[在此處鍵入]流式細(xì)胞術(shù)對PNH檢測的應(yīng)用價值

目錄摘要 ⅠAbstract Ⅱ前言 11.材料與方法 21.1材料 21.1.1儀器設(shè)備 21.1.2試劑 21.2方法 31.2.1研究對象 31.2.2流式細(xì)胞儀檢測步驟 41.2.3統(tǒng)計學(xué)分析 52.實驗結(jié)果 62.1CD55、CD59檢測結(jié)果 72.2流式結(jié)果圖 93.討論 124.結(jié)論 13參考文獻(xiàn) 14致謝 16

摘要目的：探討陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)通過利用流式細(xì)胞術(shù)檢測的方法來診斷的臨床應(yīng)用價值，從而為確診并治療PNH尋求更為有效的實驗方案。方法：選取2015-2019年在309醫(yī)院就診的不同類型的貧血患者41例和血常規(guī)正常的健康人群18例，在所研究的41例貧血患者中包括PNH患者8例、再生障礙性貧血(AA)患者7例、骨髓增生異常綜合征(MDS)患者15例、缺鐵性貧血患者5例和巨幼紅細(xì)胞性貧血患者6例，抽取這59例研究對象的外周血并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測其對應(yīng)紅細(xì)胞（WBC）和白細(xì)胞（RBC）細(xì)胞膜上CD55和CD59的陽性表達(dá)情況。結(jié)果：流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測結(jié)果顯示，8例PNH患者的WBC和RBC細(xì)胞膜上CD55和CD59分子的陽性表達(dá)率均明顯低于健康對照組和其他類型的貧血患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），具體來說，對照組的18例健康人群的外周血細(xì)胞膜上CD55+、CD59+的檢測結(jié)果均>95%，5例缺鐵性貧血(IDA)患者、6例巨幼紅細(xì)胞性貧血患者、15例骨髓增生異常綜合征(MDS)患者和6例再生障礙性貧血(AA)患者的外周血細(xì)胞膜上CD55+、CD59+的檢測結(jié)果也均>95%，但是其中有1例AA患者的外周血細(xì)胞膜上的檢測結(jié)果CD55+<90%、而CD59+則在正常范圍內(nèi)，8例PNH患者外周血細(xì)胞膜上CD55+的檢測結(jié)果在20.5%～74.50%,CD59+的檢測結(jié)果在46.80%～86.50%。結(jié)論：通過采用流式細(xì)胞儀的技術(shù)和抗CD55、CD59的單克隆抗體可以直接檢測PNH患者的細(xì)胞膜上有缺陷的異常細(xì)胞，其優(yōu)勢是特異性強(qiáng)，快速，準(zhǔn)確，能夠有效幫助診斷PNH，對臨床診斷具有重要意義。關(guān)鍵詞流式細(xì)胞術(shù)；陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥；CD55；CD59AbstractObjective:Toexploretheclinicalvalueofthediagnosisofparoxysmalnocturnalhemoglobinuria(PNH)byflowcytometry,soastofindamoreeffectiveexperimentalschemeforthediagnosisandtreatmentofPNH.Methods:41patientswithdifferenttypesofanemiaand18healthypeoplewithnormalbloodroutinewereselectedfrom309hospitalfrom2015to2019.41Theperipheralbloodsamplesofthe59patientswerecollectedandtheexpressionofCD55andCD59onthecorrespondingredbloodcell(WBC)andwhitebloodcell(RBC)membranewasdetectedbyflowcytometry.Results:theexpressionofCD55+andCD59+onWBCandRBCcellmembraneof8PNHpatientswassignificantlylowerthanthatofhealthycontrolgroupandothertypesofanemiapatients,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05),specifically,CD55+andCD59onperipheralbloodcellmembraneof18healthypeopleincontrolgroup+TheresultsofCD55+andCD59+ontheperipheralbloodcellmembraneof5IDApatients,6megaloblasticanemiapatients,15MDSpatientsand6AApatientswereallover95%.ButtheresultsofCD55+andCD59+ontheperipheralbloodcellmembraneof1AApatientwerelessthan90%,andCD59+wereinthenormalrange,8PNHpatientswereinthenormalrangeTheresultsofCD55+andCD59+were20.5%-74.50%and46.80%-86.50%respectively.Conclusion:byusingflowcytometryandmonoclonalantibodiesagainstCD55andCD59,wecandirectlydetectthedefectiveabnormalcellsonthecellmembraneofpatientswithPNH.Itsadvantagesarestrongspecificity,fast,accurate,andcaneffectivelyhelpdiagnosePNH,whichisofgreatsignificanceforclinicaldiagnosis.Keywords:flowcytometry;paroxysmalnocturnalhemoglobinuria;CD55;CD59前言陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）是由造血干細(xì)胞PIG-A基因突變引起的一種后天獲得性的細(xì)胞膜缺陷的溶血性貧血，主要是細(xì)胞膜上的衰變加速因子(DAF)和同種限制因子(HRF)缺陷，以紅細(xì)胞更明顯，由于一種或幾種造血干細(xì)胞中染色體xp22，1上的PIG-A基因突變使糖基磷脂酰肌醇（GPI）I的合成受阻，導(dǎo)致由GPI錨鏈在細(xì)胞膜上的一組膜蛋白丟失，其突變部位遍布在一些內(nèi)含子之中以及第2～6外顯子整個編碼區(qū)的多個位置，沒有突變熱點。臨床上可有血紅蛋白尿發(fā)作，常在睡眠后表現(xiàn)醬油色或葡萄酒色尿，還會伴有全血細(xì)胞減少、感染與出血、血栓形成、黃疸和肝脾輕度腫大等表現(xiàn)。為了探討流式細(xì)胞術(shù)用于檢測外周血細(xì)胞膜上CD55、CD59中的臨床意義和應(yīng)用價值,建立流式細(xì)胞術(shù)檢測陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥的標(biāo)準(zhǔn)方法，展開了本課題的研究。各類貧血性疾病與PNH的相關(guān)性：再障，與PNH可以相互轉(zhuǎn)化或同時兼有，以上這些情況統(tǒng)稱PNH-再障綜合征兩者的主要鑒別點是PNH骨髓增生活躍，而再障骨髓增生減低；缺鐵性貧血，在補(bǔ)鐵后可以使貧血得到徹底糾正，而PNH因長期反復(fù)血紅蛋白尿而失鐵，可伴有缺鐵現(xiàn)象，但此種情況補(bǔ)鐵也無法糾正；巨幼細(xì)胞貧血，因溶血促使骨髓代償性過度增生而導(dǎo)致此病，可以通過補(bǔ)充葉酸后徹底糾正，而由PNH所致引起巨幼貧血的患者卻不能因補(bǔ)充葉酸而得到糾正；骨髓增生異常綜合征，個別PNH患者骨髓可看到病態(tài)造血現(xiàn)象，有些學(xué)者甚至將PNH也視為MDS的一種，極個別患者可完全變?yōu)镸DS，極少部分MDS患者也會偶爾發(fā)生典型的血紅蛋白尿或PNH的表現(xiàn)，可具有類似PNH的異常血細(xì)胞，PNH起病緩慢，呈慢性過程且多變，以貧血和出血為首發(fā)癥狀者占絕大部分，以血紅蛋白尿起病者占較少部分。病態(tài)血細(xì)胞都來自同一克隆，之前主要是通過溶血試驗測定紅細(xì)胞對補(bǔ)體的敏感度從而診斷PNH，即實驗室檢查如酸化血清溶血試驗(Ham試驗)、蛇毒因子溶血試驗、糖水溶血試驗、補(bǔ)體溶血敏感試驗、尿潛血或尿含鐵血黃素試驗，其診斷依據(jù)是以上實驗中有兩項表現(xiàn)為陽性，或者其中一項為陽性但是應(yīng)保證操作正規(guī)且伴有溶血現(xiàn)象，所以以上幾種傳統(tǒng)試驗敏感性低、特異性差。后來流式細(xì)胞術(shù)檢測法因高敏感度和準(zhǔn)確性被逐漸運用于臨床診斷，而且通過查閱文獻(xiàn)研究表明CD55和CD59對補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白有非常重要的作用，在PNH、AA、MDS、缺鐵性貧血和巨幼紅細(xì)胞性貧血患者的細(xì)胞上均有不同程度的改型，不同類型的貧血患者其紅細(xì)胞的CD59/FS的表現(xiàn)特征不同，研究發(fā)現(xiàn)所有PNH患者的外周血異常細(xì)胞均缺乏某些細(xì)胞膜表面蛋白，例如衰變加速因子（CD55）、膜攻擊復(fù)合物抑制因子（CD59），而且PNH患者體內(nèi)的異常細(xì)胞和所缺乏的蛋白都是由于一種糖脂類復(fù)合體，此類復(fù)合體是細(xì)胞膜表面的缺乏蛋白在生理情況可以準(zhǔn)確錨定在細(xì)胞膜表面的關(guān)鍵物，而PNH患者體內(nèi)的這類糖脂類復(fù)合物的生物合成通路中存在著酶蛋白基因突變，致使酶的活力下降且合成受阻，從而導(dǎo)致其錨定蛋白不能有效地聯(lián)結(jié)在細(xì)胞膜表面，其中CD55通過調(diào)節(jié)C3和C5補(bǔ)體蛋白轉(zhuǎn)化酶調(diào)控早期補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)，能增加轉(zhuǎn)化酶復(fù)合物解離或衰變的速度，CD59可以阻止補(bǔ)體C9摻入C5b-8復(fù)合物中，抑制補(bǔ)體活化過程中C8和C9之間的相互作用，從而抑制補(bǔ)體終末攻擊反應(yīng)。外周血細(xì)胞膜表面這類蛋白的缺陷能夠通過流式細(xì)胞術(shù)檢測從而可以準(zhǔn)確測定出異常細(xì)胞，而且近年來CD55、CD59抗原的檢測大大提高了PNH克隆的檢出率，細(xì)胞膜表面的CD55+、CD59+的表達(dá)率不但使典型PNH的診斷更加可靠，同時也可使一些亞臨床型PNH例如無典型血紅蛋白尿發(fā)作的PNH得到診斷。因此，本次課題是借助中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心器官移植研究室流式平臺，使用BDFACSCantoTM多參數(shù)流式細(xì)胞儀對送檢的外周血標(biāo)本進(jìn)行PNH檢測，即所有健康對照組和各種類型的貧血患者均抽取其外周血，采用流式細(xì)胞儀對標(biāo)本細(xì)胞膜上的補(bǔ)體蛋白CD55和CD59分子進(jìn)行檢測，本實驗以研究紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上的補(bǔ)體分子為主，通過利用流式細(xì)胞術(shù)對PNH患者進(jìn)行檢測診斷，探討是否可以有效提高臨床診斷率，從而降低誤診率和漏診率，以便實現(xiàn)對病情的有效控制，增強(qiáng)治療效果，將此類方法進(jìn)行普遍臨床推廣與應(yīng)用。1材料和方法1.1材料1.1.1儀器設(shè)備名稱公司流式細(xì)胞儀美國BD公司漩渦振蕩器美國Thermo公司加樣槍(1000ul、200u1、10ul)德國Eppendorf公司臺式離心機(jī)TDZ5-WS湘儀公司流式專用試管美國BD公司EP管美國BD公司1.1.2試劑：名稱公司CD55-FITC,、CD59-PE美國BD公司溶血素美國BD公司鞘液美國BD公司儀器校正微珠美國BD公司注釋：固定液：用PBS液配置4％多聚甲醛，加熱，用玻璃棒攪拌至完全溶解，然后調(diào)整pH為7.2～7.4，置于4℃下保存。1.2方法1.2.1研究對象選取2015-2019年在中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心做過PNH檢測的就診病人進(jìn)行回顧性研究，其中包括18例健康對照者、PNH患者8例、再生障礙性貧血(AA)患者7例、骨髓增生異常綜合征(MDS)患者15例、5例缺鐵性貧血患者和巨幼紅細(xì)胞性貧血患者6例。1.2.2實驗步驟抽取研究人群的EDTA抗凝全血，即采用EDTA抗凝血真空血管收集觀察對象2?ml外周靜脈血，針對其外周血的成熟紅細(xì)胞和白細(xì)胞細(xì)胞膜表面的分化抗原CD55、CD59做分子表達(dá)的檢測，室溫放置，且需在24h之內(nèi)處理、檢測。處理步驟如下：1.處理標(biāo)本每個血樣準(zhǔn)備4支流式試管，分別標(biāo)記為W1、W2、R1、R2。用1mlPBS稀釋紅細(xì)胞200倍，即5ul全血+1mlPBS，混勻備用（采用正向加血，加血時需擦拭槍頭）。于四支準(zhǔn)備好的試管中加入相應(yīng)抗體。試管編號抗體R1空白對照R2CD55、CD59W1CD45W2CD55、CD59、CD45注：CD55、CD59各6ul，CD45各3ul。于R1、R2試管中分別加入100ul稀釋血，同時于W1、W2試管中分別加入100ul全血（采用正向加血，且同一標(biāo)本的四支試管加入血樣時不用擦拭槍頭）。將四支試管分別混勻、避光，室溫孵育15min。取出孵育好的血樣管，于W1、W2兩支試管中分別加入2ml溶血素，R1、R2兩支試管中分別加入2mlPBS。將四支試管分別混勻、避光，孵育10min。取出四支試管，離心1500r、5min，離心前需將每支試管混勻。棄去上清液，于四支試管中分別加入2mlPBS溶液，混勻后離心，1500r、5min。棄去上清液，避光2h。注：如不能立即上機(jī)，則在上述步驟所得標(biāo)本中加入1ml固定液，4℃保存。2.上機(jī)（1）打開BDFACSDiva軟件，選擇PNH文件夾，建立標(biāo)本各自對應(yīng)的新文件夾。（2）將做好的外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞血樣通過與熒光標(biāo)記的CD55、CD59單克隆抗體作用，進(jìn)行其陽性表達(dá)的檢測。（3）開始依次將樣本管上機(jī)。編號操作R1P1、20000evt、Medium→AcquireData→RecordData→RemoveR2P1、20000evt、Medium→AcquireData→RecordData→RemoveW1P3、10000evt、Medium→AcquireData→RecordData→RemoveW2P3、10000evt、Medium→AcquireData→RecordData→Remove（4）分析圈選目標(biāo)門編號操作R1圈選出紅細(xì)胞所在的區(qū)域門，標(biāo)為P1R2圈選出紅細(xì)胞所在的區(qū)域門，標(biāo)為P1，將P1門下的CD55、CD59的數(shù)值刪除，并將R1試管P1下對應(yīng)的CD55、CD59的數(shù)值復(fù)制粘貼到R2試管的P1區(qū)域W1P1→顯示Allevents,調(diào)節(jié)橫縱坐標(biāo)P2→顯示P1，圈選區(qū)域門，調(diào)節(jié)橫縱坐標(biāo)P3→顯示P2，圈選區(qū)域門，調(diào)節(jié)橫縱坐標(biāo)W2同W1試管，并將P3下的CD55、CD59的數(shù)值刪除，將W1試管P1下對應(yīng)的CD55、CD59的數(shù)值復(fù)制粘貼到W2試管的P1區(qū)域（5）做紅細(xì)胞分析時，選取單色分析，因為多色分析時需要考慮紅細(xì)胞聚集造成的影響與誤差。（6）做白細(xì)胞分析時，選取三色分析，即非GPI相關(guān)蛋白的系列抗原/SSC設(shè)門的方法。（7）保存數(shù)據(jù)，分類匯總。3.圖示說明每例患者的流式上機(jī)實驗結(jié)果圖一共分為兩張，每張均包括兩支試管的結(jié)果圖，即兩支同種細(xì)胞不同試劑的試管進(jìn)行流式熒光上機(jī)檢測的數(shù)據(jù)結(jié)果。第一張圖反映的是紅細(xì)胞的結(jié)果，預(yù)先采用一個正常健康人的血樣，要求該標(biāo)本所有紅細(xì)胞上都表達(dá)的是非GPI相關(guān)的糖蛋白抗原，并根據(jù)紅細(xì)胞的物理特性，采取FSC/SSC設(shè)門（FSC即前向散射光、SSC即側(cè)向散射光），計算所選標(biāo)本的陽性百分率，以判斷FSC/SSC設(shè)門的純度。紅細(xì)胞包括R1、R2兩支試管的樣本，其中R1為空白對照，R2為實驗組即加有CD55和CD59抗原的紅細(xì)胞。第二張圖反映的是白細(xì)胞的結(jié)果，同紅細(xì)胞一樣預(yù)先采用一個正常人的血樣，采取系列抗原/SSC設(shè)門，由于粒細(xì)胞重度缺乏的患者僅單獨使用FSC/SSC設(shè)門很難找到確切的靶細(xì)胞群，所以需要使用非GPI錨蛋白/SSC設(shè)門的方法，進(jìn)行三色分析檢測，同時使用SSC/非GPI相關(guān)蛋白的系列抗原設(shè)定白細(xì)胞門，另外兩個熒光通道用來檢測GPI相關(guān)抗原。白細(xì)胞包括W1、W2兩支試管的樣本，其中W1為對照組只加有CD45抗原，W2為實驗組即加有CD45、CD55、CD59三種抗原的白細(xì)胞。1.2.3統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計18例健康對照組和41例貧血患者的外周血細(xì)胞細(xì)胞膜上CD55+和CD59+的測定結(jié)果見附表2.1.1。具體來說，18例正常人外周血紅細(xì)胞和白細(xì)胞細(xì)胞膜上CD55、CD59分子的陽性表達(dá)率的百分比均>95％；而8例PNH患者紅細(xì)胞CD55+的百分比檢測結(jié)果在29.6%～74.5%、CD59+檢測結(jié)果在42.1%～78.5%，白細(xì)胞CD55+檢測結(jié)果在20.5%～62.5%、CD59+在35.6%～86.5%；7例AA患者中CD55+紅細(xì)胞為41.89％的有1例，其余結(jié)果均>93.2％,CD55+白細(xì)胞檢測結(jié)果>95％的有6例，剩下1例患者的白細(xì)胞CD55+表達(dá)率為89.5%，而所有AA患者的紅細(xì)胞和白細(xì)胞的CD59+檢測結(jié)果均>90％；15例MDS患者的外周血細(xì)胞細(xì)胞膜上CD55+和CD59+檢測結(jié)果也均>90％；其余的5例缺鐵性貧血和6例巨幼細(xì)胞性貧血患者的外周血細(xì)胞膜上的CD55和CD59分子檢測結(jié)果的陽性表達(dá)率均在正常范圍內(nèi)。2.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計正常對照組和各類貧血患者外周血CD55+和CD59+細(xì)胞測定結(jié)果（%）表2.1.1組別WBCCD55+RBCCD55+WBCCD59+RBCCD59+PNHMDSAA缺鐵性貧血巨幼貧血健康組43.499.785.699.999.899.960.291.289.795.698.398.255.698.698.698.299.399.458.399.597.798.299.399.4注：表格中為各組數(shù)據(jù)的均值，數(shù)值以百分比表示。2.4結(jié)果分析就流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果顯示，所有的PNH患者組外周血細(xì)胞膜上CD55和CD59分子的陽性百分率與健康對照組比較有顯著性差異，其余33例非PNH貧血類型的患者紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上CD55+、CD59+的百分率與對照組比較無顯著性差異。具體來說，18例健康對照組的檢測結(jié)果中紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上的CD55+和CD59+表達(dá)均大于95%（見圖2.4.1）；8例PNH患者細(xì)胞膜上CD55+、CD59+的檢測結(jié)果在20.5%～86.5%（見圖2.4.2）；7例AA患者的CD59+檢測結(jié)果均>90％，但是紅細(xì)胞膜上的CD55+表達(dá)率為41.89％的有1例，其余結(jié)果均>93.2％,白細(xì)胞膜上CD55+表達(dá)率為89.5%有1例，其余6例結(jié)果均>95％（見圖2.4.3）；MDS組的15例患者的外周血細(xì)胞膜上CD55+、CD59+的檢測結(jié)果均>90%（見圖2.4.4）；5例缺鐵性貧血和6例巨幼貧血患者的紅細(xì)胞和白細(xì)胞CD55+、CD59+的檢測結(jié)果都在正常范圍內(nèi)均>95%（分別見圖2.4.5和圖2.4.6）。圖2.4.1圖2.4.2圖2.4.3圖2.4.4圖2.4.5圖2.4.63討論貧血會嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)、再生障礙性貧血(AA)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、缺鐵性貧血(IDA)以及巨幼紅細(xì)胞性貧血等均是常見的貧血類型，因此早日診斷、對癥治療就變的尤為重要。近年來，人們不斷研究PNH的發(fā)病機(jī)制并對其做了進(jìn)一步深入的了解。目前認(rèn)為PNH主要是造血干細(xì)胞基因突變和自身免疫缺陷，PNH患者細(xì)胞膜表面缺乏一組糖肌醇磷脂(GPI)連接蛋白，GPI錨連蛋白能抑制血細(xì)胞表面補(bǔ)體的激活，而PIGA編碼的蛋白質(zhì)和GPI的生物合成相關(guān)，所以磷脂酰肌醇聚糖A（PIGA）是PNH患者溶血的分子病因，即PIGA的突變能直接影響GPI的合成，相關(guān)補(bǔ)體中最重要的是CD55和CD59兩種分子，所以PNH患者的細(xì)胞膜缺乏CD55和CD59兩種膜蛋白，也是紅細(xì)胞對補(bǔ)體的溶血作用敏感性增強(qiáng)的主要原因，也因此導(dǎo)致CD55、CD59對膜表面補(bǔ)體活化的調(diào)控作用減弱,最終導(dǎo)致患者發(fā)生血管內(nèi)溶血、骨髓衰竭、貧血、血栓形成、正常造血功能減低及血紅蛋白尿等臨床癥狀。傳統(tǒng)的PNH診斷試驗是通過抽取患者的去纖維蛋白血做酸化溶血試驗（Ham試驗）和蔗糖溶血試驗，或者采取晨尿進(jìn)行尿含鐵血黃素（Rous）試驗，從而證明出存在有對補(bǔ)體敏感的紅細(xì)胞，在之前的臨床診斷中往往以Ham試驗陽性作為PNH的確診試驗。而且根據(jù)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料了解到，蔗糖溶血試驗最為敏感，但該試驗會存在一定的假陽性率，但本試驗敏感性高，PNH患者經(jīng)檢測約88%陽性，所以可以將其作為最好的初篩試驗；Ham試驗具有較強(qiáng)的特異性，PNH患者的病態(tài)紅細(xì)胞在pH為6.4的條件下容易被替代途徑激活的補(bǔ)體溶破，而正常紅細(xì)胞則不會被溶破，但也有個別的PNH患者在進(jìn)行Ham試驗時會出現(xiàn)陰性反應(yīng)，所以不能就Ham試驗的陰性結(jié)果而否定診斷，還需要結(jié)合其他診斷方法來進(jìn)行判斷；Rous試驗陽性僅僅能表明體內(nèi)存在有慢性溶血，但是PNH是紅細(xì)胞膜獲得性缺陷血管內(nèi)溶血的疾病，在溶血初期可呈陰性，也不能直接確診。所以這些傳統(tǒng)實驗都存在不同程度的假陰性或假陽性，不利于PNH的準(zhǔn)確診斷。隨著研究發(fā)現(xiàn)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測PNH不僅特異性強(qiáng)，而且快速、準(zhǔn)確，大大提高了檢測效率，需要注意的是在采用外周血做PNH分析時要求對患者的紅細(xì)胞和白細(xì)胞進(jìn)行篩查，而且骨髓中的CD55、CD59細(xì)胞檢測更為準(zhǔn)確，所以為了快速、有效地提高其診斷的準(zhǔn)確性，PNH早期患者和重度溶血患者可以通過檢測骨髓CD55、CD59。其中，標(biāo)本選用抗凝外周血時，CD55、CD59分子檢測報告顯示的是紅系及粒系FSC/SSC設(shè)門圖；標(biāo)本選用骨髓血細(xì)胞時，CD55、CD59分子檢測報告顯示的是血細(xì)胞CD45/SSC設(shè)門圖。本次實驗結(jié)果中顯示，PNH組患者的紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上CD55、CD59的陽性表達(dá)率檢測結(jié)果明顯低于健康對照組和其他貧血患者小組；再生障礙性貧血患者、骨髓增生異常綜合征患者、缺鐵性貧血患者和巨幼貧血患者與對照組比較均無顯著性差異，即這些患者的細(xì)胞膜上CD55+、CD59+的表達(dá)在正常范圍之內(nèi)，但需要注意的是，AA患者中有1例患者細(xì)胞膜上CD55、CD59存在一定程度的缺失，后期該例患者最終修改診斷為PNH，經(jīng)查閱資料發(fā)現(xiàn)，再障(或骨髓增生低下)與PNH有關(guān)聯(lián)，且發(fā)病有兩種類型，均屬于再障-PNH綜合征，同時發(fā)現(xiàn)部分AA病人的外周血細(xì)胞中也有PNH樣陰性細(xì)胞的存在，近幾年在臨床上也發(fā)現(xiàn)PNH的發(fā)生和再生障礙性貧血關(guān)系密切，絕大部分表現(xiàn)為再障過程中或痊愈后經(jīng)過一段時間才轉(zhuǎn)化為PNH，也存在極少一部分PNH患者經(jīng)過一段時間后轉(zhuǎn)為AA，所以AA病人也有克隆異常性造血，只是這種機(jī)制目前還不清楚，因此在治療過程中還需注意觀察疾病是否有進(jìn)行性變化。本實驗提示，所有健康人群的紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上CD55、CD59分子的陽性表達(dá)百分比均>90％，而PNH患者外周血細(xì)胞膜上CD55、CD59表面抗原分子的表達(dá)明顯降低，此外，有經(jīng)驗和研究表明同時檢測CD55+、CD59+和中性粒細(xì)胞對PNH的診斷意義更大，因為紅細(xì)胞的壽命一般較長且患者容易受輸血的影響。4結(jié)論采用流式細(xì)胞儀通過熒光標(biāo)記檢測外周血紅細(xì)胞和白細(xì)胞細(xì)胞膜上CD55和CD59的陽性表達(dá)，在PNH診斷中具有良好的前景應(yīng)用價值。而且，要求做檢測的患者提供近期輸血記錄，外周血和骨髓均可以做PNH克隆分析，同時檢測紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上CD55和CD59能避免嚴(yán)重溶血或反復(fù)輸血造成的結(jié)果誤差，能早期發(fā)現(xiàn)PNH克隆細(xì)胞，可以更加準(zhǔn)確地診斷PNH，是目前診斷PNH最可靠、最敏感的方法，是檢測PNH的金指標(biāo)及PNH、AA患者的長期監(jiān)測指標(biāo)，也是臨床鑒別診斷PNH和其他貧血性疾病的較好方法，可以為臨床治療提供有效依據(jù)，對貧血疾病臨床診斷與預(yù)后具有著重要的意義和應(yīng)用價值。參考文獻(xiàn)[1]張國材，鄭冬，孔慶瑜.用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD55及CD59表型對診斷陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的意義[J].新醫(yī)學(xué),2003,34(4):212-213.[2]楚青.流式細(xì)胞術(shù)在PNH診斷中的應(yīng)用體會[J].《世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘》2019，94.[3]吳敏樂，張臣青，黃家福，曾紹毅，王丹林.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者血細(xì)胞表面CD55和CD59的檢測及臨床意義[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2013,10(7):771-772.[4]馮玉虎,夏瑞祥,王衛(wèi)國.貧血患者外周血CD55、CD59檢測及對陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥的診斷意義[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2015(8):1262-1265.[5]母璨，陳科，韋靜.流式細(xì)胞術(shù)檢測對陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥的診斷價值.[J]《西部醫(yī)學(xué)》2017，1587-1589,1593.[6]肖作淼，張麗琴，張榮山.PNH實驗室檢測項目在贛南地區(qū)綜合醫(yī)院開展現(xiàn)狀調(diào)查[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2016,34(6):788-790.[7]鄭小江，廖麗娟，李春曉，陳宇鋒.流式細(xì)胞術(shù)檢測用于貧血患者血細(xì)胞CD55、CD59中的臨床意義[J]ModDiagnTreat現(xiàn)代診斷與治療，2017，Aug28，15.[8]華建媛，張凌，石慶之.流式細(xì)胞儀檢測CD55和CD59表型對貧血性疾病診斷的意義[J].實用臨床醫(yī)學(xué)，2011，12(2)：11-13.[9]王艷，左雅蓓，王玉昭．陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥的診治[J]河北醫(yī)藥，2012，34（3）：430一432.[10]劉志祥，李瑞明，王曉勛.CD55和CD59檢測對診斷陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的意義[J]中國誤診學(xué)雜志2008年11月第8卷第33期—8131一02.[11]曹文俊，王枕亞，石厚榮.CD55、CD59缺陷檢測及其在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿診斷中的意義.[J]診斷學(xué)理論與實踐，2004，6(3)：291.[12]高帥，吳玥.再障和溶血貧血患者外周血CD55及CD59的表達(dá)及意義[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2011，8(2-3)：9-10.[13]吳家明.貧血患者外周血CD55-和CD59-細(xì)胞檢測結(jié)果及其意義[J].臨床血液學(xué)雜志,2016，7(23):55-56.[14]張秋堂,秦福麗,劉少君.PNH患者外周血CD55、CD59測定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2017，9(7):23-24．[15]邵宗鴻，劉惠.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥病理機(jī)制.中國實用內(nèi)科雜志，2012，32（5）：324一326.[16]鄒農(nóng)，韓冰，蔡昊.76例陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者臨床特點分析[J].中華血液學(xué)雜志，2012，33（6）：471-474.[17]朱明清，耿美菊，陳黎.CD55、CD59檢測陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥標(biāo)準(zhǔn)方法建立[J].中國血液流變學(xué)雜志，2006，16（3）：447-448.[18]華建媛，張凌，石慶之.流式細(xì)胞儀檢測CD55和CD59表型對貧血性疾病診斷的意義[J].實用臨床醫(yī)學(xué)，2011，12(2)：11-13.[19]蘇靜，趙四書.流式細(xì)胞術(shù)檢測對PNH的診斷價值.[J]臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)雜志，2018，5(81).[20]劉淑媛，萬臘根，聞芳，李欣，張長林.FLAER檢測及其在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥診斷中的意義[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2015，2(1):33.[21]李艷，秦鐵軍，徐澤鋒.伴PNH克隆的骨髓增生異常綜合征患者臨床和實驗室特征分析[J].中國血液學(xué)雜志，2016，37(4).[22]邢起,陳慧,楊軍軍.流式細(xì)胞術(shù)檢測CD55、CD59對陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿診斷價值的探討[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2012(29):79-80.[23]秦彥,張翼鷟.骨髓增生異常綜合征伴陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿一例[J].白血病.淋巴瘤,2013(12):765-767.[24]何秋陽,馬順高.三種方法檢測陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿患者外周血結(jié)果分析[J].醫(yī)藥前沿,2015(4):34-35.[25]金明威,陳哲,陳穎.流式細(xì)胞術(shù)檢測CD55及CD59對診斷陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的意義[J].現(xiàn)代實