1T/XXXXXXX—XXXX西紅花球莖中吲哚乙酸和吲哚丁酸的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了西紅花球莖中吲哚乙酸和吲哚丁酸的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。本文件適用于西紅花球莖中吲哚乙酸和吲哚丁酸的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理試樣用甲醇提取，經(jīng)固相萃取柱凈化，濃縮后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。5試劑與耗材除另有說(shuō)明外，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1試劑5.2乙腈（CH3CN，CAS號(hào)75-05-8）：色譜純。5.3甲醇（CH3OH，CAS號(hào)67-56-1）:色譜純。5.4甲酸（HCOOH，CAS號(hào)64-18-6）：色譜純。5.5乙醇（C2H5OH，CAS號(hào)64-17-5），色譜純。5.650%甲醇溶液:取等體積的甲醇和水混勻。5.70.1%甲酸溶液：取1.0mL甲酸（4.1.3）用1000mL水稀釋并定容。5.8乙腈-0.1%甲酸溶液(4+6)：量取40mL乙腈與60mL的0.1%甲酸溶液（4.1.6），混勻。5.9標(biāo)準(zhǔn)品5.10吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（C10H9NO2）：CAS號(hào)87-51-4，純度≥98%。5.11吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（C12H13NO2）：CAS號(hào)133-32-4，純度≥98%。5.12吲哚乙酸、吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：100.0μg/mL。準(zhǔn)確稱取適量（精確至0.1mg）的吲哚乙酸、吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（4.2.1、4.2.2），分別用少量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，分別用甲醇定容至刻度，混勻，-18℃以下避光保存6個(gè)月。5.13混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4.2.3）準(zhǔn)確移取上述吲哚乙酸、吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0mL至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，濃度為1.0μg/mL，0～4℃以下避光保存。5.14混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要用甲醇稀釋配制成濃度為2.0μg/L、4.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、500.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。5.15材料5.15.1HLB固相萃取柱（N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯）：200mg/6mL，使用前用5mL甲醇和5T/XXXXXXX—XXXX2mL水預(yù)處理。5.15.2濾膜：0.22μm，有機(jī)相。5.15.3離心管。5.15.4150mL梨形瓶。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜：配備電噴霧離子源（ESI）。6.2離心機(jī)：4000r/min。6.3超聲波清洗器：100kHz。6.4分析天平：感量0.1mg。6.5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。6.6均質(zhì)機(jī)。6.7渦旋混合儀。7樣品取有代表性的試樣100克，裝入干凈的容器內(nèi)勻漿混勻，放入聚乙烯瓶中。將試樣按照測(cè)試與備用分別存放，于-18℃保存。在抽樣及制樣的操作過(guò)程中，應(yīng)防止樣品受到污染或待測(cè)物發(fā)生含量的變化。8試驗(yàn)步驟8.1提取和凈化準(zhǔn)確稱取5g試樣（精確至0.1mg）于50mL離心管中，用50mL甲醇（4.1.2）分兩次提取，每次25mL，渦旋混勻，超聲提取10min后，以4000r/min速度離心5min，合并上清液。將提取的上清液全部過(guò)柱，通過(guò)后，依次以50%甲醇溶液（4.1.5）和5mL水洗滌，流速不超過(guò)2d/s,棄去淋洗液，負(fù)壓抽干，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液于梨形瓶中，40℃以下旋至近干，用乙腈-0.1%甲酸溶液（4.1.7）溶解，并定容至1mL，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。8.2測(cè)定8.2.1液相色譜參考條件a)色譜柱：BEHC18，1.7μm，5cm×0.21cm（內(nèi)徑）或相當(dāng)者；b)柱溫：35℃;c)流動(dòng)相：乙腈+5mmoL/L乙酸銨（35+65，體積比）；d)流速：0.200mL/min；8.2.2質(zhì)譜參考條件a)電離方式：ESI；b)掃描方式：正離子掃描；c)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件參見附錄B。8.2.3定性分析按照上述條件測(cè)定樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果樣品中檢出的色譜峰保留時(shí)間與所用標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物的保留時(shí)間一致，并且在扣除背景后所選擇的3對(duì)離子的豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物的3對(duì)子離子豐度比的偏差不超過(guò)表1的限定，則可判定樣品中存在相應(yīng)的目標(biāo)物。表1定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差單位為百分率T/XXXXXXX—XXXX3>50<10±20±25±30±508.2.4定量測(cè)定采用外標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算。按濃度由小到大的順序，依次分析所用混合工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到濃度與定量離子峰面積的工作曲線。樣品溶液中分析物的響應(yīng)值應(yīng)在工作曲線范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖參見附錄C。8.3空白試驗(yàn)除不加試樣外，按照8.1步驟進(jìn)行空白試驗(yàn)。9結(jié)果計(jì)算試樣中被測(cè)組分含量按式（1）計(jì)算。式中：X—試樣中被測(cè)組分的含量，單位為微克每千克(μg/kgCi—從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測(cè)組分溶液濃度,單位為微克每升(μg/L）；V—樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；M—樣液所代表的試樣質(zhì)量單位為克（g）。計(jì)算結(jié)果保留2位有效數(shù)字。10精密度在重復(fù)性條件下，2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差不大于重復(fù)性限（r），參見附錄D。在再現(xiàn)性條件下，2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差不大于再現(xiàn)性限（R），參見附錄E。11定量限和回收率本標(biāo)準(zhǔn)方法被測(cè)組分的定量限參見附錄A。本標(biāo)準(zhǔn)方法被測(cè)組分的添加水平和回收率數(shù)據(jù)參見附錄F。T/XXXXXXX—XXXX4（資料性）吲哚乙酸和吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)品中英文名稱對(duì)照、CAS號(hào)、分子式和定量限吲哚乙酸和吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)品中英文名稱對(duì)照、CAS號(hào)、分子式和定量限，見表A.1。表A.1吲哚乙酸和吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)品中英文名稱對(duì)照、CAS號(hào)、分子式和定量限1CHNO2T/XXXXXXX—XXXX5（資料性）吲哚乙酸和吲哚丁酸的電離及掃描模式、保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、駐留時(shí)間和碰撞能量吲哚乙酸和吲哚丁酸的電離及掃描模式、保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、駐留時(shí)間和碰撞能量，見表B.1。表B.1吲哚乙酸和吲哚丁酸的電離及掃描模式、保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、駐留時(shí)間和碰撞能量VT/XXXXXXX—XXXX6（資料性）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的吲哚乙酸和吲哚丁酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖吲哚乙酸和吲哚丁酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖，見C.1。圖C.1吲哚乙酸和吲哚丁酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖T/XXXXXXX—XXXX7（資料性）重復(fù)性限數(shù)據(jù)重復(fù)性限（r）要求見表D.1。表D.1重復(fù)性限(r）128