ICS65.020.30CCSB4354IDB54/T0562—2026 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4診斷 5實驗室診斷 2 2 3附錄A（資料性）片形吸蟲蟲卵形態(tài)及感染牦牛肝臟 4附錄B（規(guī)范性）實驗室檢測方法 5DB54/T0562—2026本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村標準化技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所、佛山大學。本文件主要起草人：唐文強、黃福強、趙霞玲、石斌、馬弘財、韓海玉、何小國、任曉麗。1本文件規(guī)定了牦牛片形吸蟲病的臨床診斷、實驗室診斷、防控和治僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件?！吨腥A人民共和國獸藥典》(2020版)NY/T1950-2010片形GB19489-2008實驗室生物安全通用要求急性期損害，以及成蟲寄生于膽管內(nèi)所致的以膽管上皮增生、4診斷2取新鮮糞便進行聚合酶鏈式反應，擴增出特異性目的片段，只出現(xiàn)約250蟲，只出現(xiàn)約500bp的特異性條帶為大片吸蟲，同時出現(xiàn)約250bp和500bp條帶為“中間型”片形吸蟲，DB54/T0562—20263每年春、冬兩季定期驅(qū)蟲，牛群發(fā)病可隨時驅(qū)蟲。6.1.2驅(qū)蟲藥物選擇驅(qū)蟲藥多使用高效、低毒且能驅(qū)殺各發(fā)育階段蟲體的藥物，推薦使用三氯苯達唑。6.1.3驅(qū)蟲方法預防片形吸蟲病要有季節(jié)性，針對童蟲和成蟲分別驅(qū)蟲。在春季驅(qū)蟲，以驅(qū)除殺滅機體內(nèi)殘存的成蟲；在進入夏季牧場前給藥，以防止囊蚴感染機體；在秋季節(jié)進行一次驅(qū)蟲，以驅(qū)除感染的蟲體，防止在體內(nèi)發(fā)育。防控中間宿主結(jié)合草原或農(nóng)田基本建設、興修水利和填補與改造低洼沼澤地帶等措施，控制椎實螺生存的環(huán)境。具備條件的，可用飼養(yǎng)的水禽、鴨、鵝等生物方法滅螺。糞便無害化處理實施驅(qū)蟲的牛，遠離中間宿主區(qū)域，圈留5d～7d，對病牛所排糞便及時清理，嚴格進行生物熱發(fā)酵、焚燒，殺死蟲卵。加強飼養(yǎng)衛(wèi)生管理選擇在干燥處放牧，最好飲用自來水、井水或流動的河水，并保持水源清潔，以防感染。利用人工草場，不食用流行區(qū)的牧草。采用放牧與補飼相結(jié)合的飼養(yǎng)方式，合理補充精料和添加劑，增強牦牛體質(zhì)。7治療藥物應符合《中華人民共和國獸藥典》要求，選擇高效、低毒、安全方便、易于推廣的驅(qū)蟲藥，首選對童蟲和成蟲有效的三氯苯噠唑和碘醚柳胺等藥物；糞便蟲卵檢查發(fā)現(xiàn)有蟲卵，則選用硝氯酚、丙硫咪唑和吡喹酮等對成蟲效果較好且價格相對低廉的藥物。根據(jù)劑型含量不同，具體用量以藥品說明書為依據(jù)，并嚴格遵守藥物規(guī)定的用法、用量和休藥期。嚴禁使用未經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準或已淘汰的獸藥。4(資料性)DB54/T0562—20265（規(guī)范性）實驗室檢測方法B.1糞便蟲卵檢查（水洗沉淀法）B.1.1材料200mL玻璃杯，60目網(wǎng)篩，玻璃棒，鑷子，膠帽吸管，載玻片和蓋玻片，天平，顯微鏡。B.1.2方法取新鮮糞便10g放入玻璃杯中，先加10mL水攪成糊狀，然后再繼續(xù)加水20倍。經(jīng)充分混合后，用60目網(wǎng)篩濾入另一玻璃杯中，把濾過的糞便混懸液靜置沉淀30分鐘后，倒掉上清液，再繼續(xù)加水混合，靜置沉淀。靜置的時間可逐漸縮短，但至少要10分鐘。這樣反復進行，直到上清液透明為止。最后吸取沉淀物放在載玻片上，加蓋玻片在顯微鏡下作定性檢查。若作定量檢查，須將所有沉淀物全部鏡檢（不加蓋玻片，用低倍顯微鏡檢查），統(tǒng)計全部蟲卵數(shù)。B.1.3結(jié)果判定肝片吸蟲和大片吸蟲蟲卵前端均較窄，有一個不明顯的卵蓋，后端較鈍。卵殼較薄而透明，卵內(nèi)充滿卵黃細胞和一個胚細胞（見附錄A的圖A.1）。肝片形吸蟲(F.hepatica)蟲卵呈長卵圓形，大小為116μm～132μm×66μm～82μm，大片形吸蟲(F.gigantica)蟲卵的形態(tài)與肝片形吸蟲蟲卵相似，大小為150μm～190μm×75μm～90μm。由于西藏地區(qū)存在中間型片形吸蟲，因此無法通過蟲卵形態(tài)區(qū)別出所檢測的片形吸蟲蟲卵為大片吸蟲卵還是肝片吸蟲卵，如要進一步區(qū)分，可通過PCR方法（按B.3進行）進行鑒別。同時，由于同盤屬吸蟲（genusParamphistomum）蟲卵與片形吸蟲蟲卵形態(tài)和大小相似，還應區(qū)別片形吸蟲蟲卵與同盤吸蟲蟲卵，兩者的鑒別要點為：同盤吸蟲蟲卵呈灰白色，有透明感，卵黃細胞松散地分布在內(nèi)，可見到許多空隙。其次，通過微分干涉相差顯微鏡可以看到片形吸蟲的胚細胞在蟲卵前端，而同盤吸蟲的胚細胞在蟲卵中部偏后。B.2肝臟蟲體檢查B.2.1材料解剖刀，組織剪，挑蟲針，無齒鑷，搪瓷盆，搪瓷盤，搪瓷缸，大平皿，載玻片。B.2.2蟲體采集a）按一般剖檢術(shù)式摘出肝臟，再剪斷膽管與十二指腸連接部位，要注意觀察斷端有無蟲體流出。b）將肝臟放搪瓷盤中。首先分離膽囊，單放在大平皿中，剪開囊壁，將膽汁用清水稀釋，等自然沉淀后，檢查沉淀物中有無蟲體。檢查肝臟時，先看肝表面有無病變結(jié)節(jié)，發(fā)現(xiàn)后用組織剪剪取，放在兩塊載玻片中間做壓片檢查。c）沿肝臟的大膽管及其分支剪開，如發(fā)現(xiàn)蟲體取出放在盛有清水的平皿中。再沿著與膽管垂直的方向?qū)⒏谓M織切成數(shù)大塊，注意斷面有無蟲體或病灶。用手壓擠，看是否有蟲體被壓出。d）將肝塊浸入盛有多量水的搪瓷盆中，用手撕成小塊，再擠每個小肝塊，洗凈后取出。向搪瓷盆內(nèi)再加些水進行反復水洗沉淀，檢查沉淀物，用無齒鑷挑出蟲體。e）挑出的蟲體用生理鹽水洗凈，再放在常溫自來水中使蟲體松弛。有些蟲體的腸管內(nèi)含有大量食物，可在生理鹽水中放置過夜，待其食物消化或排出。DB54/T0562—20266B.2.3蟲體固定將松弛了的蟲體放在吸水紙上吸干水分，再放在清潔的載玻片上，載玻片兩端鋪上單層濾紙，蓋上另一載玻片，稍加壓力將蟲體壓薄后，用橡皮筋或線繩扎緊，投入70%酒精內(nèi)固定。注意投入時，應以一端慢慢浸入，便于將兩載玻片之間的空氣趕出，固定時間應達24h以上。B.2.4蟲體染色標本制作步驟（硼砂卡紅染色）a）蟲體染色原保存于70％酒精內(nèi)的標本，可直接取出投入硼砂卡紅（4％硼砂（Na2B4O7)溶液100mL，加入卡紅染粉1g，加熱使其溶解，再加入70％酒精100mL，放冷，過濾，濾液即為硼砂卡紅染液）染色液中染色。保存于福爾馬林液內(nèi)的蟲體標本，應先取出水洗1～2h，爾后循序通過305070％的酒精各0.5～1h，再投入染液中，在染液中過夜，使蟲體染成深紅色。b）蟲體脫色自染液中取出蟲體，放入1%酸酒精中褪色（1%酸酒精是以70％酒精99mL加濃鹽酸1mL，根據(jù)情況也可以使用2%或3%的酸酒精），使顏色深淺分明，即蟲體外層呈淡紅色，內(nèi)部構(gòu)造呈深紅色。c）蟲體脫水將脫色好的蟲體移入80%，95％和100%酒精（2次）中各0.5～1h。（如果脫水不充分制作出的標本會有一層霧狀膜，原因就是浸泡時間不夠或最后一步就酒精使用過程中已不是無水酒精，建議更換新的無水酒精）d）蟲體透明將蟲體先經(jīng)1:1的100%酒精和二甲苯混合液中透明30min，再取出放入純二甲苯中，待蟲體下沉后即可取出封片。用二甲苯透明時，時間不宜過長，否則蟲體變硬而脆，不便封片。最好隨時透明，隨時封片。e）蟲體封片已透明的蟲體，移至載玻片上，加適量滴加拿大樹膠，加蓋玻片封固，封固時切忌留有氣泡在內(nèi)，待干后放入標本盒內(nèi)。B.2.5結(jié)果判定肝片吸蟲和大片形吸蟲的形態(tài)相似。成蟲背腹扁平，呈葉片狀，紅褐色，雌雄同體，被覆皮棘。蟲體前端有一突出的圓錐狀頭錐，頭錐后方變寬，或形成肩部?？谖P位于頭錐前端的亞腹面，腹吸盤位于頭錐基部稍后方。在口、腹吸盤之間有生殖孔。消化系統(tǒng)由咽、食道和兩腸支組成，兩側(cè)的腸支一直延伸至蟲體后端，并向內(nèi)外兩側(cè)發(fā)出分支。生殖系統(tǒng)中，睪丸兩個，呈高度分支，前后排列于蟲體的中部。卵巢一個，較小，呈鹿角狀，位于腹吸盤右后方，前睪丸的前方。子宮較短，盤曲在卵巢與腹吸盤之間，其內(nèi)充滿蟲卵，開口于生殖孔。卵黃腺分布在蟲體兩側(cè)，自頭錐基部直達蟲體后端?！爸虚g型”片形吸蟲成蟲形態(tài)兼具兩種片形吸蟲的形態(tài)特點。肝片形吸蟲與大片形吸蟲的成蟲形態(tài)主要鑒別要點見表B.1。表B.1肝片形吸蟲與大片形吸蟲成蟲的形態(tài)鑒別B.3PCR檢測DB54/T0562—20267B.3.1試劑糞便基因組DNA提取試劑盒，TaqPCRMix預混液（2X,含藍染料），1.5%瓊脂糖凝膠，50×TAE電泳緩沖液，DL2,000DNAMarker，核酸染料，片形吸蟲陽性對照：中間型片形吸蟲基因組DNA（10ng/μL片形吸蟲陰性對照：非片形吸蟲基因組DNA，空白對照：ddH2O，3條引物序列及配置的母液濃度見表B.2。表B.2引物序列及濃度5’-GATTGCACCGTTAGGTTAGC-3’5’-AAAGTTTCTATCCCGAACGAAG-3’5’-CGAAAATTATGGCATCAATGGG-3’B.3.2耗材離心管（15mL、50mL、1.5mL），藥匙，稱量紙，0.2mL薄壁PCR管，500mL量筒，500mL錐形瓶，槍），B.3.3儀器設備分析天平，PCR擴增儀，臺式低溫高速離心機，水平電泳儀，紫外凝膠成像系統(tǒng)，可調(diào)移液器（2），B.3.4實驗步驟B.3.4.1牦牛糞便樣品采集和處理a)采集待檢測牦牛200mg左右的糞便，放入一個1.5mL離心管中，供PCR檢查用，每頭牦牛采的糞便樣品不少于2管；b)采集的樣品宜當天處理和檢測，若不能當天檢測，應暫時放于冰箱冷凍室-20℃保存，若需長期保存，應放置于-80℃超低溫冰箱；c)使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便樣品中的全基因組；d)提取好的全基因組置于4℃保存，若不能當天檢測，應放于冰箱冷凍室-20℃保存。B.3.4.2PCR擴增反應體系：30μL，體系組成見表B.3。設置至少兩個平行樣品，設立陰性、陽性及空白提取對照。表B.3PCR擴增反應體系TaqPCRMix預混液（2X,3332PCR擴增條件：95℃預變性90s；95℃變性30s