核心考點DAY08《基因工程》-1專題1.DNA的粗提取和鑒定(1)提取DNA的原理：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA,去除其他成分。如：①DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。②DNA在NaCI溶液中的溶解性：DNA在不同濃度的NaCI溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。(2)鑒定DNA的原理：在一定溫度下(沸水浴加熱)，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。（2025·江蘇·節(jié)選）川金絲猴是我國特有的珍稀瀕危物種，為了更好地保護(hù)這一物種，研究者開展了以下研究。請回答下列問題：研究者為了進(jìn)一步研究川金絲猴的食性，采集其糞便樣本，進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增，部分實驗過程如下。請完成下表：實驗?zāi)康暮喴僮鞑襟E釋放DNA在去雜后的樣本中加入裂解液析出DNA離心后?、偕锨逡?，加入乙醇②溶解DNA在沉淀物中加入純水?dāng)U增DNA將③4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、樣本DNA、含有Mg2+緩沖液、超純水等加入PCR管中，進(jìn)行PCR2.DNA的電泳鑒定（1）原理電泳原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定遷移速率在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)DNA檢測凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈燈下被檢測出來（2）步驟注入將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠(凝膠中含核酸染料)的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1~5V/cm,待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳觀察取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相（3）知識延伸DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物一種用于確定目的DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物，具有特定的DNA分子大小，一般置于第一個點樣孔中，標(biāo)識樣品的DNA大小核酸染料和指示劑指示劑是一種有顏色的標(biāo)記物，相當(dāng)于一個較小的DNA分子，但（與/不與）DNA結(jié)合，指示劑在電泳時移動較快且（能/不能）被肉眼觀察到，用于指示樣品的遷移過程，常用指示劑包括溴酚藍(lán)(藍(lán)紫色)和二甲苯青(藍(lán)色)。核酸染料核酸染料是一類（能/不能）夠與DNA或RNA分子結(jié)合，并在特定條件下顯示顏色或熒光的化學(xué)物質(zhì)，用于電泳后檢測核酸的位置。（2024·黑吉遼）關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實驗，下列敘述正確的是（

）A．瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小

B．凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置

C．在同一電場作用下，DNA片段越長，向負(fù)極遷移速率越快

D．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來【詳解】A、瓊脂糖凝膠的濃度會影響DNA分子在凝膠中的遷移率和分辨率，瓊脂糖凝膠的濃度通常是根據(jù)所需分離的DNA片段大小來選擇的。對于較大的DNA片段，比如基因組DNA或質(zhì)粒DNA，通常選擇較低濃度的瓊脂糖凝膠，因為它們需要更大的孔徑來有效遷移。而對于較小的DNA片段，比如PCR產(chǎn)物或酶切片段，則需要選擇較高濃度的瓊脂糖凝膠，以提供更好的分辨率和分離效果，A正確；B、凝膠載樣緩沖液指示劑通常是一種顏色較深的染料，可以作為電泳進(jìn)度的指示分子，當(dāng)溴酚藍(lán)到凝膠2/3處時(可看藍(lán)色條帶)，則停止電泳，B錯誤；C、在瓊脂糖凝膠電泳中，當(dāng)電場作用時，DNA片段實際上是向正極遷移的，而不是向負(fù)極遷移。同時，DNA片段的遷移速率與其大小成反比，即DNA片段越長，遷移速率越慢，C錯誤；D、瓊脂糖凝膠中的DNA分子需染色后，才可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。故選A。3.基因工程的定義：指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。（1）原理:基因重組。（2）操作對象:基因。（3）操作水平:DNA分子水平。（4）操作環(huán)境:生物（體內(nèi)/體外）進(jìn)行。（5）結(jié)果：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。（6）優(yōu)點：①定向改造生物的性狀（目的性強(qiáng)）。（與誘變育種相比）②克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙等。（與雜交育種相比）（7）不同生物的DNA能夠鏈接成功的原因是DNA都是由脫氧核苷酸組成和規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)，并且遵循堿基互補(bǔ)配對原則。4.基因工程的工具酶（1）功能原理能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。特點限制酶的識別和切割具有特異性（限制性，專一性），使用不同的限制酶可以切割不同的核苷酸序列。類型黏性末端（如：EcoRI）平末端(如：SmaI)在中軸線（圖中虛線）的兩側(cè)，限制酶在切斷DNA時，可在切口處帶有幾個伸出的核苷酸，堿基正好互補(bǔ)配對，因此稱這些片段為黏性末端。不產(chǎn)生單鏈的黏性末端。應(yīng)用①限制酶一般用于切斷DNA片段，獲取目的基因，為目的基因連接表達(dá)載體做準(zhǔn)備。②由于黏性末端具有特異性，可以保證DNA連接時具有特異性，因此在實驗設(shè)計中，通常選擇切割后形成黏性末端的酶，而避免使用切割后形成平末端的酶。思考①原核生物中存在限制酶的意義是什么？答：原核生物中限制酶的作用是切割（內(nèi)源/外源）DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。②限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？答：限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列被修飾。（2）特殊限制酶同裂酶異裂酶同尾酶識別相同序列，切割相同位點，產(chǎn)生相同的黏性末端（但反應(yīng)條件可能不同）識別相同序列，但切割不同位點。識別不同序列，產(chǎn)生相同的黏性末端。SphIBbuISmaIXmaI異端同尾酶異長同尾酶BamIBglIISau3AI【教材深挖】選擇性必修3P74，拓展應(yīng)用，11.有2個不同來源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SpeI進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI進(jìn)行切割。各限制酶的識別序列和切割位點如下。哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeI切割A(yù)片段產(chǎn)生的DNA片段相連接?為什么?XhoIXhoI和SpeI切割DNA產(chǎn)生相同的黏性末端不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義?答：同尾酶使構(gòu)建載體時，切割位點的選擇范圍（縮小/擴(kuò)大）。例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好沒有該限制酶的識別序列，這時可以考慮用合適的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有該酶的識別序列）來獲取目的基因。例1.某線性DNA分子含有3000個堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的識別序列和切割位點如圖所示。下列有關(guān)說法正確的是()A.在該DNA分子中，a酶與b酶的識別序列分別有3個和2個B.a酶與b酶切出的黏性末端不能相互連接C.a酶與b酶切斷的化學(xué)鍵不相同D.用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進(jìn)行反復(fù)切割、連接操作，若干循環(huán)后，序列會明顯增多【解析】A.在該線性DNA分子中，a酶與b酶的識別序列分別有2個和2個，D.由圖可知，經(jīng)a酶和b酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，可形成重組DNA分子，重組后的DNA分子沒有這兩種酶的識別序列，所以兩種限制酶都不能識別重組DNA分子，不能將其切割成片段，D正確。(2)DNA連接酶（連接兩個DNA片段）E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶都能連接（黏性末端/平末端/黏性末端和平末端）。但E.coliDNA連接酶連接雙鏈DNA片段的平末端效率遠(yuǎn)比T4DNA連接酶的效率（低/高）。例3.說出下列過程參與的酶（寫在箭頭下面）例4.下列所示的黏性末端是由幾種限制性內(nèi)切核酸酶作用產(chǎn)生的（D）①②③④A.1種B.2種C.3種D.4種圖中的黏性末端哪些能連接在一起嗎？①③、②④。方法：將某一個黏性末端旋轉(zhuǎn)180度。提升：理解重組質(zhì)粒和反義質(zhì)粒運載體：①基因在細(xì)胞中的穩(wěn)定復(fù)制需要有復(fù)制原點，基因的表達(dá)則需要啟動子和終止子，在研究中一般通過各種載體，提供不同的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)基因的復(fù)制和表達(dá)，其中最常用的是質(zhì)粒，其他運載體有噬菌體、動植物病毒（病毒具有特異性）②質(zhì)粒質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀（單鏈/雙鏈）DNA分子將目的基因插人質(zhì)粒中，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，可以在受體細(xì)胞根據(jù)功能可以將質(zhì)粒分為克隆載體和表達(dá)載體兩種常用載體。此外，有些載體還能起到基因編輯、基因敲除的功能，這里我們學(xué)習(xí)最常用的表達(dá)載體。結(jié)構(gòu)復(fù)制原點復(fù)制起始位點，使目的基因穩(wěn)定遺傳標(biāo)記基因?qū)⒑心康幕虻闹亟M質(zhì)粒篩選出來方便對基因進(jìn)行插入或其他操作標(biāo)記基因的類型標(biāo)記基因是質(zhì)粒上目的基因之外的另外一個基因，可以控制一些易于篩選和檢測的性狀，便于重組DNA分子的篩選?；蚬こ讨谐Ｓ玫臉?biāo)記基因有四種，分別是抗生素抗性基因、熒光基因、營養(yǎng)物質(zhì)合成基因、LacZ基因?？剐曰?qū)⒖股乜剐曰虻妮d體導(dǎo)人（敏感型/抗性型）的宿主細(xì)胞中，并在培養(yǎng)基中添加抗生素或除草劑，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物使受體細(xì)胞對該抗生素產(chǎn)生抗性可以淘汰轉(zhuǎn)化失敗的細(xì)胞，篩選出轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞。在題目中最常出現(xiàn)的抗性基因有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)及卡那霉素抗性基因(KanR)等影印法：例5.某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr衣示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHl酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌；未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌；含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌；含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌；含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌；含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌；含有插入目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌含有插入目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞不能區(qū)分的，其原因是二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不能生長如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是二者均含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含四環(huán)素培養(yǎng)基。圖中1、2、3、6、9（菌落號數(shù)）就是插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。熒光基因熒光基因可以表達(dá)出熒光蛋白，熒光蛋白可被激發(fā)出熒光，從而被觀察到。將熒光基因作為標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入各類細(xì)胞中，都可以通過熒光檢測轉(zhuǎn)入是否成功。（2021年6月浙江選考試題）采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因定點插入到受精卵的Y染色體上，獲得轉(zhuǎn)基因雄性小鼠。該轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型雌性小鼠交配，通過觀察熒光可確定早期胚胎的性別。下列操作錯誤的是（

B

）A．基因編輯處理的受精卵在體外培養(yǎng)時，不同發(fā)育階段的胚胎需用不同成分的培養(yǎng)液B．基因編輯處理的受精卵在體外培養(yǎng)至2細(xì)胞期，須將其植入同期發(fā)情小鼠的子宮，才可獲得表達(dá)EGFP的小鼠C．分離能表達(dá)EGFP的胚胎干細(xì)胞，通過核移植等技術(shù)可獲得大量的轉(zhuǎn)基因小鼠D．通過觀察早期胚胎的熒光，能表達(dá)EGFP的即為雄性小鼠胚胎【解析】：在桑椹胚或囊胚進(jìn)行胚胎移植。例7.（2023年6月浙江選考試題,T19）某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是（

）A.Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達(dá)B.翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子D.若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合【解析】分析題圖甲可知，啟動子在左側(cè)，GFP基因整合在Gata3基因的右側(cè)，啟動子啟動轉(zhuǎn)錄后，可以使GFP基因轉(zhuǎn)錄，Gata3基因的啟動子能控制GFP基因的表達(dá)，A錯誤；因啟動子在左側(cè)，轉(zhuǎn)錄的方向向右，合成的mRNA從左向右為├5′→3′┤，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；整合GFP基因后，核酸片段變長，2號個體只有大片段，所以是Gata3?GFP基因純合子，4號個體只有小片段，是野生型，C錯誤；用引物1和引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，雜合子和Gata3?GFP基因純合子均能擴(kuò)增出條帶，僅有Gata3基因時無法擴(kuò)增出條帶，不利于區(qū)分雜合子和純合子，D錯誤。營養(yǎng)物質(zhì)合成基因用營養(yǎng)缺陷型的微生物作為轉(zhuǎn)基因的宿主（受體細(xì)胞）時，可以使用營養(yǎng)物質(zhì)合成基因作為標(biāo)記基因，例如，與野生型相比，亮氨酸合成缺陷型酵母菌在(含/不含）亮氨酸的培養(yǎng)基中不能生存，將亮氨酸合成基因作為標(biāo)記基因?qū)肓涟彼岷铣扇毕菪徒湍妇?，在不含亮氨酸的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)入成功的酵母菌可以形成菌落，轉(zhuǎn)入失敗的酵母菌不能生存。沒有找到病毒作為運載體的題目，以缺陷型細(xì)菌的篩選為例了解一下營養(yǎng)合成缺陷基因。菌種M和茵種N在發(fā)酵工程應(yīng)用上具有不同的優(yōu)越性，為了獲得具有它們共同優(yōu)良性狀的融合菌，進(jìn)行了下圖所示的實驗。已知菌種M為組氨酸依賴(組氨酸合成相關(guān)基因突變?yōu)锽-),菌種N為色氨酸依賴(色氨酸合成相關(guān)基因突變?yōu)锳-),下列分析錯誤的是()A.菌種M和N可通過人工誘變和選擇性培養(yǎng)選獲得B.用PEG誘導(dǎo)融合之前需要去除菌種M和N的細(xì)胞壁C.在培養(yǎng)基X中添加組氨酸和色氨酸以篩選出雜種融合菌D.從培養(yǎng)基X中分離出的雜種融合菌P對兩種氨基酸均不依賴【解析】：融合的細(xì)胞A+A-B+B-可以在缺少色氨酸和組氨酸的培養(yǎng)基上生長LacZ基因（顯色法），常用藍(lán)白斑篩選法LacZ基因（顯色法），常用藍(lán)白斑篩選法圖示中,菌落1、2、5、6呈藍(lán)色，是導(dǎo)入質(zhì)粒的受體菌?！窘滩纳钔凇窟x擇性必修3P98，復(fù)習(xí)與提高，1例8.1.某動物體內(nèi)含有研究者感興趣的目的基因，研究者欲將該基因?qū)舜竽c桿菌的質(zhì)粒中保存。該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位點，其結(jié)構(gòu)和簡單的操作步驟如下圖所示。回答問題：【我們假設(shè)：在②步中使用單酶切】（1）在②步中，應(yīng)怎樣選擇限制酶？答：第一，應(yīng)選擇用（相同/不同）的限制酶或切割能產(chǎn)生（相同/不同）末端的限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段；第二，注意限制酶的切割位點（能/不能）位于目的基因的內(nèi)部，以防破壞目的基因,限制酶也不能破壞質(zhì)粒的啟動子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點等結(jié)構(gòu)。（2）在第③步中，為了使質(zhì)粒DNA與目的基因能連接，還需要在混合物中加入哪種物質(zhì)?DNA連接酶（3）選用含有AmpR和LacZ基因的質(zhì)粒進(jìn)行實驗有哪些優(yōu)勢?答：該質(zhì)粒便于進(jìn)行雙重篩選。標(biāo)記基因AmpR基因可用于檢測質(zhì)粒是否導(dǎo)入了大腸桿菌，一般只有導(dǎo)入了質(zhì)粒的大腸桿菌才能在添加了青霉素的培養(yǎng)基上生長。而由于LacZ基因的效應(yīng)，這些生長的菌落可能出現(xiàn)兩種顏色：含有空質(zhì)粒(沒有連接目的基因的質(zhì)粒)的大腸桿菌菌落呈藍(lán)色；含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落呈白色。（4）含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落將呈現(xiàn)什!么顏色?為什么?答：有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落呈白色。因為目的基因插入目的基因了LacZ基因的結(jié)構(gòu)，使其不能正常表達(dá)成β-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不會被分解。附：我們可以看到單酶切會產(chǎn)生目的基因自身環(huán)化、質(zhì)粒自身環(huán)化、目的基因和質(zhì)粒的反向連接，為克服該缺點，保證目的基因和質(zhì)粒的正確（正向）連接，采取的方法是用兩種不同的限制酶（產(chǎn)生不同的末端）同時切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒。③動物細(xì)胞不含質(zhì)粒，如果要向動物細(xì)胞導(dǎo)人外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒。病毒具工具之一。圖示中,菌落1、2、5、6呈黑色，是未轉(zhuǎn)化的受體菌。圖示中,菌落3呈藍(lán)色，是導(dǎo)入λDNA載體的受體菌。慢病毒是一種RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，可以將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞基因組DNA上，從而實現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳腺病毒是一種DNA病毒。它通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中?？梢岳闷銬NA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因、基因編輯、基因沉默等操作λ噬菌體是一種溫和噬菌體，可以將基因整合到宿主細(xì)胞基因裂解宿主細(xì)胞，從而沒有找到病毒作為運載體的題目，以噬菌體的篩選為例了解一下雙層平板法。例8.雙層平板法是一種利用底層和上層均為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對噬菌體進(jìn)行檢測的常用方法。具體操作如下：先在無菌培養(yǎng)皿中倒入瓊脂含量是2%的培養(yǎng)基凝固成底層平板后，將瓊脂含量是1%的培養(yǎng)基熔化并冷卻至45-48℃,然后加入宿主細(xì)菌和待測噬菌體稀釋懸液的混合液，充分混勻后立即倒入底層平板上形成雙層平板。培養(yǎng)一段時間后，在上層平板上看見由于噬菌體侵染周圍細(xì)菌而使宿主細(xì)胞裂解死亡形成的空斑即噬菌斑。通常一個噬菌斑來自原液中的一個噬菌體，根據(jù)噬菌斑的數(shù)目計算原液中噬菌體的數(shù)量，如圖所示。下列敘述正確的是(B)A.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可作為選擇培養(yǎng)基選擇出噬菌體的宿主細(xì)胞B.加入混合液后，使用滅菌后的涂布器將混合液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面C.上層培養(yǎng)基中瓊脂濃度較高，因此形成的噬菌斑較大，更有利于計數(shù)D.雙層平板法獲得的噬菌斑不易發(fā)生上下重疊現(xiàn)象【解析】：B項與題干矛盾。底層平板起到支撐上層平板，是上層平板保持平整，是菌落更清晰。目的基因的篩選與獲?。?）真核生物、原核生物基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)（2）目的基因的篩選與獲取隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會和可能。①從基因文庫中直接獲取基因組文庫的構(gòu)建部分基因文庫（如cDNA文庫）構(gòu)建基因組文庫cDNA文庫文庫大小大小基因中啟動子有無基因中內(nèi)含子有無基因多少全部部分物種間的基因交流部分可以可以②人工合成前提：基因比較（大/?。?、核苷酸序列（未知/已知）方法：通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因逆轉(zhuǎn)錄法即以總mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，若要運用該方法獲得人的胰島素基因，則只能從人的胰島B細(xì)胞中提取到胰島素的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取胰島素基因；原因是胰島素基因只會在胰島B細(xì)胞中表達(dá)，其他細(xì)胞不表達(dá)。上述方法獲得的胰島素基因（cDNA）在基因結(jié)構(gòu)的特點是只包含了編碼區(qū)的外顯子序列，沒有非編碼區(qū)和內(nèi)含子?；瘜W(xué)合成法(蛋白質(zhì)工程)P94A.蛋白質(zhì)工程運用化學(xué)合成法合成目的基因的基本途徑是預(yù)期的蛋白質(zhì)功能→設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到對應(yīng)的脫氧核苷酸序列?；瘜W(xué)法合成的目的基因（含/不含）內(nèi)含子、啟動子和終止子？參與翻譯的mRNA序列是由編碼序列轉(zhuǎn)錄而來的。C.若是控制同一種蛋白質(zhì)合成的目的基因，利用化學(xué)合成法合成的基因可能有（一種/多種）；理由是遺傳密碼具有簡并（一種氨基酸可由多個密碼子編碼）。D.化學(xué)合成法（能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物產(chǎn)生新的性狀以滿足人類的要求③利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因A.RCR概念：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。B.條件:前提條件：已知目的基因的核苷酸序列。一定的緩沖溶液(含Mg2+)、DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸（或dNTP）、耐高溫的DNA聚合酶、控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行a.引物：【定義】引物是一小段能與DNA母鏈的一小段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸（單鏈DNA或單鏈RNA）。用于PCR的引物長度通常為20-30個核苷酸的DNA?！驹O(shè)計原則】引物自身不能環(huán)化;兩種引物之間不能互補(bǔ)配對;引物長度不宜過短，防止引物隨機(jī)結(jié)合,產(chǎn)生非特異性條帶，不可過長，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低?！咀饔谩?種，引物的5′端分別與兩條模板鏈3′端結(jié)合，為DNA聚合酶提供了游離的3′端，使耐高溫的DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。b.4種脫氧核苷酸：合成DNA子鏈的原料(dNTP，包括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP),又提供能量。c.真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。d.模板DNA兩條母鏈:提供DNA復(fù)制的模板e.耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）:催化合成DNA子鏈。f.高溫：斷開氫鍵，打開DNA雙鏈。（體內(nèi)進(jìn)行DNA復(fù)制時需要解旋酶斷開氫鍵。）C.過程：P78變性：溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時，2種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。延伸：溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。BBBBAAAABBBBAAAABBBBBBBBBBAAAAAAAAAABBBBBBBBBBAAAAAAAAAA擴(kuò)增次數(shù)第1次第2次第3次第4次第N次DNA總數(shù)212223242n長鏈-中長鏈DNA22222中長鏈-短鏈DNA02462(n-1)短鏈-短鏈DNA【等長的DNA分子數(shù)（目的基因）】00282n-2n含引物A(或B)的DNA137152n-16.基因工程的核心——基因表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是：讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用作用。（1）啟動子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段②功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。③誘導(dǎo)型啟動子：當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。④啟動子具有物種和組織特異性：即只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)。如：利用基因工程技術(shù)，還可以讓哺乳動物批量生產(chǎn)藥物?？茖W(xué)家將藥用蛋白基因與乳腺細(xì)胞中特異表達(dá)的基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起，通過顯微注射的方法導(dǎo)入哺乳動物的受精卵中，由這個受精卵發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因動物在進(jìn)入泌乳期后，可以通過分泌乳汁來生產(chǎn)所需要的藥物，這稱為乳腺生物反應(yīng)器或乳房生物反應(yīng)器。又如：構(gòu)建在水稻胚乳細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的表達(dá)載體需要選擇的啟動子是水稻胚乳細(xì)胞中特異表達(dá)的基因的啟動子。（2）終止子：①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段②功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來。綜上可知目的基因必須插入啟動子和終止子之間。復(fù)制原點：使能完成自主復(fù)制。（2025年四川，保證載體能在XX細(xì)胞中能正常復(fù)制）單酶和雙酶切割比較:單酶切：獲取目的基因和切割載體時,通常使用同種限制酶,目的是為了產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接。但是使用該法缺點是容易發(fā)生目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒隨意連接，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是分別使用兩種限制酶去切割目的基因和質(zhì)粒。雙酶切的優(yōu)點：①防止質(zhì)粒自身環(huán)化②防止目的基因自身環(huán)化使質(zhì)粒和目的基因正確（正向）連接③避免目的基因和質(zhì)粒的隨意連接（詳見：第4頁的重組質(zhì)粒和反義質(zhì)粒）提升：正向連接質(zhì)粒和反向連接的質(zhì)粒的篩選方法一：酶切法例8.(2022·福建，13節(jié)選)載體和CD14片段的酶切位點及相應(yīng)的酶切抗性基因序列如圖所示。用XhoⅠ和SalⅠ分別酶切CD14和圖中載體連接，CD14接入載體時會形成正向連接和反向連接的兩種重組DNA?？蛇M(jìn)一步用這兩種限制酶對CD14的連接方向進(jìn)行鑒定，理由是正向連接的重組DNA有這兩種酶切位點(限制酶的識別序列)；而反向連接的重組DNA會形成新的序列，沒有這兩種酶的酶切位點(沒有限制酶的識別序列)。例9.（2025·山東·21節(jié)選）種子休眠是抵御穗發(fā)芽的一種機(jī)制。通過對Ti質(zhì)粒的改造，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Ti質(zhì)粒上的T-DNA隨機(jī)整合到小麥基因組中，篩選到2個種子休眠相關(guān)基因的插入失活純合突變體。與野生型相比，突變體種子的萌發(fā)率降低。小麥基因組序列信息已知。Ti質(zhì)粒上與其在農(nóng)桿菌中的復(fù)制能力相關(guān)的結(jié)構(gòu)為。選用圖甲中的SmaI對抗除草劑基因X進(jìn)行完全酶切，再選擇SmaI和對Ti質(zhì)粒進(jìn)行完全酶切，將產(chǎn)生的黏性末端補(bǔ)平，補(bǔ)平時使用的酶是。利用DNA連接酶將酶切后的包含抗除草劑基因X的片段與酶切并補(bǔ)平的Ti質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；經(jīng)卡那霉素篩選并提取質(zhì)粒后再選用限制酶進(jìn)行完全酶切并電泳檢測，若電泳結(jié)果呈現(xiàn)一長一短2條帶，較短的條帶長度近似為bp，則一定為正向重組質(zhì)粒?！敬鸢浮?1)復(fù)制原點XbaIDNA聚合酶SmaI和SpeI550bp【詳解】（1）DNA復(fù)制的起點是復(fù)制原點，因此Ti質(zhì)粒上與其在農(nóng)桿菌中的復(fù)制能力相關(guān)的結(jié)構(gòu)為復(fù)制原點。根據(jù)SmaI限制酶識別序列可知，酶切形成的是平末端，若質(zhì)粒僅用SmaI酶切，抗除草劑基因和質(zhì)?？梢哉蚪尤胍部梢苑聪蚪尤?，且無法區(qū)分，為了確定是否是正向重組質(zhì)粒，因此在構(gòu)建重組質(zhì)粒時需要用到另一種限制酶，抗除草劑因需要插入到啟動子和終止子之間，因此不能選擇BamHI，因為該限制酶會破壞終止子，因此可選擇XbaI和SmaI進(jìn)行酶切，XbaI酶切會形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脫氧核糖核苷酸單體將產(chǎn)生的黏性末端補(bǔ)平（可使重組質(zhì)粒最小，同時PstI酶切后產(chǎn)生的黏性末端無法用DNA聚合酶抹平，因為DNA聚合酶只能從3'延伸子鏈）。利用DNA連接酶將酶切后的包含抗除草劑基因X的片段與酶切并補(bǔ)平的Ti質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。重組的T-DNA片段上含有一個SmaI酶切位點和一個SpeI酶切位點，可以選擇用SmaI和SpeI進(jìn)行酶切，轉(zhuǎn)錄的方向是從模板的3'→5'，和質(zhì)粒對應(yīng)的方向相同，經(jīng)過兩種酶的酶切后并電泳呈現(xiàn)一長一短2條帶，較短的條帶長度近似為550bp，若反向接，較短的條帶長度近似為200bp。方法二：PCR例10.(高考題節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計引物進(jìn)行PCR鑒定。圖中A所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時應(yīng)選擇的一對引物是乙和丙。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是目的基因反向連接?！窘馕觥咳鐖DA所示，如果用引物乙和丙，若正確連接則會產(chǎn)生350bp片段，反向連接則不會出現(xiàn)；同理，若用引物甲和丙，無論正向連接還是反向連接均會產(chǎn)生450bp片段。根據(jù)圖B進(jìn)行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向連接會擴(kuò)增出400bp片段?！灸芰μ嵘浚褐攸c難點·透析（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）1.限制酶的選擇(1)目的基因①應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇限制酶SmaI。②為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲可選擇PstI和EcoRI兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也能被切出相同的黏性末端，如圖乙)。(2)質(zhì)粒(3)Ti質(zhì)粒的T－DNA片段DNA上也要有標(biāo)記基因，篩選將T-DNA片段整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上的受體細(xì)胞篩選出來。例11.(2024·湖南，21節(jié)選)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價值，科研人員對其進(jìn)行了多種育種技術(shù)研究。研究人員從野生百合中獲得一個抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因L，該基因及其上游的啟動子pL和下游的終止子結(jié)構(gòu)如圖a。圖b是一種Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中基因gus編碼GUS酶，GUS酶活性可反映啟動子活性。(1)研究病原微生物對L的啟動子pL活性的影響。從圖a所示結(jié)構(gòu)中獲取pL，首先選用_________________酶切，將其與相同限制酶酶切的Ti質(zhì)粒連接，再導(dǎo)入煙草?！敬鸢浮縃indⅢ、BamHⅠ【解析】根據(jù)目的片段以及質(zhì)粒上限制酶的識別位點，若要獲得啟動子pL并連接到質(zhì)粒上，可選用限制酶HindⅢ、BamHⅠ進(jìn)行酶切，以替換Ti質(zhì)粒中的啟動子，從而達(dá)到根據(jù)GUS酶活性反映啟動子活性的目的。例12.（2025·黑吉遼蒙·節(jié)選）香樹脂醇具有抗炎等功效，從植物中提取難度大、產(chǎn)率低。通過在酵母菌中表達(dá)外源香樹脂醇合酶基因N，可高效生產(chǎn)香樹脂醇。回答下列問題。(1)可從中查詢基因N的編碼序列，設(shè)計特定引物。如圖1所示，a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，為保證基因N與質(zhì)粒pYL正確連接，需在引物1和引物2的5'端分別引入和限制酶識別序列。PCR擴(kuò)增基因N，特異性酶切后，利用連接DNA片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，大小約9.5kb（kb為千堿基對），假設(shè)構(gòu)建重組質(zhì)粒前后，質(zhì)粒pYL對應(yīng)部分大小基本不變。(2)進(jìn)一步篩選構(gòu)建的質(zhì)粒，以1-4號菌株中提取的質(zhì)粒為模板，使用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2。在第5組的PCR反應(yīng)中，使用無菌水代替實驗組的模板DNA，目的是檢驗PCR反應(yīng)中是否有的污染。初步判斷實驗組（從“1-4”中選填）的質(zhì)粒中成功插入了基因N，理由是?！敬鸢浮?1)基因數(shù)據(jù)庫/序列數(shù)據(jù)庫XhoⅠXbaⅠDNA連接酶(2)外源DNA1目的基因N大小為2.3kb【詳解】（1）GenBank是目前國際上廣泛使用的序列數(shù)據(jù)庫之一，它的數(shù)據(jù)主要是各國的實驗室、測序機(jī)構(gòu)等發(fā)布的序列信息。利用這個數(shù)據(jù)庫，我們可以便捷地檢索到基因和蛋白質(zhì)的序列信息；故可從序列數(shù)據(jù)庫或基因數(shù)據(jù)庫中查詢基因N的編碼序列，設(shè)計特定引物。保證基因N與質(zhì)粒pYL正確連接，需要使用雙酶切法，為了目的基因能正確表達(dá)，目的基因需要插入質(zhì)粒的啟動子和終止子之間，且質(zhì)粒和目的基因需要使用相同的酶或能產(chǎn)生相同黏性末端的酶；分析圖1可知，質(zhì)粒pYL應(yīng)該選用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ識別序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，但XbaⅠ與其具有相同的黏性末端，基因N酶切時可以用XbaⅠ替換SpeⅠ，即N基因兩端應(yīng)該含有XbaⅠ和XhoⅠ識別序列；題干信息：N基因a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，才有引物1和引物2擴(kuò)增N基因，則擴(kuò)增后模板鏈的5'端含有引物1序列，而編碼鏈的5'端含有引物2序列，結(jié)合質(zhì)粒pYL上的啟動子和終止子方向，可知應(yīng)該在引物2需要5'端添加XbaⅠ、引物15'端添加XhoⅠ識別序列。PCR擴(kuò)增基因N，特異性酶切后，利用DNA連接酶連接DNA片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，大小約9.5kb（kb為千堿基對），假設(shè)構(gòu)建重組質(zhì)粒前后，質(zhì)粒pYL對應(yīng)部分大小基本不變。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒，大小約9.5kb（kb為千堿基對），假設(shè)構(gòu)建重組質(zhì)粒前后，質(zhì)粒pYL對應(yīng)部分大小基本不變，而質(zhì)粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小為2.3kb；分析電泳圖可知，初步判斷實驗組1的質(zhì)粒中成功插入了基因N。在第5組的PCR反應(yīng)中，使用無菌水代替實驗組的模板DNA，目的是檢驗PCR反應(yīng)體系是否存在污染，即檢驗PCR反應(yīng)中是否有外源DNA污染。例13.（2025·陜晉青寧·節(jié)選）馬鈴薯作為重要農(nóng)作物，提高其冷耐受性可拓展優(yōu)質(zhì)馬鈴薯的種植區(qū)域。我國科研人員發(fā)現(xiàn)，野生馬鈴薯中S基因的表達(dá)與其冷耐受性調(diào)控有關(guān)，將該基因?qū)朐耘囫R鈴薯中可顯著增強(qiáng)其抗寒能力?；卮鹣铝袉栴}。(2)圖中標(biāo)識了載體和S基因中限制酶的切割位點。為將S基因正確插入載體，PCR擴(kuò)增S基因時需在引物的（填“5'端”或“3'端”）添加限制酶識別序列，結(jié)合上表分析，上游引物應(yīng)添加的堿基序列是5'--3'，切割載體時應(yīng)選用的兩種限制酶是，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體分別被限制酶切割后，經(jīng)純化和連接，獲得含S基因的表達(dá)載體并導(dǎo)入農(nóng)桿菌?！敬鸢浮?2)5'端AGATCTBamHⅠ、EcoRⅠ【詳解】（2）為了使目的基因能夠被限制酶切割，擴(kuò)增目的基因時，需要在引物的5'端添加限制酶的識別序列。結(jié)合圖表分析，在載體的啟動子和終止子之間有BamHI、EcoRI和XbaI的識別序列，而S基因內(nèi)部含有XbaI、NdeI和BamHI的識別序列，要用BamHI、EcoRI或XbaI切割載體，又不能用XbaI、NdeI或BamHI切割S基因，再根據(jù)各種限制酶的識別序列及切割位點，可知，需要用BamHI、EcoRI切割載體，用BamHI的同尾酶BglⅡ和EcoRI切割S基因，故PCR擴(kuò)增S基因時需在上游引物添加的堿基序列是5'-AGATCT-3'。2.注意教材上的兩句話（1）P72，在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改造的。（2）P82，基因表達(dá)載體的構(gòu)建的方法也不是千篇一律的。例13.（2025·周測8）MseⅠ（GAAT↓TAATTC）、PstⅠ（C↓TGCAG）、EcoRⅠ（G↓AATTC）三種限制酶的識別序列及切割位點,下圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切點。若要用上圖質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒,需要對質(zhì)粒進(jìn)行改造,構(gòu)建新的限制酶切位點。在構(gòu)建新的限制酶切位點的過程中需要使用的酶是（）A.限制酶PstⅠ、DNA連接酶、DNA聚合酶B.限制酶EcoRⅠ、DNA連接酶、DNA聚合酶C.限制酶EcoRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶D.限制酶PstⅠ、限制酶EcoRⅠ、DNA連接酶【詳解】例14.（2025·周測8）研究人員利用Ti質(zhì)粒構(gòu)建p—H5/H3共表達(dá)重組質(zhì)粒（如下圖)。設(shè)計思路是：獲得H5基因和H3基因，先將H5基因整合到含卡那霉素抗性基因的T-DNA(僅含有NheⅠ和XhoⅠ酶切位點）上，再將H3基因插入，獲得重組質(zhì)粒。為達(dá)到實驗?zāi)康?，需在H5基因兩端分別引入___________和_________________酶切位點。通常酶切位點的引入方法是在PCR過程中，通過設(shè)計使其出現(xiàn)在_______中，進(jìn)而出現(xiàn)在H5基因中?！驹斀狻?.啟動子（1）啟動子具有物種和組織特異性(選擇性必修3P90)。即只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)。（2）誘導(dǎo)型啟動子（選擇性必修3P80）例15.（2024年河北卷，T22）新城疫病毒可引起家禽急性敗血性傳染病，我國科學(xué)家將該病毒相關(guān)基因改造為r2HN，使其在水稻胚乳特異表達(dá)，制備獲得r2HN疫苗，并對其免疫效果進(jìn)行了檢測。(1)實驗所用載體的部分結(jié)構(gòu)及其限制酶識別位點如圖1所示。其中GtP為啟動子，若使r2HN僅在水稻胚乳表達(dá)，GtP應(yīng)為啟動子。Nos為終止子，其作用為。r2HN基因內(nèi)部不含載體的限制酶識別位點。因此，可選擇限制酶和對r2HN基因與載體進(jìn)行酶切，用于表達(dá)載體的構(gòu)建?！敬鸢浮克九呷橹刑禺愋员磉_(dá)的基因的使轉(zhuǎn)錄終止HindⅢ和EcoRⅠ【解析】利用水稻細(xì)胞培育能表達(dá)r2HN的水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器，在胚乳中特異性表達(dá)的基因的啟動子在水稻胚乳細(xì)胞中更容易被RNA聚合酶識別和結(jié)合而驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。Nos為終止子，終止子可以終止轉(zhuǎn)錄。KpnⅠ破壞了啟動子序列，SacⅠ位于終止子序列，均不能選用，且r2HN基因內(nèi)部不含載體的限制酶識別位點，則為了將目的基因插入載體的啟動子和終止子之間，則需要用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ對r2HN基因與載體進(jìn)行酶切，用于表達(dá)載體的構(gòu)建。例16.（2024年廣東五校聯(lián)考）利用細(xì)菌靶向給藥在腫瘤治療領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注?？蒲腥藛T改造大腸桿菌，制造出能定點、可控表達(dá)治療性抗體的工程菌?；卮鹣铝袉栴}：聚焦超聲能使腫瘤部位的溫度從37℃提升至42℃，可作為工程菌的“溫度開關(guān)”。研究人員篩選出3種轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，37℃時，轉(zhuǎn)錄抑制蛋白與誘導(dǎo)型啟動子結(jié)合，抑制下游綠色熒光蛋白（GFP）基因的轉(zhuǎn)錄；42℃時，轉(zhuǎn)錄抑制蛋白空間結(jié)構(gòu)改變，不再與誘導(dǎo)型啟動子結(jié)合。①研究人員構(gòu)建了下圖所示表達(dá)載體，以篩選最佳感溫元件。除圖中所含元件外，表達(dá)載體還必須具有

和氨芐青霉素抗性基因、限制酶酶切位點等元件。長時間培養(yǎng)時在培養(yǎng)液中加入氨芐青霉素，其作用是

。（寫出兩點即可）②檢測導(dǎo)入不同轉(zhuǎn)錄抑制蛋白基因的大腸桿菌在不同溫度下的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如下圖所示。最終選擇轉(zhuǎn)錄抑制蛋白（填“A”或“B”或“C”）來構(gòu)建工程菌，理由是。(2)上述表達(dá)載體僅在42℃時表達(dá)，而腫瘤治療需要長期進(jìn)行?？蒲腥藛T繼續(xù)對表達(dá)載體進(jìn)行如下圖所示改造，整合酶可將P7序列進(jìn)行一次永久性翻轉(zhuǎn)。請預(yù)測以下培養(yǎng)條件下改造后的工程菌菌落的顏色：Ⅰ.37℃培養(yǎng)；Ⅱ.42℃培養(yǎng)；Ⅲ.42℃處理1h后，37℃培養(yǎng)。（填“無色”或“綠色”）為得到可用于腫瘤治療的工程菌，需進(jìn)一步改造上述工程菌。請選擇下圖中X、Y、Z三個位點中的一個作為治療性抗體編碼基因的插入位點?！敬鸢浮浚?）終止子和復(fù)制原點防止雜菌污染、將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來37℃時熒光強(qiáng)度低，安全性高；42℃熒光提高倍數(shù)最大，靈敏度高（2）無色綠色綠色（3）X【詳解】（1）①質(zhì)粒中含有氨芐青霉素抗性基因，而表達(dá)載體沒有進(jìn)入的細(xì)菌沒有，長時間培養(yǎng)時在培養(yǎng)液中加入氨芐青霉素，其作用是去除丟失質(zhì)粒的細(xì)菌，抑制雜菌生長。②由圖可知，37℃下熒光強(qiáng)度很低，安全性高，42℃下熒光強(qiáng)度提高倍數(shù)最大，靈敏度高，所以最終選擇轉(zhuǎn)錄抑制蛋白C來構(gòu)建工程菌。（2）Ⅰ.在37°C培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)錄抑制蛋白與誘導(dǎo)型啟動子結(jié)合，抑制整合酶基因表達(dá)，P7序列不能翻轉(zhuǎn)，下游綠色熒光蛋白（GFP）基因無法轉(zhuǎn)錄表達(dá)，所以工程菌菌落無色。Ⅱ.在42°C培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)錄抑制蛋白空間結(jié)構(gòu)改變，不再與誘導(dǎo)型啟動子結(jié)合，整合酶基因表達(dá)，使P7序列翻轉(zhuǎn)，GFP基因可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)，工程菌菌落為綠色。Ⅲ.在42°C處理1h后，P7序列被整合酶永久性翻轉(zhuǎn)，之后在37°C培養(yǎng)時，由于P7序列翻轉(zhuǎn)后的結(jié)構(gòu)變化，使得GFP基因可以持續(xù)表達(dá)，工程菌菌落為綠色。（3）將治療性抗體編碼基因插入X位點，可實現(xiàn)機(jī)體正常部位不表達(dá)，僅當(dāng)腫瘤部位升溫至42℃后，才激活并持續(xù)表達(dá)，實現(xiàn)長期、定點的腫瘤治療，所以擇圖5中X位點作為治療性抗體編碼基因的插入位點。例17.（2025·廣東）大腸桿菌是重要工業(yè)菌株之一，其培養(yǎng)過程可分為快速生長期和生長穩(wěn)定期兩個階段。為了通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與降解速率來動態(tài)調(diào)控代謝途徑關(guān)鍵酶的蛋白量，使細(xì)胞適配不同階段的生產(chǎn)需求，研究者設(shè)計了兩種質(zhì)粒，并以穩(wěn)定性好的紅色熒光蛋白mKate2為模式蛋白。測試質(zhì)粒功能。回答下列問題：(1)研究者首先構(gòu)建質(zhì)粒①（圖a）用于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)C-末端帶SsrA短肽的mKate2，將質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后，在添加抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基上菌落的生長狀況，結(jié)合PCR及檢測，篩選獲得重組菌株W1。(2)將W1在適宜條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，定時取樣檢測培養(yǎng)液中細(xì)胞密度，方法有（答一種）。接種前需檢測液體培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度，其作用是。培養(yǎng)結(jié)果（圖b）表明，進(jìn)入生長穩(wěn)定期后熒光強(qiáng)度快速下降，原是。(3)研究者選用啟動子PX、X基因（編碼阻遏蛋白X，阻遏PX開啟轉(zhuǎn)錄），重新構(gòu)建質(zhì)粒②（圖a），導(dǎo)入野生型大腸桿菌中獲得重組菌株W2。在適宜條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，W2的生長趨勢不變，培養(yǎng)期間熒光強(qiáng)度的變化趨勢為。(4)莽草酸是一種重要工業(yè)化學(xué)品，其胞內(nèi)合成代謝途徑見圖c。由于野生型大腸桿菌胞內(nèi)酶A活性弱，且莽草酸會被快速轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生長必需物，因此細(xì)胞中無法大量積累莽草酸。為了保證細(xì)胞正常生長，并在生長穩(wěn)定期實現(xiàn)莽草酸的大量積累，利用上述兩種質(zhì)粒的調(diào)控功能，結(jié)合野生型菌株遺傳物質(zhì)的改造，提出重組生產(chǎn)菌株構(gòu)建思路：?！敬鸢浮?1)熒光(2)稀釋涂布平板法、顯微鏡直接計數(shù)法排除培養(yǎng)基本身熒光對實驗結(jié)果的干擾PGro在生長穩(wěn)定期停止基因轉(zhuǎn)錄，且?guī)в蠸srA短肽的mKate2被降解(3)快速生長期無熒光，生長穩(wěn)定期熒光強(qiáng)度先上升后保持穩(wěn)定(4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再將質(zhì)粒①中的mKate2基因替換為酶B基因，將質(zhì)粒②中的mKate2基因替換為酶A基因，并將兩種質(zhì)粒導(dǎo)入野生菌株中【詳解】（1）在基因工程中，篩選重組菌株時，常用的檢測方法除了PCR，根據(jù)質(zhì)粒中存在紅色熒光蛋白基因，可利用熒光檢測，篩選獲得重組菌株W1。（2）檢測培養(yǎng)液中細(xì)胞密度常用的方法有稀釋涂布平板法（通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)來估算細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而得到細(xì)胞密度）、顯微鏡直接計數(shù)法（利用血細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下直接對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)）。接種前檢測液體培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度，是為了排除培養(yǎng)基本身熒光對實驗結(jié)果的干擾，作為空白對照。進(jìn)入生長穩(wěn)定期后，由于PGro在生長穩(wěn)定期停止基因轉(zhuǎn)錄，所以不再合成帶有SsrA短肽的mKate2，同時C-末端帶有SsrA短肽的蛋白質(zhì)可被大腸桿菌內(nèi)源蛋白酶系統(tǒng)特異性識別并以一定速率降解，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度快速下降。（3）在重組菌株W2中，啟動子PX被阻遏蛋白X阻遏轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞快速生長階段，阻遏蛋白X阻遏mKate2基因的表達(dá)；隨著細(xì)胞進(jìn)入生長穩(wěn)定器，阻遏蛋白X停止表達(dá)并被降解，對PX啟動子的阻遏作用降低，mKate2基因開始表達(dá)，熒光強(qiáng)度開始上升，由于原料的限制，最后保持穩(wěn)定，所以培養(yǎng)期間熒光強(qiáng)度的變化趨勢為快速生長期無熒光，生長穩(wěn)定期熒光強(qiáng)度先上升后保持穩(wěn)定。（4）為了保證細(xì)胞正常生長，并在生長穩(wěn)定期實現(xiàn)莽草酸的大量積累，利用上述兩種質(zhì)粒的調(diào)控功能，結(jié)合野生型菌株遺傳物質(zhì)的改造，提出重組生產(chǎn)菌株構(gòu)建思路是：首先對野生型大腸桿菌進(jìn)行改造，敲除酶B基因；然后將質(zhì)粒①中的mKate2基因替換為酶B基因，使相關(guān)代謝途徑關(guān)鍵酶在快速生長期正常表達(dá)以保證細(xì)胞正常生長，進(jìn)入生長穩(wěn)定期后該酶降解，減少對莽草酸的轉(zhuǎn)化；同時將質(zhì)粒②中的mKate2基因替換為酶A基因，利用其調(diào)控機(jī)制在生長穩(wěn)定期實現(xiàn)莽草酸合成相關(guān)基因的穩(wěn)定表達(dá)，從而大量積累莽草酸，最后將兩種質(zhì)粒導(dǎo)入野生菌株。4.Ti質(zhì)粒例18.(2023·海南，20節(jié)選)我國開發(fā)了一種新型基因遞送系統(tǒng)(切—浸—生芽，簡稱CDB法)。圖1與圖2分別是利用常規(guī)轉(zhuǎn)化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。則：(1)圖1與圖2中，農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，可將外源基因遞送到植物細(xì)胞中的原因是。已知某酶(PDS)缺失會導(dǎo)致植株白化。某團(tuán)隊構(gòu)建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體(含有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因)，利用圖2中的CDB法將該重組載體導(dǎo)入植株B，長出毛狀根，成功獲得轉(zhuǎn)化植株B。據(jù)此分析，從毛狀根中獲得陽性毛狀根段的方法是，圖2中，鑒定導(dǎo)入幼苗中的基因編輯載體是否成功發(fā)揮作用的方法是，依據(jù)是。【答案】(1)農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒中的T－DNA能將外源基因遞送到植物細(xì)胞中，并與植物細(xì)胞的染色體DNA整合到一起(2)檢測選擇帶有綠色熒光標(biāo)記的毛狀根觀察幼苗是否表現(xiàn)出白化特征PDS缺失會導(dǎo)致植株白化，白化苗的出現(xiàn)意味著通過基因編輯技術(shù)成功實現(xiàn)PDS基因的敲除例19.（CS周練18，6）A蛋白是某種激素合成的關(guān)鍵酶。為鑒定該激素合成的部位及生理作用，科研團(tuán)隊利用無縫克隆技術(shù)將A蛋白結(jié)合蛋白基因（P基因）與葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因）融合，構(gòu)建A蛋白檢測探針，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入擬南芥進(jìn)行實驗。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA上含有抗甘草磷除草劑基因，相關(guān)原理、過程及質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如下圖所示。（1）利用雙酶切法將融合基因插入Ti質(zhì)粒，選用的限制酶為

。（2）利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將融合基因?qū)朕r(nóng)桿菌、擬南芥細(xì)胞的過程中，需要篩選兩次，這兩次篩選分別是?！敬鸢浮?1)BclI和SmaI(2)先篩選出能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長的農(nóng)桿菌，再用含草甘膦的培養(yǎng)基篩選出導(dǎo)入融合基因的擬南芥細(xì)胞【解析】（2）利用雙酶切法將融合基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，如果使用BamHI，會降Ti質(zhì)粒上的復(fù)制原點切掉，剩下的部分在啟動子和終止子之間沒有限制酶的切割位點，故選擇BclI和SmaI。根據(jù)融合基因的放大圖可知，擴(kuò)增時以DNA的兩條鏈分別作模板，擴(kuò)增融合基因所需的引物R1和F2應(yīng)選用下列引物組合為3'端序列可以與④5'-…TCTGTTGAAT-3'配對，5'端序列的互補(bǔ)鏈可以與①5'-…CTTGGATGAT-3'配對，因此選用的引物組合為①④。（3）利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將融合基因?qū)朕r(nóng)桿菌、擬南芥細(xì)胞的過程中，需要篩選兩次，這兩次篩選分別是先篩選出能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長而不能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長的農(nóng)桿菌，再用含草甘膦的培養(yǎng)基篩選出導(dǎo)入融合基因的擬南芥細(xì)胞。例20.（2025·陜晉青寧·節(jié)選）馬鈴薯作為重要農(nóng)作物，提高其冷耐受性可拓展優(yōu)質(zhì)馬鈴薯的種植區(qū)域。我國科研人員發(fā)現(xiàn)，野生馬鈴薯中S基因的表達(dá)與其冷耐受性調(diào)控有關(guān)，將該基因?qū)朐耘囫R鈴薯中可顯著增強(qiáng)其抗寒能力?；卮鹣铝袉栴}。(3)用攜帶S基因的農(nóng)桿菌侵染栽培馬鈴薯愈傷組織時，基因表達(dá)載體中T-DNA進(jìn)入愈傷組織細(xì)胞，將S基因整合到，抗性基因可用于篩選成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織。該愈傷組織經(jīng)形成芽、根，繼續(xù)培育可獲得抗寒能力顯著增強(qiáng)的馬鈴薯植株?！敬鸢浮?3)栽培馬鈴薯愈傷組織細(xì)胞的染色體上2再分化【解析】（3）T-DNA屬于可轉(zhuǎn)移DNA，用攜帶S基因的農(nóng)桿菌侵染栽培馬鈴薯愈傷組織時，基因表達(dá)載體中T-DNA進(jìn)入愈傷組織細(xì)胞，將S基因整合到栽培馬鈴薯愈傷組織細(xì)胞的染色體上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于篩選含有重組載體的農(nóng)桿菌，而抗性基因2位于T-DNA內(nèi)部，可用于篩選成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織。該愈傷組織經(jīng)再分化形成芽、根，繼續(xù)培育可獲得抗寒能力顯著增強(qiáng)的馬鈴薯植株。7.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。實質(zhì)是基因重組(變異類型)導(dǎo)入至植物細(xì)胞花粉管通道法方法1：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中方法2：在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點：易感染單子葉葉植物和裸子植物，對大多數(shù)葉植物沒有感染能力（人工添加酚類化合物可以解決）。原理：農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。過程：①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T?DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T?DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；//第一次導(dǎo)入是導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入（非人工操作）是將含目的基因的T?DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。②導(dǎo)入的目的基因可能存在于細(xì)胞質(zhì)中（具體位置是線粒體、葉綠體），也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。③T-DNA上也要有標(biāo)記基因，篩選導(dǎo)入成功的受體細(xì)胞。④植物的受體細(xì)胞是受精卵或體細(xì)胞。導(dǎo)入至動物細(xì)胞顯微注射法受體細(xì)胞受精卵。過程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純→利用顯微