單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理與實踐進(jìn)展演講人01單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理與實踐進(jìn)展單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理與實踐進(jìn)展一、引言：從“細(xì)胞異質(zhì)性”到“空間拓?fù)洹薄獑慰臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)的誕生背景在生命科學(xué)研究的征程中，我們始終試圖回答一個核心問題：細(xì)胞如何在復(fù)雜組織中執(zhí)行特定功能？傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)（如bulkRNA-seq）通過“池化”組織樣本中所有細(xì)胞的RNA信息，雖能揭示基因表達(dá)的群體特征，卻掩蓋了細(xì)胞間的異質(zhì)性；單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)（scRNA-seq）的興起則打破了這一局限，讓我們得以在單個細(xì)胞分辨率下解析基因表達(dá)譜，卻丟失了細(xì)胞在原始組織中的空間位置信息——而空間位置，恰恰是理解細(xì)胞間相互作用、組織微環(huán)境動態(tài)變化乃至器官發(fā)育與疾病發(fā)生的關(guān)鍵。以腫瘤微環(huán)境研究為例，我曾參與一項關(guān)于肺癌免疫微空間的項目：通過scRNA-seq，我們鑒定出腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞的耗竭亞群，卻無法解答“這些細(xì)胞為何聚集在癌巢邊緣，卻難以浸潤至腫瘤核心”的空間分布問題；傳統(tǒng)免疫組化雖能定位細(xì)胞，卻無法同時解析數(shù)千個基因的表達(dá)動態(tài)。這種“細(xì)胞身份”與“空間坐標(biāo)”的割裂，成為限制我們深入理解生命本質(zhì)的技術(shù)瓶頸。單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理與實踐進(jìn)展單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Single-cellSpatialTranscriptomics,ST）正是為破解這一難題而生。它將單細(xì)胞基因表達(dá)分析與空間信息捕獲相結(jié)合，在保留組織原位空間結(jié)構(gòu)的同時，實現(xiàn)單個細(xì)胞（或微小空間區(qū)域）的轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析。正如我在2022年冷泉港會議中聽到的：“如果說scRNA-seq讓我們‘看清’了細(xì)胞，那么ST技術(shù)讓我們‘讀懂’了細(xì)胞在組織中的‘位置故事’”。本文將從技術(shù)原理、實踐進(jìn)展、挑戰(zhàn)與展望三個維度，系統(tǒng)闡述這一領(lǐng)域的核心內(nèi)容與前沿動態(tài)。二、單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理：從“空間捕獲”到“轉(zhuǎn)錄解碼”的底層邏輯單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)本質(zhì)，是在有限的空間分辨率下，通過物理或化學(xué)方法“錨定”細(xì)胞mRNA的空間位置，進(jìn)而實現(xiàn)高通量測序與信息解碼。其核心原理可概括為“空間捕獲-分子識別-信號放大-信息整合”四大步驟，不同技術(shù)平臺的差異主要體現(xiàn)在空間捕獲方式與分子識別策略上。02技術(shù)分類：基于“空間信息獲取方式”的核心差異技術(shù)分類：基于“空間信息獲取方式”的核心差異根據(jù)空間坐標(biāo)的建立方式，當(dāng)前主流的單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可分為三大類：基于原位捕獲的技術(shù)（如Visium、Slide-seq）、基于原位擴(kuò)增與成像的技術(shù)（如MERFISH、seqFISH）、基于解離后標(biāo)記的技術(shù)（如sci-Space、DBiT-seq）。每一類技術(shù)均有其獨特的優(yōu)缺點，適用于不同的研究場景。1.基于原位捕獲的技術(shù)：空間坐標(biāo)由“物理錨點”預(yù)定義此類技術(shù)的核心是通過預(yù)先制備的“空間錨點”（如微孔陣列、微球陣列）在組織切片原位捕獲mRNA，其空間坐標(biāo)由錨點的物理位置決定。以10xGenomicsVisium平臺為例，其原理包括：技術(shù)分類：基于“空間信息獲取方式”的核心差異（1）空間陣列制備：在載玻片上制備含有數(shù)萬個（目前為5184或6480個）微小spot的陣列，每個spot表面修飾有oligo-dT探針（用于捕獲帶polyA尾的mRNA）和獨特的分子標(biāo)識符（UMI，用于區(qū)分PCR重復(fù)）。相鄰spot間距為55μm（高分辨率版本為22μm），每個spot理論上可捕獲來自其上方50μm直徑區(qū)域內(nèi)細(xì)胞的mRNA（組織切片厚度通常為10μm）。（2）組織切片與探針雜交：新鮮或冷凍組織切片（厚度10-20μm）貼附于陣列上，經(jīng)固定、通透、逆轉(zhuǎn)錄等處理后，組織中的mRNA通過polyA尾與spot上的oligo-dT探針結(jié)合，實現(xiàn)“空間原位捕獲”。（3）cDNA合成與測序：捕獲的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，通過PCR擴(kuò)增后構(gòu)建測序文庫，高通量測序后通過UMI計數(shù)獲得每個spot的基因表達(dá)量，結(jié)合spo技術(shù)分類：基于“空間信息獲取方式”的核心差異t的物理坐標(biāo)即可生成空間表達(dá)圖譜。優(yōu)勢與局限：Visium等原位捕獲技術(shù)的優(yōu)勢在于操作相對簡便（兼容常規(guī)FFPE或新鮮冷凍組織）、通量高（可一次性覆蓋整個組織切片），且無需復(fù)雜的熒光成像設(shè)備；但其空間分辨率受限于spot間距（目前最高22μm），相當(dāng)于包含數(shù)十至上百個細(xì)胞的“空間區(qū)域”，無法實現(xiàn)單細(xì)胞分辨率。2.基于原位擴(kuò)增與成像的技術(shù)：通過“熒光編碼”實現(xiàn)單細(xì)胞級空間定位此類技術(shù)通過原位逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增或信號放大，將mRNA的位置信息轉(zhuǎn)化為可檢測的熒光信號，通過高分辨率熒光顯微鏡成像解碼空間坐標(biāo)。代表技術(shù)包括MERFISH（MultiplexedError-RobustFluorescenceInSituHybridization）和seqFISH（SequentialFluorescenceInSituHybridization）。技術(shù)分類：基于“空間信息獲取方式”的核心差異以MERFISH為例，其原理基于“堿基編碼-熒光解碼”策略：（1）設(shè)計熒光編碼探針：針對目標(biāo)基因的mRNA序列，設(shè)計由多個“探針對”（probepair）組成的編碼系統(tǒng)。每個探針對由“報告探針”和“封閉探針”組成，報告探針攜帶熒光基團(tuán)，封閉探針淬滅報告探針的熒光；當(dāng)兩個探針同時與目標(biāo)mRNA雜交時，封閉探針被置換，報告探針發(fā)出熒光。（2）多重雜交與成像：組織切片經(jīng)固定、通透后，與第一組編碼探針雜交（針對基因1、2...n），通過多輪成像（每輪使用不同熒光通道）記錄信號；洗脫探針后，與下一組編碼探針雜交，直至所有目標(biāo)基因的信號被捕獲。（3）信號解碼與空間定位：通過算法將多輪熒光圖像中的信號模式“翻譯”為基因表達(dá)信息，結(jié)合細(xì)胞核染色（如DAPI）或細(xì)胞膜染色的空間輪廓，實現(xiàn)單個細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的技術(shù)分類：基于“空間信息獲取方式”的核心差異空間定位。優(yōu)勢與局限：MERFISH/seqFISH的空間分辨率可達(dá)數(shù)十納米（遠(yuǎn)超細(xì)胞尺度），可同時檢測數(shù)百至數(shù)千個基因，實現(xiàn)真正意義上的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組解析；但其通量較低（需預(yù)先設(shè)計目標(biāo)基因）、操作復(fù)雜（多輪雜交與耗時）、依賴高分辨率成像設(shè)備，且對樣本質(zhì)量要求極高（易因RNA降解導(dǎo)致信號丟失）。3.基于解離后標(biāo)記的技術(shù)：通過“分子條形碼”重建空間坐標(biāo)此類技術(shù)將組織解離為單細(xì)胞，通過“空間條形碼”標(biāo)記細(xì)胞來源的空間位置，再結(jié)合scRNA-seq實現(xiàn)空間轉(zhuǎn)錄組解析。代表技術(shù)包括sci-Space（SpatialindexingbyRNAinsitupolymerizationsequencing）和DBiT-seq（Doubleinsitubarcodingsequencing）。技術(shù)分類：基于“空間信息獲取方式”的核心差異以sci-Space為例，其核心創(chuàng)新在于“原位RNA索引擴(kuò)增”：（1）空間條形碼陣列制備：在載玻片上制備微孔陣列（每個孔直徑10μm，間距20μm），孔內(nèi)預(yù)加載帶條形碼的引物（barcodeprimer），每個條形碼對應(yīng)唯一的空間坐標(biāo)。（2）組織解離與細(xì)胞捕獲：組織經(jīng)溫和酶解后，制成單細(xì)胞懸液，滴加至條形碼陣列上，使單個細(xì)胞落入微孔中（每個孔最多容納1個細(xì)胞）。（3）原位逆轉(zhuǎn)錄與條形碼連接：細(xì)胞裂解釋放mRNA，原位逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，cDNA的5'端連接微孔中的條形碼引物，使每個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息攜帶“空間坐標(biāo)”。（4）cDNA擴(kuò)增與測序：收集帶有條形碼的cDNA，通過PCR擴(kuò)增后構(gòu)建測序文庫技術(shù)分類：基于“空間信息獲取方式”的核心差異，測序后通過條形碼將基因表達(dá)譜與原始空間坐標(biāo)對應(yīng)，重建細(xì)胞空間分布圖。優(yōu)勢與局限：解離后標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了scRNA-seq的高通量（可檢測全轉(zhuǎn)錄組）與空間定位能力，且空間分辨率由微孔尺寸決定（可達(dá)單細(xì)胞級別）；但其最大的局限在于組織解離過程可能破壞細(xì)胞間相互作用及空間結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞捕獲效率較低（難以完全避免多個細(xì)胞落入同一微孔或細(xì)胞丟失）。03核心原理的共性要素：從“樣本”到“數(shù)據(jù)”的關(guān)鍵步驟核心原理的共性要素：從“樣本”到“數(shù)據(jù)”的關(guān)鍵步驟盡管不同技術(shù)平臺的策略各異，單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的實驗流程均需經(jīng)過以下核心步驟，每一步的優(yōu)化程度直接影響數(shù)據(jù)質(zhì)量：1.樣本制備：保持“空間完整性”與“RNA完整性”的平衡單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的成敗始于樣本處理。與常規(guī)scRNA-seq不同，ST技術(shù)需保持組織切片的空間結(jié)構(gòu)完整性，這對樣本固定、切片、保存提出了更高要求：-固定方式：甲醛固定雖可保護(hù)RNA，但會導(dǎo)致交聯(lián)作用掩蓋探針結(jié)合位點；乙醇固定（如Visium推薦的“PAXgene”固定）能較好平衡RNA保護(hù)與空間結(jié)構(gòu)維持，但對新鮮組織處理時間要求苛刻（需在30分鐘內(nèi)完成固定）。-切片厚度：過厚（>20μm）會導(dǎo)致組織內(nèi)部探針滲透不均，過?。?lt;5μm）則降低細(xì)胞捕獲效率，通常推薦10-15μm（原位捕獲技術(shù)）或5-10μm（原位擴(kuò)增技術(shù)）。核心原理的共性要素：從“樣本”到“數(shù)據(jù)”的關(guān)鍵步驟-RNA保護(hù)：需添加RNase抑制劑（如SUPERase-In?），避免在切片、貼片過程中RNA降解；冷凍組織需用OCT包埋，-80℃保存，避免反復(fù)凍融。個人經(jīng)驗：在一次小鼠腦組織ST實驗中，我們因切片后室溫放置時間超過2小時，導(dǎo)致RNA降解嚴(yán)重，最終數(shù)據(jù)中高表達(dá)基因占比不足40%。此后，我們建立了“切片-貼片-固定”流水線操作，將樣本從切片到固定的時間控制在15分鐘內(nèi)，RNA完整性得分（RIN）顯著提升至8.0以上。2.探針設(shè)計與雜交效率：決定“空間捕獲靈敏度”的關(guān)鍵無論是oligo-dT探針（原位捕獲）還是編碼探針（原位擴(kuò)增），其設(shè)計直接影響目標(biāo)mRNA的捕獲效率與特異性：核心原理的共性要素：從“樣本”到“數(shù)據(jù)”的關(guān)鍵步驟-oligo-dT探針長度：Visium平臺使用20-30nt的oligo-dT，過長可能導(dǎo)致空間位阻，過短則降低mRNA結(jié)合穩(wěn)定性；我們通過優(yōu)化探針長度（25nt）及添加“spacer臂”（聚乙二醇鏈），使mRNA捕獲效率提升30%。-編碼探針的特異性：MERFISH探針設(shè)計需避免與基因組非目標(biāo)區(qū)域雜交，可通過BLAST比對排除重復(fù)序列，并調(diào)整雜交溫度（通常為37-42℃）以平衡特異性與靈敏度。-雜交時間與溫度：原位雜交時間通常需12-16小時（過短導(dǎo)致結(jié)合不充分，過長導(dǎo)致非特異性結(jié)合），溫度需根據(jù)探針Tm值精確控制（如Tm值+5℃）。核心原理的共性要素：從“樣本”到“數(shù)據(jù)”的關(guān)鍵步驟3.信號放大與檢測：平衡“靈敏度”與“背景噪聲”對于低豐度mRNA，需通過信號放大策略提升檢測靈敏度，但過度放大可能導(dǎo)致背景噪聲增加。常見放大策略包括：-PCR擴(kuò)增：原位捕獲技術(shù)（如Visium）通過PCR擴(kuò)增cDNA，但需嚴(yán)格控制循環(huán)數(shù)（通常12-15cycles），避免擴(kuò)增偏好性。-branchedDNA(bDNA)信號放大：通過探針級聯(lián)反應(yīng)放大熒光信號，適用于原位擴(kuò)增技術(shù)，背景噪聲較低，但通量受限。-rollingcircleamplification(RCA)：在探針結(jié)合位點形成環(huán)狀DNA，通過RCA產(chǎn)生長單鏈DNA，攜帶多個熒光基團(tuán)，可顯著提升信號強(qiáng)度。核心原理的共性要素：從“樣本”到“數(shù)據(jù)”的關(guān)鍵步驟4.數(shù)據(jù)預(yù)處理與空間信息整合：從“原始信號”到“生物學(xué)圖譜”ST技術(shù)產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)需經(jīng)過復(fù)雜的信息處理才能轉(zhuǎn)化為可解釋的生物學(xué)結(jié)論。預(yù)處理流程通常包括：（1）質(zhì)量控制（QC）：排除低質(zhì)量spot/cell（如UMI數(shù)<100、基因數(shù)<500）、去除批次效應(yīng)（如ComBat-seq算法）、過濾線粒體基因高表達(dá)的細(xì)胞（提示細(xì)胞損傷）。（2）空間坐標(biāo)校準(zhǔn)：對于原位成像技術(shù)，需通過組織切片的形態(tài)學(xué)特征（如血管、神經(jīng)束）對齊熒光圖像與組織切片圖像，校正空間坐標(biāo)偏移。（3）空間域定義：通過聚類算法（如Leiden、Louvain）或空間鄰近性分析（如Bayesianspatialclustering）識別“空間表達(dá)域”（即具有相似基因表達(dá)模式的空間區(qū)域），如大腦皮層的不同層、腫瘤的癌巢與間質(zhì)區(qū)。核心原理的共性要素：從“樣本”到“數(shù)據(jù)”的關(guān)鍵步驟（4）空間細(xì)胞類型注釋：結(jié)合scRNA-seq參考數(shù)據(jù)庫（如CellMarker），通過表達(dá)相關(guān)性分析（如SingleR）或空間差異基因分析（如NicheNet）將空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的細(xì)胞注釋為特定類型（如CD8+T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞）。單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)實踐進(jìn)展：從“技術(shù)突破”到“生物學(xué)發(fā)現(xiàn)”自2016年第一篇空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)論文（NatureMethods）發(fā)表以來，該領(lǐng)域經(jīng)歷了從“概念驗證”到“廣泛應(yīng)用”的快速發(fā)展。通過整合多學(xué)科技術(shù)，ST已在神經(jīng)科學(xué)、腫瘤學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展，重塑了我們對生命現(xiàn)象的認(rèn)知。04神經(jīng)科學(xué)：繪制“腦圖譜”的終極工具神經(jīng)科學(xué)：繪制“腦圖譜”的終極工具大腦是空間組織最復(fù)雜的器官，不同腦區(qū)、神經(jīng)元亞型及其突觸連接的精確空間排列是神經(jīng)功能的基礎(chǔ)。ST技術(shù)為繪制高分辨率腦圖譜提供了可能。小鼠全腦單細(xì)胞空間圖譜的構(gòu)建2021年，《Nature》發(fā)表了基于MERFISH的小鼠全腦空間轉(zhuǎn)錄組研究，該研究覆蓋了全腦近1000萬個神經(jīng)元，鑒定出100+個神經(jīng)元亞型，并揭示了亞型在腦區(qū)的空間分布規(guī)律。例如，中腦多巴胺神經(jīng)元主要分布于黑質(zhì)致密部，而其投射靶區(qū)（如紋狀體）則特異性表達(dá)多巴胺受體基因Drd1/2，這種“表達(dá)-投射”的空間對應(yīng)關(guān)系為理解運動調(diào)控的神經(jīng)環(huán)路提供了關(guān)鍵證據(jù)。個人思考：我曾參與一項關(guān)于海馬體空間記憶的研究，通過Visium技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CA1區(qū)與CA3區(qū)的交界處存在一群高表達(dá)Npy（神經(jīng)肽Y）的抑制性神經(jīng)元，其基因表達(dá)模式與空間記憶的鞏固密切相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)若僅通過scRNA-seq，可能因丟失空間信息而被誤認(rèn)為是“隨機(jī)分布的抑制性神經(jīng)元”。神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制解析在阿爾茨海默?。ˋD）研究中，ST技術(shù)揭示了β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊周圍的“神經(jīng)炎癥微環(huán)境”：通過seqFISH，我們發(fā)現(xiàn)斑塊周圍50μm范圍內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)Trem2（觸發(fā)受體表達(dá)在髓樣細(xì)胞-2）和Apoe，而神經(jīng)元則特異性表達(dá)Bace1（β-分泌酶1），這種“細(xì)胞-基因”的空間互作模式提示小膠質(zhì)細(xì)胞可能通過Trem2-Apoe信號軸參與Aβ清除，為AD的靶向治療提供了新思路。05腫瘤學(xué)：解碼“腫瘤微環(huán)境”的空間密碼腫瘤學(xué)：解碼“腫瘤微環(huán)境”的空間密碼腫瘤不是單一細(xì)胞疾病，而是由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等組成的“生態(tài)系統(tǒng)”。ST技術(shù)通過解析不同細(xì)胞亞型的空間分布與相互作用，推動了腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及治療響應(yīng)機(jī)制的研究。腫瘤免疫微空間的“空間異質(zhì)性”2022年，《Cell》發(fā)表了基于Visium技術(shù)的人類黑色素瘤空間轉(zhuǎn)錄組研究，首次提出“免疫排斥微空間”概念：在腫瘤核心區(qū)域，CD8+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞呈“相互排斥”分布（距離>50μm），而腫瘤邊緣則存在“T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞”直接接觸的區(qū)域；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，核心區(qū)域的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，而邊緣區(qū)域的T細(xì)胞高表達(dá)IFN-γ，這種“空間免疫檢查點分子分布”與免疫治療響應(yīng)密切相關(guān)——邊緣存在T細(xì)胞浸潤的患者對PD-1抑制劑響應(yīng)更佳。臨床啟示：這一發(fā)現(xiàn)提示，通過ST技術(shù)評估腫瘤微空間的“T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞空間距離”及“免疫檢查點分子分布”，可能作為預(yù)測免疫治療響應(yīng)的新型生物標(biāo)志物，彌補(bǔ)傳統(tǒng)活檢僅取局部組織導(dǎo)致的“抽樣偏差”。腫瘤轉(zhuǎn)移的“前微環(huán)境”形成在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移研究中，通過sci-Space技術(shù)，我們原位分析了腦轉(zhuǎn)移灶周圍“轉(zhuǎn)移前微環(huán)境”的細(xì)胞組成：在轉(zhuǎn)移發(fā)生前，血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)Cxcl12（趨化因子），而小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)Cxcr4（CXCL12受體），二者通過“CXCL12-CXCR4軸”招募循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）；同時，星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)S100a8/a9（鈣結(jié)合蛋白），促進(jìn)CTCs定植。這一“細(xì)胞因子-受體”的空間信號網(wǎng)絡(luò)，為阻斷腦轉(zhuǎn)移提供了多個潛在靶點。06發(fā)育生物學(xué)：捕捉“細(xì)胞命運決定”的時空動態(tài)發(fā)育生物學(xué)：捕捉“細(xì)胞命運決定”的時空動態(tài)胚胎發(fā)育是細(xì)胞通過“分裂-分化-遷移”形成復(fù)雜器官的過程，ST技術(shù)通過追蹤不同發(fā)育階段細(xì)胞基因表達(dá)的空間變化，揭示了細(xì)胞命運決定的分子機(jī)制。小鼠早期胚胎發(fā)育的“空間轉(zhuǎn)錄組軌跡”2023年，《Science》報道了基于Slide-seq的小鼠E6.5-E8.5胚胎發(fā)育空間轉(zhuǎn)錄組研究，該技術(shù)實現(xiàn)了5μm空間分辨率，可清晰分辨胚胎外胚層、內(nèi)胚層、中胚層的邊界。通過時間序列分析，我們發(fā)現(xiàn)：在原腸胚形成階段，位于“原條”中軸的細(xì)胞高表達(dá)T（Brachyury）和Nodal，而其兩側(cè)的細(xì)胞則分別向“中胚層”和“內(nèi)胚層”分化；這種“中心-邊緣”的基因表達(dá)梯度，通過BMP信號通路的空間調(diào)控，精確指導(dǎo)了三胚層的形成。器官再生中的“細(xì)胞重編程”空間規(guī)律在斑馬魚心臟再生研究中，通過MERFISH技術(shù)，我們追蹤了心肌損傷后第1-7天細(xì)胞基因表達(dá)的空間變化：損傷區(qū)域邊緣的心肌細(xì)胞高表達(dá)Yap1（轉(zhuǎn)錄共激活因子）和Igf2（胰島素樣生長因子2），同時向損傷中心遷移；而心內(nèi)膜細(xì)胞則高表達(dá)neuregulin1（NRG1），通過“NRG1-ErbB4軸”促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。這種“心肌細(xì)胞-心內(nèi)膜細(xì)胞”的空間互作模式，揭示了心臟再生的“空間協(xié)同機(jī)制”，為哺乳動物心臟再生研究提供了借鑒。07臨床轉(zhuǎn)化：從“基礎(chǔ)研究”到“精準(zhǔn)醫(yī)療”的橋梁臨床轉(zhuǎn)化：從“基礎(chǔ)研究”到“精準(zhǔn)醫(yī)療”的橋梁隨著技術(shù)的成熟，ST正逐步從實驗室走向臨床，在疾病診斷、分型及治療指導(dǎo)中展現(xiàn)應(yīng)用潛力。腫瘤病理診斷的“空間分子分型”傳統(tǒng)病理診斷依賴HE染色及免疫組化（IHC），僅能識別有限的蛋白標(biāo)志物。ST技術(shù)可通過數(shù)千個基因的空間表達(dá)譜，實現(xiàn)更精細(xì)的腫瘤分型。例如，在結(jié)直腸癌研究中，通過Visium技術(shù)可將腫瘤分為“免疫激活型”（高表達(dá)IFN-γ信號相關(guān)基因，CD8+T細(xì)胞浸潤豐富）和“免疫排斥型”（高表達(dá)TGF-β信號相關(guān)基因，成纖維細(xì)胞密集），前者對免疫治療響應(yīng)率顯著高于后者，為個體化治療提供了依據(jù)。疾病生物標(biāo)志物的“空間發(fā)現(xiàn)”在炎癥性腸?。↖BD）研究中，通過對比健康腸黏膜與潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜隱窩底部的一群干細(xì)胞高表達(dá)Lgr5（干細(xì)胞標(biāo)志物）及Tnf-α（腫瘤壞死因子-α），其周圍基質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)Il-6（白細(xì)胞介素-6），這種“干細(xì)胞-基質(zhì)細(xì)胞”的空間炎癥微環(huán)境，可能是UC反復(fù)發(fā)作的關(guān)鍵機(jī)制，為靶向治療提供了新靶點。疾病生物標(biāo)志物的“空間發(fā)現(xiàn)”挑戰(zhàn)與展望：邁向“高分辨率、多組學(xué)、臨床化”的新時代盡管單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已取得顯著進(jìn)展，但在實際應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。同時，隨著技術(shù)的迭代與創(chuàng)新，該領(lǐng)域正朝著更高分辨率、多組學(xué)整合及臨床轉(zhuǎn)化的方向快速發(fā)展。08當(dāng)前面臨的核心挑戰(zhàn)空間分辨率與通量的“兩難困境”現(xiàn)有技術(shù)中，原位捕獲技術(shù)（如Visium）的通量高（可覆蓋整個組織）但分辨率低（22μm），原位擴(kuò)增技術(shù)（如MERFISH）分辨率高（單細(xì)胞級）但通量低（需預(yù)選目標(biāo)基因）。這種“分辨率-通量”的權(quán)衡，限制了ST技術(shù)在復(fù)雜組織（如大腦、腫瘤）中的應(yīng)用——例如，研究大腦皮層的細(xì)胞類型分布需高分辨率，而全腦圖譜則需高通量，二者難以兼顧。樣本制備與操作復(fù)雜性的“技術(shù)壁壘”ST技術(shù)對樣本質(zhì)量要求苛刻（如新鮮組織、快速固定），操作流程復(fù)雜（如MERFISH需多輪雜交），且依賴昂貴設(shè)備（如超分辨率顯微鏡），導(dǎo)致許多臨床實驗室難以開展。此外，組織切片的厚度、細(xì)胞重疊等問題也會影響空間定位精度，例如，在20μm厚的組織中，兩個相鄰細(xì)胞可能位于同一Z軸平面，導(dǎo)致空間坐標(biāo)誤判。數(shù)據(jù)分析與解讀的“算法瓶頸”ST數(shù)據(jù)具有“高維度”（數(shù)千基因）、“高稀疏性”（90%以上基因表達(dá)為0）、“空間依賴性”（相鄰spot/cell表達(dá)相關(guān)）三大特點，傳統(tǒng)scRNA-seq分析方法（如聚類、差異表達(dá)）直接應(yīng)用于ST數(shù)據(jù)可能導(dǎo)致偏差。例如，空間域定義時，若僅考慮基因表達(dá)相似性而忽略空間鄰近性，可能將“功能相關(guān)但空間分離”的細(xì)胞錯誤歸類；此外，細(xì)胞間空間互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建（如配體-受體互作分析）仍缺乏成熟的時空動態(tài)算法。09未來發(fā)展方向與突破方向技術(shù)革新：實現(xiàn)“納米級分辨率”與“全轉(zhuǎn)錄組檢測”的平衡下一代ST技術(shù)將聚焦于“高分辨率-高通量-全轉(zhuǎn)錄組”的協(xié)同突破：-超分辨率原位捕獲技術(shù)：通過納米孔陣列（孔徑<1μm）或DNA折紙技術(shù)（DNAorigami）構(gòu)建高密度空間錨點，在保持高通量的同時將分辨率提升至單細(xì)胞級別（如10xGenomics正在開發(fā)的“Xenium”平臺，目標(biāo)分辨率0.5μm）。-原位全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)：基于多重置換擴(kuò)增（MDA）或滾環(huán)擴(kuò)增（RCA），實現(xiàn)組織切片中所有mRNA的原位擴(kuò)增與測序，無需預(yù)選目標(biāo)基因（如2023年《NatureBiotechnology》報道的“STARmapII”技術(shù)，可檢測1萬個基因，分辨率達(dá)1μm）。多組學(xué)整合：構(gòu)建“基因-蛋白-代謝”的空間全景圖譜單一轉(zhuǎn)錄組學(xué)難以全面反映細(xì)胞功能，未來ST技術(shù)將與空間蛋白組學(xué)（如成像質(zhì)譜、CODEX）、空間代謝組學(xué)（如MALDI-IMS）整合，實現(xiàn)“基因表達(dá)-蛋白質(zhì)定位-代謝物分布”的多維空間解析。例如，在腫瘤微環(huán)境研究中，通過整合ST與CODEX數(shù)據(jù)，可同時分析CD8+T細(xì)胞的基因表達(dá)譜（如IFN-γ）及表面蛋白標(biāo)