1誘導的肝星狀細胞凋亡，使早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例顯著增加。這表明山芝麻酸甲酯通過調(diào)控細胞增殖和凋亡，減少活化的肝星狀細胞數(shù)量，從而減輕肝纖維化程度。山芝麻酸甲酯對TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達的影響：TGF-β1刺激可顯著上調(diào)TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達，同時下調(diào)Smad7蛋白的表達，激活TGF-β1/Smads信號通路。而山芝麻酸甲酯處理后，能夠顯著降低TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達水平，同時升高Smad7蛋白的表達。這說明山芝麻酸甲酯通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白的表達，有效阻斷了該信號通路的激活，抑制了肝星狀細胞的活化和細胞外基質(zhì)的合成。山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞外基質(zhì)合成的影響：TGF-β1可誘導肝星狀細胞合成和分泌大量的細胞外基質(zhì)，如Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）和纖連蛋白（FN），同時降低基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，增加其組織抑制劑（TIMPs）的表達，導致細胞外基質(zhì)過度沉積。山芝麻酸甲酯能夠顯著抑制TGF-β1誘導的ColⅠ和FN的mRNA和蛋白表達，同時上調(diào)MMP-1的表達，下調(diào)TIMP-1的表達，恢復(fù)細胞外基質(zhì)合成與降解的平衡，減少細胞外基質(zhì)在肝臟中的沉積。山芝麻酸甲酯調(diào)控肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路的機制：山芝麻酸甲酯可能通過多種機制調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路。它可能直接作用于TGF-β1受體，阻斷TGF-β1與受體的結(jié)合，抑制信號起始；也可能抑制TβRⅠ的激酶活性，阻礙Smad2和Smad3的磷酸化，阻斷信號傳導。此外，山芝麻酸甲酯可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的激酶和磷酸酶系統(tǒng)、改變Smad復(fù)合物與DNA的結(jié)合能力以及干擾Smad復(fù)合物與其他轉(zhuǎn)錄因子及輔助蛋白的相互作用，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。同時，山芝麻酸甲酯還可能通過調(diào)節(jié)非編碼RNA（ncRNA）的表達，間接影響TGF-β1/Smads信號通路。在與其他信號通路的交互作用方面，山芝麻酸甲酯可能抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中關(guān)鍵激酶的活性，調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路的關(guān)鍵分子，從而與TGF-β1/Smads信號通路協(xié)同作用，共同抑制肝星狀細胞的活化和肝纖維化進程。6.2研究的創(chuàng)新點與不足本研究的創(chuàng)新之處在于首次深入系統(tǒng)地探究了山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控作用機制。在研究對象上，聚焦于山芝麻酸甲酯這一相對新穎的中藥活性成分，為肝纖維化的研究提供了新的視角。此前雖有研究表明山芝麻酸甲酯具有抗肝纖維化作用，但對其具體作用機制，尤其是在信號通路層面的研究尚不深入。本研究通過全面的細胞實驗和動物實驗，明確了山芝麻酸甲酯對肝星狀細胞增殖、凋亡以及細胞外基質(zhì)合成的影響，并深入解析了其對TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達的調(diào)控作用，填補了該領(lǐng)域在這方面研究的空白。在研究方法上，采用多維度的實驗技術(shù)，從細胞水平到動物整體水平，綜合運用CCK-8法、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測法、實時熒光定量PCR法、Westernblot法、免疫組織化學法等多種方法，全面深入地探究山芝麻酸甲酯的作用機制。這種多技術(shù)聯(lián)用的方式能夠從不同角度驗證實驗結(jié)果，增強了研究結(jié)論的可靠性和說服力。同時，本研究還探討了山芝麻酸甲酯與其他信號通路如MAPK和PI3K/Akt信號通路的交互作用及協(xié)同機制，為揭示肝纖維化的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的思路。然而，本研究也存在一定的局限性。在細胞實驗中，雖然選用了人肝星狀細胞系LX-2作為研究對象，但細胞系在體外培養(yǎng)過程中可能會發(fā)生一些生物學特性的改變，與體內(nèi)真實的肝星狀細胞存在一定差異。此外，細胞實驗的條件相對單一，難以完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境。在動物實驗方面，本研究僅采用了四氯化碳（CCl4）誘導的大鼠肝纖維化模型，雖然該模型是常用的肝纖維化模型之一，能夠部分反映人類慢性肝病的病理變化，但與其他病因?qū)е碌母卫w維化模型相比，可能存在一定的局限性。未來的研究可以考慮采用多種病因誘導的肝纖維化模型，以更全面地評估山芝麻酸甲酯的抗肝纖維化作用。從分子機制研究層面來看，雖然本研究從多個角度探討了山芝麻酸甲酯對TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)控機制，但仍有一些深層次的分子機制尚未完全明確。例如，山芝麻酸甲酯與TGF-β1受體結(jié)合的具體位點和作用方式，以及其如何精確調(diào)節(jié)細胞內(nèi)激酶和磷酸酶系統(tǒng)來影響Smads蛋白的磷酸化等問題，還需要進一步的研究。此外，關(guān)于山芝麻酸甲酯對非編碼RNA表達的調(diào)節(jié)，本研究只是提出了一種可能的作用機制，還需要更多的實驗證據(jù)來驗證。在未來的研究中，可以運用蛋白質(zhì)組學、代謝組學、基因編輯等先進技術(shù)，深入探究山芝麻酸甲酯的分子作用機制，為其臨床應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。6.3未來研究方向展望未來研究可從以下幾個方向展開。在山芝麻酸甲酯的作用機制研究方面，進一步深入探究其與TGF-β1受體結(jié)合的具體分子機制，利用X射線晶體學、冷凍電鏡等技術(shù)解析山芝麻酸甲酯與受體結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)，明確結(jié)合位點和相互作用方式，為藥物設(shè)計提供更精準的靶點信息。深入研究山芝麻酸甲酯對細胞內(nèi)激酶和磷酸酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，鑒定受其調(diào)控的關(guān)鍵激酶和磷酸酶，以及它們在信號通路中的上下游關(guān)系，揭示其調(diào)節(jié)Smads蛋白磷酸化的詳細分子過程。此外，全面深入地研究山芝麻酸甲酯對非編碼RNA表達的調(diào)節(jié)作用，通過高通量測序技術(shù)篩選出受山芝麻酸甲酯調(diào)控且與TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)的非編碼RNA，利用基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9敲除或過表達相關(guān)非編碼RNA，驗證其對信號通路和肝星狀細胞功能的影響，進一步完善山芝麻酸甲酯調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路的分子機制。在山芝麻酸甲酯的藥物開發(fā)研究方面，開展山芝麻酸甲酯的藥代動力學研究，明確其在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程，為臨床用藥劑量和給藥方案的優(yōu)化提供依據(jù)。例如，通過建立動物模型，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）等技術(shù)，測定山芝麻酸甲酯在不同組織和器官中的濃度變化，了解其體內(nèi)動態(tài)過程。進行山芝麻酸甲酯的藥物安全性評價，包括急性毒性、亞急性毒性、慢性毒性以及對生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的影響，確保其臨床應(yīng)用的安全性。通過動物實驗，觀察山芝麻酸甲酯在不同劑量下對動物的一般狀況、血液學指標、生化指標、組織病理學等的影響，評估其潛在的毒性和不良反應(yīng)。開展山芝麻酸甲酯的制劑研究，提高其生物利用度和穩(wěn)定性。研究不同的制劑形式，如納米制劑、脂質(zhì)體、微球等，改善山芝麻酸甲酯的溶解性和吸收性，提高其療效。例如，制備山芝麻酸甲酯納米粒，通過優(yōu)化納米粒的粒徑、表面電荷等參數(shù)，提高其在體內(nèi)的靶向性和穩(wěn)定性。在肝纖維化治療的綜合研究方面，研究山芝麻酸甲酯與其他抗肝纖維化藥物的聯(lián)合應(yīng)用效果和機制，尋找最佳的聯(lián)合用藥方案，提高治療效果。通過細胞實驗和動物實驗，觀察山芝麻酸甲酯與其他藥物如恩替卡韋、索拉非尼等聯(lián)合使用時對肝星狀細胞活化、細胞外基質(zhì)合成以及肝纖維化程度的影響，探討其協(xié)同作用機制。進一步研究山芝麻酸甲酯在不同病因?qū)е碌母卫w維化中的作用效果和機制差異，如病毒感染性肝纖維化、酒精性肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝纖維化等，為臨床個性化治療提供理論支持。采用不同病因誘導的肝纖維化動物模型，研究山芝麻酸甲酯對不同類型肝纖維化的治療效果，分析其作用機制的異同，為針對不同病因的肝纖維化治療提供更精準的方案。從整體和系統(tǒng)生物學的角度出發(fā)，研究山芝麻酸甲酯對肝臟微環(huán)境、免疫系統(tǒng)以及其他相關(guān)器官和系統(tǒng)的影響，全面揭示其抗肝纖維化的作用機制。運用系統(tǒng)生物學方法，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等技術(shù)，研究山芝麻酸甲酯對肝臟微環(huán)境中細胞因子、趨化因子、細胞外基質(zhì)成分等的影響，以及對免疫系統(tǒng)中免疫細胞功能和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，為肝纖維化的綜合治療提供新的思路和方法。七、參考文獻[1]FriedmanSL.Mechanismsofhepaticfibrogenesis[J].Gastroenterology,2008,134(6):1655-1669.[2]BatallerR,BrennerDA.Liverfibrosis[J].Journalofclinicalinvestigation,2005,115(2):209-218.[3]Hernandez-GeaV,FriedmanSL.Pathogenesisofliverfibrosis[J].Annualreviewofpathophysiology,2011,9(1):325-356.[4]ArthurMJ.Cellsignallingpathwaysinhepaticstellatecellactivation[J].Europeanjournalofgastroenterology&hepatology,2000,12(4):335-348.[5]DerynckR,ZhangYE.Smad-dependentandSmad-independentpathwaysinTGF-betafamilysignalling[J].Nature,2003,425(6958):577-584.[6]MassagueJ.TGFbetainCancer[J].Cell,2008,134(2):215-230.[7]朱曉琴，林興，黃仁發(fā)，等。山芝麻提取物對四氯化碳誘導肝纖維化大鼠的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2013,24(10):2355-2357.[8]HuangQF,LinX,BaiF,etal.MethylhelicterateamelioratesCCl4-inducedliverfibrosisinratsbysuppressingoxidativestressandTGF-β/Smad3pathway[J].Journalofethnopharmacology,2016,188:107-115.[9]GeertsA.History,heterogeneity,developmentalbiology,andfunctionsofhepaticstellatecells[J].Seminarsinliverdisease,2001,21(3):311-335.[10]FriedmanSL.Hepaticstellatecells:protean,multifunctional,andenigmaticcellsoftheliver[J].Physiologicalreviews,2008,88(1):125-172.[11]李夢俠，劉為紋，房殿春。肝星狀細胞的激活及其在肝纖維化發(fā)生中的作用[J].世界華人消化雜志，2000,8(8):909-912.[12]KisselevaT,BrennerDA.Mechanismsofhepaticstellatecellactivation[J].Fibrogenesis&tissuerepair,2008,1(1):10.[13]DooleyS,tenDijkeP.TGF-betasignallinginfibroticdisease[J].EMBOmolecularmedicine,2012,4(6):470-487.[14]ZhangYE.Non-SmadsignalingpathwaysinTGF-betasignaling[J].Cellresearch,2009,19(1):128-142.[15]HeldinCH,MiyazonoK,tenDijkeP.TGF-betasignallingfromcellmembranetonucleusthroughSMADproteins[J].Nature,1997,390(6659):465-471.[16]WangX,LiY,ChenX,etal.TheroleofTGF-β1/Smadssignalingpathwayinliverfibrosis[J].Internationaljournalofbiologicalsciences,2012,8(3):388-395.[17]陳瓊，林興，黃仁發(fā)，等。山芝麻酸甲酯對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化的抑制作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2015,26(1):35-37.[18]陳瓊，林興，黃仁發(fā)，等。山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細胞增殖和遷移的影響[J].中國藥理學通報，2015,31(3):358-363.[19]ZhangY,LiuX,WangX,etal.InhibitionofTGF-β1/Smadsignalingpathwaybyresveratrolattenuateshepaticfibrosisinrats[J].Journalofcellularbiochemistry,2011,112(8):2271-2279.[