抗流感藥物靶點及其抑制劑流感病毒是一種負螺旋單鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科。根據(jù)病毒核蛋白（nucleoproteins，NP）及基質(zhì)蛋白（matrixproteins，M1）的抗原決定簇不同，流感病毒被分為三類：甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）。流感病毒顆粒結(jié)構(gòu)大致相似（如圖1），自內(nèi)而外可分成核心、基質(zhì)蛋白以及包膜三部分。病毒子通常呈圓形，長絲狀。甲型和乙型流感病毒核酸有八個RNA節(jié)段，負責編碼十種蛋白，包括血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）、酸性蛋白（PA）、堿性蛋白1（PB1）、PB2、核蛋白（NP）、基質(zhì)蛋白（M1）、離子通道蛋白（M2）、非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1）、核輸出蛋白（NEP或NS2）。此外，大多數(shù)甲型流感病毒還有線粒體靶向的寡聚PB1-F2蛋白[1]，報道其與細胞凋亡以及病毒毒力有關(guān)。這些病毒RNA片段同NP結(jié)合并纏繞形成病毒核糖核蛋白體（vRNP），vRNP再與三聚的RNA聚合酶（PA、PB1、PB2）結(jié)合形成核糖核苷酸，負責RNA的復制和轉(zhuǎn)錄，這種結(jié)合模式確保了病毒RNA對于核酸酶保持敏感。丙型流感病毒只有七個RNA節(jié)段。基因組分節(jié)段的特點為流感病毒高頻率基因重配提供了條件。病毒核心被外部的脂蛋白膜包圍，在脂膜上有基質(zhì)蛋白M1，其是病毒顆粒的主要蛋白，并通過化學鍵結(jié)合到vRNP。M2蛋白為具有離子通道活性的跨膜蛋白。乙型流感病毒缺乏M2蛋白，但是一種叫做BM2的蛋白可以起到類似M2蛋白作用。病毒最外層的包膜是包裹基質(zhì)蛋白的磷脂雙分子層，該膜來源于宿主細胞的細胞膜。膜表面具有兩類非常重要的“刺突”，即兩種糖蛋白，HA和NA。乙型流感病毒表面抗原相對簡單，僅有一種HA和一種NA。對于甲型流感，根據(jù)病毒表面抗原HA及NA的不同，其可進一步細分為16個HA亞型（H1～H16）、9個NA亞型(N1～N9)[2]。圖1甲型流感病毒結(jié)構(gòu)模式圖[3]三種類型流感病毒的宿主范圍也是有區(qū)別的：甲型流感病毒能夠感染哺乳類動物（人、豬、馬等）和禽類，乙型流感病毒主要在人類和豬間傳播，丙型流感病毒只在人類傳播。另外，三種病毒的變異性及危害性從大到小依次是甲型、乙型、丙型，因此，對人類危害性最大的是甲型流感病毒。流感病毒感染及增殖過程圖2流感病毒感染及增殖機制[4]如圖2所示，流感病毒感染及增殖過程可大致分為黏附→內(nèi)吞→融合→去包膜→入核→vRNA合成→蛋白合成→出核→組裝→出芽→釋放等階段。首先，流感病毒包膜表面抗原HA識別并粘附到宿主細胞膜表面糖脂或糖蛋白上的唾液酸（sialicacid，SA）受體上，在粘附階段，神經(jīng)氨酸酶的唾液酸酶活性阻止HA與氣管上皮細胞粘液層唾液酸的結(jié)合，從而強化病毒感染。接著，在受體介導的細胞內(nèi)吞作用下，結(jié)合于宿主細胞表面的病毒進入宿主細胞并形成胞內(nèi)體（endosome）。胞內(nèi)體內(nèi)的低pH條件啟動HA“融合域”構(gòu)象轉(zhuǎn)化，導致病毒包膜與胞內(nèi)體膜發(fā)生融合。與此同時，非糖基化基質(zhì)蛋白M2離子通道被激活，形成進入細胞內(nèi)膜的內(nèi)向質(zhì)子流，引發(fā)基質(zhì)蛋白M1與vRNP的解離。然后，vRNP被轉(zhuǎn)運進入細胞核，啟動病毒遺傳信息的復制和轉(zhuǎn)錄。RdRP以及NP對流感病毒的轉(zhuǎn)錄和復制具有重要意義。新合成的NP以及RNA聚合酶也被轉(zhuǎn)入細胞核，與新和成的vRNA結(jié)合形成子代vRNP。在非結(jié)構(gòu)性的核輸出蛋白NEP/NS2及基質(zhì)蛋白M1介導下，核內(nèi)形成的子代vRNP被轉(zhuǎn)運出宿主細胞核進入細胞漿，經(jīng)裝配形成成熟病毒顆粒。出芽后的新病毒顆粒仍然通過HA-SA鍵吸附于宿主細胞表面，經(jīng)NA水解SA釋放子代病毒，造成病毒的擴散與傳播[5]。圖5NP及HA的抑制劑（3）M2金剛烷胺、金剛乙胺為兩個最具代表性的M2離子通道抑制劑，僅對甲型流感有效。這兩個藥物在臨床上使用多年，耐藥性問題突出。但是，這類藥物能夠促進外呼吸道擴張從而增加攝氧量，使得其在抗流感中仍然具有重要價值。耐藥毒株氨基酸突變區(qū)結(jié)構(gòu)的進一步闡明，為該類藥物解決耐藥問題提供了機遇[30,31]。同時，針對A/M2及BM2蛋白進化高度保守區(qū)HXXXW開發(fā)抑制劑，有望得到對甲型、乙型流感均有效的藥物[32]。（4）HA流感病毒進入靶細胞的過程需要酸性環(huán)境的誘導：在胞內(nèi)體低pH條件下，HA構(gòu)象改變，前體蛋白HA0經(jīng)蛋白酶剪切形成HA1和HA2，暴露出隱藏在蛋白中的融合域，即HA2的疏水N端。HA2的N端插入胞內(nèi)體膜，每三分子的HA2即形成六螺旋束形“融合孔”，使得病毒膜與胞內(nèi)體膜融合，病毒基因組通過融合孔進入細胞質(zhì)。而HAl負責與宿主細胞膜表面的唾液酸受體結(jié)合，介導病毒通過胞飲方式進入細胞形成胞內(nèi)體。靶向HA的抗流感化合物，根據(jù)機制不同可分為兩類：一類是阻止HAl與宿主細胞膜表面SA受體結(jié)合的黏附抑制劑，這類以fludase（DAS181）為代表，其是一種新型唾液酸酶融合蛋白，目前處于Ⅱb期臨床（美國）；另一類是阻斷HA2介導的膜融合過程的融合抑制劑（抑制低pH誘導的HA構(gòu)象轉(zhuǎn)化），這是人們研究較早的一類抑制劑，包括1997年報道的以BMY-27709為代表的水楊酰胺類、1998年報道的以stachyflin為代表的司他弗林類化合物。該類化合物結(jié)構(gòu)如圖5所示。（5）NA1967年，一種神經(jīng)氨酸酶類似物（DANA）被Meindl等合成，然而，其對NA的抑制活性并不顯著，未能應用于抗流感治療。1993年，伴隨著神經(jīng)氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)的解析[33]，vonItzstein[34]等對DANA進行了結(jié)構(gòu)改造，除了環(huán)上取代基手性的調(diào)整，將DANA母核的4位羥基用堿性的胍基替代，得到了第一個臨床使用的NAI——扎那米韋（zanamivir），其對NA的親和力較DANA高100倍。但是，其口服生物利用度低，目前臨床主要使用其吸入劑型。1997年，Kim等[35]用環(huán)己烯環(huán)替換扎那米韋的吡喃環(huán)，保證環(huán)上取代基空間伸展方向不變情況下，用疏水的3-戊氧基替代扎那米韋母環(huán)6位上連接的甘油基，將強堿性胍基用氨基替代，得到了奧司他韋（Oseltamivir）。該化合物于1999年被FDA批準用于臨床。其能有效抑制流感病毒，同時，相對于扎那米韋，其口服生物利用度大大提升，固體口服給藥途經(jīng)增加了患者的依從性，是目前使用最廣的NAI[35],這也導致了其耐藥性積累速度最快。目前臨床使用較少的NAI還有在日本應用的帕拉米韋（Peramivir）以及拉尼那米韋（Laninamivir），其中拉尼那米韋屬于目前唯一長效NAI。對于奧司他韋耐受，又不能噴霧吸入扎那米韋的患者，可以考慮靜脈注射帕拉米韋；現(xiàn)有研究表明對于奧司他韋耐藥的毒株，拉尼那米韋依然有效，同時拉尼那米韋一天只需服用一次，使得患者依從性更好[36]。目前，從人、豬、禽類中分離的NAI耐藥病毒株，包括了除N4亞型之外所有甲型流感病毒亞型以及乙型流感病毒。在流行的高致病性N1亞型（如H1N1、H5N1等）中，奧司他韋耐受問題最普遍，H274Y突變是導致其耐受的主要原因[37]。常見的N2亞型（主要為H3N2）耐藥突變?yōu)镋119V、R292K突變，但是H274Y突變并不能導致N2亞型對奧司他韋的耐藥[37,38]。乙型流感病毒對扎那米韋的耐藥與R152K突變有關(guān)[39]，對奧司他韋的耐藥與R317K突變相關(guān)[40]。圖6列出了奧司他韋與NA催化區(qū)（以N8為例）結(jié)合模式，我們將結(jié)合區(qū)分為4個亞位點。2002年，Hanessian[41]將奧司他韋母環(huán)5位氨基用乙烯基取代，成功得到了化合物H（Ki=45nM，本節(jié)所有討論的NAI結(jié)構(gòu)見圖8），探討了NA催化區(qū)2號亞位點發(fā)生疏水相互作用而非電荷相互作用的可能性。2012年，Bhatt[42]繼續(xù)對該位點改造，通過羥基、甲氧基、乙氧基、烯丙基取代的對比，發(fā)現(xiàn)還是羥基取代（化合物I）的活性最高(IC50=0.32μM)。通過Hanessian和Bhatt的工作，我們發(fā)現(xiàn)NA催化區(qū)2號亞位點的氫鍵相互作用對于NAI的活性非常重要。圖6奧司他韋與N8催化區(qū)結(jié)合模式圖在系統(tǒng)分類中，甲型流感病毒NA可分為兩大類，Ⅰ類（Group1）包括N1、N4、N5、N8四種亞型，Ⅱ類（Group2）包括N2、N3、N6、N7、N9五種亞型。2006年，隨著Russell[43]等對N1、N4、N8的結(jié)構(gòu)解析，人們發(fā)現(xiàn)：Ⅰ類NA催化區(qū)2號亞位點附近連接著開放的“150腔”；然而，Ⅱ類NA中“150-LOOP”處于封閉構(gòu)象，使得Ⅱ類NA活性結(jié)合區(qū)旁邊不存在該“150腔”，如圖7所示?！?50腔”的發(fā)現(xiàn)為設計選擇性的Ⅰ類NA抑制劑、解決病毒耐藥問題提供了新思路。Pinto課題組[44]以奧司他韋為先導化合物，用帶羥基側(cè)鏈的三氮唑替換奧司他韋骨架5位上的氨基，得到了以化合物J為代表的Ⅰ類選擇性的NAI（Ki=1.5ⅹ10-9～4.6ⅹ10-10M）。2013年，Kerry[45]通過化合物的共晶體結(jié)構(gòu)，驗證了化合物J同時占據(jù)NA催化區(qū)和“150腔”，是一種雙位點抑制劑。2014年，在對奧司他韋母環(huán)5位氨基進行異硫脲取代時，Pinto課題組意外得到了螺環(huán)化合物K（如圖8），其對HK1流感病毒的有效濃度為10-6～10-7M。N8與化合物K的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)表明，化合物上螺環(huán)在催化區(qū)偏向150-LOOP，有利于“150腔”的形成，這為開發(fā)雙位點抑制劑提供了一種思路[46]。圖7[44]A.奧司他韋與N1結(jié)合模式；B.奧司他韋與N9結(jié)合模式為了克服不利的藥動學性質(zhì)引發(fā)的耐藥問題，Schade[47]也對奧司他韋母環(huán)5位氨基的取代進行了探討。利用生物電子等排體和前藥的設計原理，成功得到了藥動學性質(zhì)和口服生物利用度比較理想，同時對奧司他韋耐藥的H1N1突變株有效的化合物L，其活化代謝物抗H1N1的IC50=14.5nM。除了對奧司他韋母環(huán)5位氨基的結(jié)構(gòu)改造，Cheng[48]用磷酸基和磷酸酯將母環(huán)1位上羧基替換，成功得到了化合物M，其能夠在納摩水平甚至皮摩水平抑制多種流感病毒復制，包括H274Y耐藥毒株。開發(fā)抗流感病毒不可逆抑制劑也是解決當前耐藥問題的一種思路。2013年，Kim[49]通過對神經(jīng)氨酸酶催化過渡態(tài)的研究，設計合成了以化合物N為代表的一系列α，β-二氟取代的化合物。這些化合物能夠與神經(jīng)氨酸酶催化區(qū)Tyr406形成短暫的共價中間體，廣譜強效抑制流感病毒，包括扎那米韋和奧司他韋耐藥毒株。在動物實驗中，藥效與上市藥物相當或者優(yōu)于上市藥物。圖8上市及最新報道的NAI總的來說，對于NAI日益嚴重的耐藥問題，人們將大量關(guān)注集中于奧司他韋母核5位上的氨基的改構(gòu)，母核1位羧基改構(gòu)及不可逆抑制劑設計也有零星的探討；NA催化區(qū)2號亞位點旁邊“150腔”的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)解析，也為人們解決NAI的耐藥問題提供了新思路。參考文獻[1]ChanturiyaA.N.,BasanezG.,SchubertU.,etal.PB1-F2,aninfluenzaAvirus-encodedproapoptoticmitochondrialprotein,createsvariablysizedporesinplanarlipidmembranes[J].JVirol,2004,78(12):6304-6312.[2]FouchierR.A.,MunsterV.,WallenstenA.,etal.CharacterizationofanovelinfluenzaAvirushemagglutininsubtype(H16)obtainedfromblack-headedgulls[J].JVirol,2005,79(5):2814-2822.[3]NelsonM.I.andHolmesE.C.Theevolutionofepidemicinfluenza[J].NatRevGenet,2007,8(3):196-205.[4]vonItzsteinM.Thewaragainstinfluenza:discoveryanddevelopmentofsialidaseinhibitors[J].NatRevDrugDiscov,2007,6(12):967-974.[5]GongJ.,FangH.,LiM.,etal.Potentialtargetsandtheirrelevantinhibitorsinanti-influenzafields[J].Currentmedicinalchemistry,2009,16(28):3716-3739.[6]Stieneke-GroberA.,VeyM.,AnglikerH.,etal.Influenzavirushemagglutininwithmultibasiccleavagesiteisactivatedbyfurin,asubtilisin-likeendoprotease[J].Emboj,1992,11(7):2407-2414.[7]HorimotoT.,NakayamaK.,SmeekensS.P.,etal.Proprotein-processingendoproteasesPC6andfurinbothactivatehemagglutininofvirulentavianinfluenzaviruses[J].JVirol,1994,68(9):6074-6078.[8]HattaM.andKawaokaY.ThecontinuedpandemicthreatposedbyavianinfluenzavirusesinHongKong[J].TrendsMicrobiol,2002,10(7):340-344.[9]HorimotoT.andKawaokaY.PandemicthreatposedbyavianinfluenzaAviruses[J].ClinMicrobiolRev,2001,14(1):129-149.[10]OlsonA.C.,RosenblumE.andKuchtaR.D.RegulationofinfluenzaRNApolymeraseactivityandtheswitchbetweenreplicationandtranscriptionbytheconcentrationsofthevRNA5'end,thecapsource,andthepolymerase[J].Biochemistry,2010,49(47):10208-10215.[11]SuC.Y.,ChengT.J.,LinM.I.,etal.High-throughputidentificationofcompoundstargetinginfluenzaRNA-dependentRNApolymeraseactivity[J].ProcNatlAcadSciUSA,2010,107(45):19151-19156.[12]GuilligayD.,TarendeauF.,Resa-InfanteP.,etal.ThestructuralbasisforcapbindingbyinfluenzaviruspolymerasesubunitPB2[J].NatStructMolBiol,2008,15(5):500-506.[13]TarendeauF.,BoudetJ.,GuilligayD.,etal.StructureandnuclearimportfunctionoftheC-terminaldomainofinfluenzaviruspolymerasePB2subunit[J].NatStructMolBiol,2007,14(3):229-233.[14]Bradel-TrethewayB.G.,KelleyZ.,Chakraborty-SettS.,etal.ThehumanH5N1influenzaAviruspolymerasecomplexisactiveinvitrooverabroadrangeoftemperatures,incontrasttotheWSNcomplex,andthispropertycanbeattributedtothePB2subunit[J].JGenVirol,2008,89(Pt12):2923-2932.[15]KuzuharaT.,KiseD.,YoshidaH.,etal.StructuralbasisoftheinfluenzaAvirusRNApolymerasePB2RNA-bindingdomaincontainingthepathogenicity-determinantlysine627residue[J].JBiolChem,2009,284(11):6855-6860.[16]PautusS.,SehrP.,LewisJ.,etal.New7-MethylguanineDerivativesTargetingtheInfluenzaPolymerasePB2Cap-BindingDomain[J].JMedChem,2013,56(21):8915-8930.[17]YuanP.,BartlamM.,LouZ.,etal.CrystalstructureofanavianinfluenzapolymerasePA(N)revealsanendonucleaseactivesite[J].Nature,2009,458(7240):909-913.[18]DiasA.,BouvierD.,CrepinT.,etal.Thecap-snatchingendonucleaseofinfluenzaviruspolymeraseresidesinthePAsubunit[J].Nature,2009,458(7240):914-918.[19]GuuT.S.,DongL.,Wittung-StafshedeP.,etal.MappingthedomainstructureoftheinfluenzaAviruspolymeraseacidicprotein(PA)anditsinteractionwiththebasicprotein1(PB1)subunit[J].Virology,2008,379(1):135-142.[20]MaierH.J.,KashiwagiT.,HaraK.,etal.DifferentialroleoftheinfluenzaAviruspolymerasePAsubunitforvRNAandcRNApromoterbinding[J].Virology,2008,370(1):194-204.[21]LiuY.,LouZ.,BartlamM.,etal.Structure-functionstudiesoftheinfluenzavirusRNApolymerasePAsubunit[J].SciChinaCLifeSci,2009,52(5):450-458.[22]HeX.,ZhouJ.,BartlamM.,etal.CrystalstructureofthepolymerasePA(C)-PB1(N)complexfromanavianinfluenzaH5N1virus[J].Nature,2008,454(7208):1123-1126.[23]MuratoreG.,GoracciL.,MercorelliB.,etal.SmallmoleculeinhibitorsofinfluenzaAandBvirusesthatactbydisruptingsubunitinteractionsoftheviralpolymerase[J].ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(16):6247-6252.[24]MassariS.,NannettiG.,GoracciL.,etal.StructuralInvestigationofCycloheptathiophene-3-carboxamideDerivativesTargetingInfluenzaVirusPolymeraseAssembly[J].JMedChem,2013,56(24):10118-10131.[25]PaganoM.,CastagnoloD.,BernardiniM.,etal.TheFightagainsttheInfluenzaAVirusH1N1:Synthesis,MolecularModeling,andBiologicalEvaluationofBenzofurazanDerivativesasViralRNAPolymeraseInhibitors[J].ChemMedChem,2014,9(1):129-150.[26]BoltzD.A.,AldridgeJrJ.R.,WebsterR.G.,etal.Drugsindevelopmentforinfluenza[J].Drugs,2010,70(11):1349-1362.[27]YeQ.,KrugR.M.andTaoY.J.ThemechanismbywhichinfluenzaAvirusnucleoproteinformsoligomersandbindsRNA[J].Nature,2006,444(7122):1078-1082.[28]KaoR.Y.,YangD.,LauL.S.,etal.IdentificationofinfluenzaAnucleoproteinasanantiviraltarget[J].NatBiotechnol,2010,28(6):600-605.[29]ChengH.,WanJ.,LinM.-I.,etal.Design,Synthesis,andinVitroBiologicalEvaluationof1H-1,2,3-Triazole-4-carboxamideDerivativesasNewAnti-influenzaAAgentsTargetingVirusNucleoprotein[J].JournalofMedicinalChemistry,2012,55(5):2144-2153.[30]DuQ.S.,HuangR.B.,WangS.Q.,etal.DesigninginhibitorsofM2protonchannelagainstH1N1swineinfluenzavirus[J].PLoSOne,2010,5(2):e9388.[31]HongM.andDeGradoW.F.StructuralbasisforprotonconductionandinhibitionbytheinfluenzaM2protein[J].ProteinSci,2012,21(11):1620-1633.[32]ZhaoX.,JieY.,RosenbergM.R.,etal.Designandsynthesisofpinanaminederivativesasanti-influenzaAM2ionchannelinhibitors[J].AntiviralRes,2012,96(2):91-99.[33]VargheseJ.N.,LaverW.G.andColmanP.M.Structureoftheinfluenzavirusglycoproteinantigenneuraminidaseat2.9Aresolution[J].Nature,1983,303(5912):35-40.[34]vonItzsteinM.,WuW.Y.,KokG.B.,etal.Rationaldesignofpotentsialidase-basedinhibitorsofinfluenzavirusreplication[J].Nature,1993,363(6428):418-423.[35]KimC.U.,LewW.,WilliamsM.A.,etal.Influenzaneuraminidaseinhibitorspossessinganovelhydrophobicinteractionintheenzymeactivesite:design,synthesis,andstructuralanalysisofcarbocyclicsialicacidanalogueswithpotentanti-influenzaactivity[J].JAmChemSoc,1997,119(4):681-690.[36]IkematsuH.andKawaiN.Laninamiviroctanoate:anewlong-actingneuraminidaseinhibitorforthetreatmentofinfluenza[J].ExpertRevAntiInfectTher,2011,9(10):851-857.[37]NguyenH.T.,FryA.M.andGubarevaL.V.Neuraminidaseinhibitorresistanceininfluenzavirusesandlaboratorytestingmethods[J].AntivirTher,2012,17(1PtB):159-173.[38]AbedY.,BazM.andBoivinG.ImpactofneuraminidasemutationsconferringinfluenzaresistancetoneuraminidaseinhibitorsintheN1andN2geneticbackgrounds[J].AntivirTher,2006,11(8):971-976.[39]GubarevaL.V.,MatrosovichM.N.,BrennerM.K.,etal.EvidenceforzanamivirresistanceinanimmunocompromisedchildinfectedwithinfluenzaBvirus[J].JInfectDis,1998,178(5):1257-1262.[40]SheuT.G.,DeydeV.M.,Okomo-AdhiamboM.,etal.SurveillanceforneuraminidaseinhibitorresistanceamonghumaninfluenzaAandBvirusescirculatingworldwidefrom2004to2008[J].AntimicrobAgentsChemother,2008,52(9):3284-3292.[41]HanessianS.,WangJ.,MontgomeryD.,etal.Design,synthesis,andneuraminidaseinhibitoryactivityofGS-4071analoguesthatutilizeanovelhydrophobicparadigm[J].BioorgMedChemLett,2002,12(23):3425-3429.[42]BhattB.,B?hmR.,KerryP.S.,etal.ExploringtheInteractionsofUnsaturatedGlucuronideswithInfluenzaVirusSialidase[J].JournalofMe