雙特異性抗體的生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制要點演講人引言：雙特異性抗體的行業(yè)價值與工藝質(zhì)控的核心地位01質(zhì)量控制：從原材料到成品放行的全流程保障02雙抗生產(chǎn)工藝：從細胞株構(gòu)建到制劑成品的系統(tǒng)工程03總結(jié)與展望：雙抗工藝質(zhì)控的未來方向04目錄雙特異性抗體的生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制要點01引言：雙特異性抗體的行業(yè)價值與工藝質(zhì)控的核心地位引言：雙特異性抗體的行業(yè)價值與工藝質(zhì)控的核心地位作為一名深耕生物藥研發(fā)與生產(chǎn)十余年的從業(yè)者，我親歷了單克隆抗體從實驗室走向產(chǎn)業(yè)化的浪潮，也見證了雙特異性抗體（BispecificAntibody,BsAb）作為新一代生物治療劑的崛起。與傳統(tǒng)單抗相比，雙抗能同時結(jié)合兩個不同靶點，實現(xiàn)“協(xié)同靶向”“信號阻斷”“細胞橋接”等復(fù)雜生物學功能，在腫瘤、自身免疫性疾病、感染等領(lǐng)域展現(xiàn)出不可替代的治療潛力。例如，CD19/CD3雙抗在B細胞淋巴瘤中實現(xiàn)T細胞重定向，PD-1/CTLA-4雙抗通過雙重免疫檢查點阻斷增強抗腫瘤效應(yīng)，這些突破性成果不僅改寫了臨床治療格局，也對生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制提出了前所未有的挑戰(zhàn)。雙抗結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性——兩條不同特異性重鏈（HC-A、HC-B）與兩條輕鏈（LC-A、LC-B）的正確配對、目標分子形式（如IgG-like、BiTE、DART等）的精準構(gòu)建，決定了其生產(chǎn)過程必須比單抗更精細、更系統(tǒng)。引言：雙特異性抗體的行業(yè)價值與工藝質(zhì)控的核心地位從細胞株構(gòu)建到最終制劑放行，每一個環(huán)節(jié)的偏差都可能導(dǎo)致產(chǎn)品異質(zhì)性增加、活性降低或安全性風險。因此，生產(chǎn)工藝是實現(xiàn)雙抗“正確設(shè)計”到“正確產(chǎn)品”的轉(zhuǎn)化橋梁，質(zhì)量控制則是保障這一轉(zhuǎn)化“安全、有效、穩(wěn)定”的核心防線。本文將以行業(yè)實踐視角，系統(tǒng)梳理雙抗的生產(chǎn)工藝全流程與質(zhì)量控制要點，旨在為同行提供一套兼具理論深度與實踐指導(dǎo)的參考框架。02雙抗生產(chǎn)工藝：從細胞株構(gòu)建到制劑成品的系統(tǒng)工程雙抗生產(chǎn)工藝：從細胞株構(gòu)建到制劑成品的系統(tǒng)工程雙抗的生產(chǎn)工藝可分為上游工藝（細胞培養(yǎng)與產(chǎn)物生成）、下游工藝（分離純化與雜質(zhì)去除）和制劑工藝（配方開發(fā)與成品制備）三大模塊，各模塊環(huán)環(huán)相扣，共同決定了產(chǎn)品的質(zhì)量屬性。上游工藝：細胞株構(gòu)建與高效表達的基石上游工藝是雙抗生產(chǎn)的“源頭”，其核心目標是構(gòu)建穩(wěn)定、高效、低錯配的細胞株，確保目標分子形式的穩(wěn)定表達。這一階段的質(zhì)量控制直接決定了下游純化的難度與產(chǎn)品的最終質(zhì)量。上游工藝：細胞株構(gòu)建與高效表達的基石細胞株構(gòu)建：精準設(shè)計是實現(xiàn)正確配對的前提雙抗的復(fù)雜性首先體現(xiàn)在基因?qū)用妗Ｒ宰畛Ｒ姷腎gG-like雙抗（如Knobs-into-holes,KiH結(jié)構(gòu)）為例，需同時表達HC-A、HC-B、LC-A、LC-B四條鏈，任一鏈條的錯誤表達或錯配均可能產(chǎn)生雜質(zhì)（如重鏈錯配、輕鏈錯配、半抗體等）。因此，細胞株構(gòu)建需解決三大關(guān)鍵問題：-基因載體設(shè)計：采用共轉(zhuǎn)染或雙質(zhì)粒系統(tǒng)，將四條鏈的基因?qū)胨拗骷毎ㄍǔ橹袊鴤}鼠卵巢細胞，CHO）。為提高重鏈配對效率，可引入“knobs-into-holes”突變（HC-A的CH3結(jié)構(gòu)域引入“凸起”突變，HC-B的CH3結(jié)構(gòu)域引入“凹陷”突變），或“鏈交換工程”（SEED）技術(shù)，通過CH1-CL結(jié)構(gòu)域的互換促進輕鏈正確配對。在早期項目中，我們曾因未優(yōu)化CH3界面，導(dǎo)致重鏈錯配率高達30%，最終通過引入KiH突變將錯配率控制在5%以下，這讓我深刻體會到基因設(shè)計的“毫厘之差”對后續(xù)工藝的“千里之別”。上游工藝：細胞株構(gòu)建與高效表達的基石細胞株構(gòu)建：精準設(shè)計是實現(xiàn)正確配對的前提-篩選策略優(yōu)化：傳統(tǒng)抗生素篩選（如G418）僅能保證細胞存活，無法篩選出高表達且正確配對的克隆。需結(jié)合“表達量篩選”與“質(zhì)量屬性篩選”：首先通過ELISA檢測細胞上清中目標雙抗的含量，篩選高表達克隆；再通過非還原型CE-SDS或質(zhì)譜鑒定輕鏈、重鏈的正確配對情況，剔除錯配嚴重的克??；最后通過穩(wěn)定性傳代（持續(xù)培養(yǎng)8-10周），確?？寺”磉_穩(wěn)定性與質(zhì)量一致性。-宿主細胞選擇：CHO細胞因具備接近人體的翻譯后修飾能力（如糖基化）、無內(nèi)毒素及病毒污染風險，仍是雙抗生產(chǎn)的“黃金標準”。但不同CHO亞株（如CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44）的糖基化酶活性存在差異，需根據(jù)雙抗對糖基化的敏感性（如ADCC效應(yīng)依賴FcγR結(jié)合，而糖基化位點突變可能影響Fc功能）選擇合適亞株。例如，一款靶向PD-1/CTLA-4的雙抗因ADCC效應(yīng)依賴核心巖藻糖基化，我們最終選擇了巖藻糖基化水平較低的CHO-S細胞，使ADCC活性提升40%。上游工藝：細胞株構(gòu)建與高效表達的基石細胞培養(yǎng)過程優(yōu)化：平衡產(chǎn)量與質(zhì)量的關(guān)鍵細胞培養(yǎng)是雙抗生成的“主戰(zhàn)場”，培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、溫度、pH、溶氧等）不僅影響表達量，更直接影響產(chǎn)品質(zhì)量屬性（如糖基化、聚體、電荷異構(gòu)體）。-培養(yǎng)基開發(fā)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如CDCHO、EXCELL）需補充補料（如FeedC、FeedH）以維持細胞高密度生長。為減少代謝產(chǎn)物積累（如乳酸、銨離子）對細胞活力和產(chǎn)品質(zhì)量的影響，可通過“代謝分析+培養(yǎng)基優(yōu)化”策略：利用代謝組學監(jiān)測葡萄糖、谷氨酰胺的消耗速率及乳酸、銨的生成速率，調(diào)整碳源（如替換為半乳糖以減少乳酸生成）和氮源（如谷氨酰胺替代物）濃度，同時補料中添加抗氧化劑（如甲硫氨酸亞砜）以減少氧化修飾。在某雙抗項目中，我們將葡萄糖濃度從40mmol/L降至20mmol/L，乳酸生成量減少50%，細胞存活期延長3天，最終表達量提升至3g/L。上游工藝：細胞株構(gòu)建與高效表達的基石細胞培養(yǎng)過程優(yōu)化：平衡產(chǎn)量與質(zhì)量的關(guān)鍵-培養(yǎng)模式選擇：批次培養(yǎng)（Batch）操作簡單，但細胞密度低（通常＜5×10?cells/mL）；流加培養(yǎng)（Fed-batch）通過補料維持營養(yǎng)供應(yīng)，是目前主流（細胞密度可達1-2×10?cells/mL，表達量2-5g/L）；灌注培養(yǎng)（Perfusion）通過細胞截留裝置實現(xiàn)細胞循環(huán)培養(yǎng)，適用于高密度（＞1×10?cells/mL）和高表達（＞5g/L）需求，但設(shè)備成本高、操作復(fù)雜。對于臨床前研究，流加培養(yǎng)已足夠；而商業(yè)化生產(chǎn)中，若對產(chǎn)量要求極高（如年需求量＞100kg），可考慮灌注培養(yǎng)。-工藝參數(shù)控制：pH需控制在7.0±0.2（過酸導(dǎo)致細胞凋亡，過堿影響糖基化）；溶氧（DO）維持在30%-50%（過低影響氧化代謝，過高產(chǎn)生氧化應(yīng)激）；溫度通常為37℃，但在對表達后期的“細胞生長期”可適當降低至33-36℃（“低溫策略”），減少蛋白水解和聚體形成。此外，需實時監(jiān)測代謝參數(shù)（如乳酸/葡萄糖比、銨離子濃度），通過反饋控制調(diào)整補料速率，避免“代謝崩潰”。下游工藝：分離純化與雜質(zhì)去除的精細控制下游工藝的目標是從復(fù)雜的細胞培養(yǎng)液中分離、純化目標雙抗，去除雜質(zhì)（宿主蛋白、DNA、細胞碎片、病毒、抗體片段、聚體等），并確保產(chǎn)品的純度、收率與活性。雙抗下游工藝比單抗更復(fù)雜，需針對其結(jié)構(gòu)特性（如易聚體、錯配產(chǎn)物）優(yōu)化純化策略。1.收獲與澄清：去除細胞碎片，保護產(chǎn)物完整性-收獲：通常采用離心（5000-8000×g，10-20min）或錯流過濾（TangentialFlowFiltration,TFF,0.2-0.45μm膜包）去除細胞。離心操作簡單，但易產(chǎn)生剪切力導(dǎo)致聚體；TFF可實現(xiàn)連續(xù)操作，減少剪切力，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。下游工藝：分離純化與雜質(zhì)去除的精細控制-澄清：去除細胞碎片、細胞器等不溶性雜質(zhì)，常用深層過濾（如ZetaPlus系列）或膜過濾（0.1-0.22μmPVDF膜）。深層過濾需優(yōu)化流速（通常＜200L/m2/h），避免堵塞；膜過濾需控制跨膜壓（TMP＜0.3bar），防止膜破裂導(dǎo)致雜質(zhì)穿透。在某雙抗項目中，我們曾因深層過濾流速過快（300L/m2/h），導(dǎo)致濾餅堵塞，后續(xù)純化步驟中宿主蛋白去除率從99%降至85%，最終通過將流速降至150L/m2/h解決問題。2.純化：多步層析實現(xiàn)雜質(zhì)分離與產(chǎn)物富集雙抗純化的核心是“捕獲-精制-polishing”三步策略，其中“捕獲步驟”對收率和純度影響最大，通常采用親和層析（ProteinA）。下游工藝：分離純化與雜質(zhì)去除的精細控制-親和層析（ProteinA）：ProteinA能特異性結(jié)合抗體的Fc片段，是單抗和雙抗捕獲的首選。但雙抗因結(jié)構(gòu)差異（如部分雙抗缺乏Fc段，或Fc段突變），與ProteinA的結(jié)合力可能減弱。需優(yōu)化上樣條件：pH（通常7.0-8.0，過高導(dǎo)致ProteinA脫落）、電導(dǎo)（＜10mS/cm，過高影響結(jié)合）、流速（低流速結(jié)合充分，但效率低，通常100-300cm/h）。洗脫常用低pH緩沖液（pH3.0-3.5），但低pH可能導(dǎo)致雙抗變性，需立即中和（pH5.0-6.0）或添加穩(wěn)定劑（如精氨酸）。此外，ProteinA配基可能脫落，需通過SEC-HPLC檢測殘留ProteinA（通常＜100ppm），若超標需增加一步陽離子交換層析（CEX）去除。下游工藝：分離純化與雜質(zhì)去除的精細控制-精制層析：去除ProteinA脫落物、宿主蛋白、DNA、聚體等雜質(zhì)，常用陽離子交換層析（CEX）和陰離子交換層析（AEX）。-CEX：基于電荷差異分離，雙抗在pH5.0-6.0（接近pI）帶正電，與陽離子交換介質(zhì)（如CaptoS）結(jié)合。通過線性梯度洗脫（NaCl0-500mmol/L），可將目標雙抗與酸性雜質(zhì)（如脫酰胺化產(chǎn)物）分離。需注意：CEX上樣pH需嚴格控制（±0.1pH單位），避免pH過高導(dǎo)致結(jié)合能力下降。-AEX：用于去除帶負電的雜質(zhì)（如DNA、內(nèi)毒素、酸性聚體），雙抗在pH7.0-8.0帶負電，與陰離子交換介質(zhì)（如QSepharose）結(jié)合。通過鹽梯度或pH梯度洗脫，可分離目標產(chǎn)物與DNA（通常需＜10ng/dose）。下游工藝：分離純化與雜質(zhì)去除的精細控制-Polishing層析：進一步去除痕量雜質(zhì)，如疏水作用層析（HIC）或尺寸排阻層析（SEC）。HIC基于疏水性差異分離，適用于去除聚體和碎片，需優(yōu)化高鹽濃度（如1-2mol/L硫酸銨）上樣條件；SEC（如Superdex200）則按分子大小分離，可有效去除聚體（＞100ppm）和片段，但收率較低（通常80%-90%），需控制上樣量（＜5%柱體積）避免柱子堵塞。下游工藝：分離純化與雜質(zhì)去除的精細控制病毒滅活/去除：保障產(chǎn)品安全性的關(guān)鍵步驟生物藥生產(chǎn)中，病毒污染是致命風險。雙抗生產(chǎn)需通過“滅活+去除”雙重保障：-病毒滅活：低pH孵育（pH3.6-4.0，30-60min）是最常用方法，可滅活包膜病毒（如逆轉(zhuǎn)錄病毒），但需嚴格控制pH和溫度（2-8℃），避免雙抗變性。-病毒去除：納米膜過濾（如35nm或20nm膜）可去除細小病毒，需驗證膜孔徑完整性（泡點測試）和病毒清除能力（通常LRV＞4log??）。此外，AEX和SEC也有一定的病毒去除能力（LRV＞1log??）。制劑工藝：配方開發(fā)與成品穩(wěn)定的保障制劑工藝的目標是開發(fā)穩(wěn)定、安全、可用的雙抗產(chǎn)品，確保從生產(chǎn)到臨床使用的全過程中產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。制劑開發(fā)需考慮雙抗的物理穩(wěn)定性（防止聚體、沉淀）、化學穩(wěn)定性（防止氧化、脫酰胺）和生物學穩(wěn)定性（保持活性）。制劑工藝：配方開發(fā)與成品穩(wěn)定的保障處方開發(fā)：平衡穩(wěn)定性與安全性的“配方密碼”雙抗制劑處方的核心成分包括：-緩沖體系：維持pH穩(wěn)定，常用組氨酸（pH6.0-6.5，減少聚集）、磷酸鹽（pH7.0-7.4，適合皮下注射）。需避免易氧化的緩沖液（如Tris）。-穩(wěn)定劑：防止聚體和表面吸附，常用蔗糖（5%-10%，非還原性糖，穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)）、甘露醇（3%-5%，改善凍干結(jié)構(gòu)）。-表面活性劑：防止因攪拌、泵送等操作產(chǎn)生的界面應(yīng)力導(dǎo)致聚集，常用polysorbate80（0.01%-0.04%）或polysorbate20，需監(jiān)控其氧化產(chǎn)物（如脂肪酸酯），若超標需更換或添加抗氧化劑（如甲硫氨酸）。-等滲調(diào)節(jié)劑：滲透壓需維持在250-350mOsm/kg，常用甘氨酸、氯化鈉。制劑工藝：配方開發(fā)與成品穩(wěn)定的保障處方開發(fā)：平衡穩(wěn)定性與安全性的“配方密碼”處方開發(fā)需通過“穩(wěn)定性篩選”：將雙抗置于不同條件下（光照、高溫、凍融），監(jiān)測聚體含量（SEC-HPLC）、電荷異構(gòu)體（cIEF）、活性（細胞assay），篩選最優(yōu)配方。例如，一款用于皮下注射的雙抗，我們通過比較蔗糖與甘露醇的凍干效果，發(fā)現(xiàn)甘露醇在復(fù)溶后形成的“海綿狀結(jié)構(gòu)”能顯著減少聚體形成（從8%降至3%）。2.灌裝與凍干：實現(xiàn)產(chǎn)品“長期穩(wěn)定”的最后一公里-灌裝：需確保無菌（A級環(huán)境，灌裝A級背景）、灌裝精度（裝量差異±5%）。對于液體制劑，需考察運輸過程中的穩(wěn)定性（如振動、溫度波動）；對于凍干制劑，灌裝體積需控制在容器容量的1/3-1/2，確保凍干后“蛋糕結(jié)構(gòu)”完整。制劑工藝：配方開發(fā)與成品穩(wěn)定的保障處方開發(fā)：平衡穩(wěn)定性與安全性的“配方密碼”-凍干工藝：包括預(yù)凍（-40℃以下，形成冰晶）、一次干燥（升華，真空度＜100mbar，擱板溫度-20℃→+20℃）、二次干燥（解析干燥，真空度＜50mbar，擱板溫度+25℃→+40℃）。關(guān)鍵參數(shù)是升溫速率和真空度，升溫過快可能導(dǎo)致產(chǎn)品“崩解”，真空不足可能導(dǎo)致水分殘留（通常＜1%）。凍干后產(chǎn)品需在-20℃或2-8℃保存，復(fù)溶后需在規(guī)定時間內(nèi)（如24h）使用。03質(zhì)量控制：從原材料到成品放行的全流程保障質(zhì)量控制：從原材料到成品放行的全流程保障質(zhì)量控制是雙抗生產(chǎn)的“生命線”，需貫穿從原材料到成品放行的全流程，確保產(chǎn)品“安全、有效、質(zhì)量穩(wěn)定”。雙抗的質(zhì)量控制比單抗更復(fù)雜，需針對其結(jié)構(gòu)特性（如錯配、聚體、電荷異構(gòu)體）建立專屬質(zhì)量標準。原材料控制：源頭杜絕質(zhì)量風險原材料的質(zhì)量直接影響最終產(chǎn)品，需建立嚴格的供應(yīng)商審計和入廠檢驗標準：-細胞庫：主細胞庫（MCB）和工作細胞庫（WCB）需檢定（按《中國藥典》2020年版三部）：鑒別（STR分型）、遺傳穩(wěn)定性（染色體核型分析）、外源因子檢測（細菌、真菌、支原體、病毒）、產(chǎn)物表達量與質(zhì)量屬性（純度、電荷異構(gòu)體）。-培養(yǎng)基與添加劑：需提供資質(zhì)證明（如生產(chǎn)許可證、檢驗報告），入廠時檢測無菌、細菌內(nèi)毒素（＜0.25EU/mL）、含量（如氨基酸、維生素）。-層析介質(zhì)：如ProteinA、CEX介質(zhì)，需檢測載量、流速、殘留量（如蛋白A脫落物），避免批間差異。過程控制：中間品質(zhì)量是成品質(zhì)量的基石過程控制是對生產(chǎn)過程中關(guān)鍵步驟的實時監(jiān)控，確保偏差“早發(fā)現(xiàn)、早處理”：-上游過程控制：細胞培養(yǎng)過程中，需每日監(jiān)測細胞密度（viability＞90%）、代謝參數(shù)（葡萄糖、乳酸、銨離子）、產(chǎn)物濃度（ELISA），若產(chǎn)物表達量低于預(yù)期，需排查細胞狀態(tài)、培養(yǎng)條件等問題。-下游過程控制：每步純化后需檢測中間品純度（SEC-HPLC＞90%）、聚體含量（＜5%）、宿主蛋白（＜100ppm）、DNA（＜10ng/dose）。例如，親和層析后需檢測ProteinA殘留，CEX后需檢測電荷異構(gòu)體分布，確保后續(xù)精制步驟有效去除雜質(zhì)。成品控制：全面評估產(chǎn)品質(zhì)量屬性成品放行需依據(jù)質(zhì)量標準進行全項檢定，確保產(chǎn)品符合要求。雙抗成品質(zhì)量控制主要包括以下方面：成品控制：全面評估產(chǎn)品質(zhì)量屬性理化性質(zhì)：結(jié)構(gòu)與修飾的精準鑒定-分子量與純度：還原型CE-SDS檢測重鏈（約50kDa）、輕鏈（約25kDa）的純度（＞95%）；非還原型CE-SDS檢測完整雙抗（約150kDa）及半抗體（約100kDa）含量（半抗體通常＜5%）；SEC-HPLC檢測聚體含量（通常＜5%）。-一級結(jié)構(gòu)：肽圖（胰蛋白酶酶解+LC-MS）鑒定氨基酸序列正確性；N端測序（Edman降解）確認重鏈、輕鏈N端序列；質(zhì)譜（MALDI-TOF或LC-MS）測定分子量（與理論值偏差＜0.1%）。-翻譯后修飾：糖基化分析（PNGaseF酶解+LC-MS）檢測N-糖基化位點（如Asn297）的糖型（G0F、G1F、G2F比例，核心巖藻糖含量通常＜10%以增強ADCC效應(yīng)）；氧化（甲硫氨酸氧化，通常＜5%）、脫酰胺（天冬酰胺脫酰胺，通常＜3%）修飾檢測（cIEF或LC-MS）。成品控制：全面評估產(chǎn)品質(zhì)量屬性理化性質(zhì)：結(jié)構(gòu)與修飾的精準鑒定-高級結(jié)構(gòu)：圓二色譜（CD）檢測二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊比例）；熒光光譜（Trp殘基）檢測三級結(jié)構(gòu)；差示掃描量熱法（DSC）檢測熱穩(wěn)定性（熔點Tm＞60℃）。成品控制：全面評估產(chǎn)品質(zhì)量屬性生物學活性：功能驗證的核心雙抗的生物學活性直接決定其療效，需建立基于作用機制的細胞活性assay：-雙靶點結(jié)合活性：如CD19/CD3雙抗，需通過流式細胞術(shù)（FCM）檢測與CD19?（Raji細胞）和CD3?（Jurkat細胞）細胞的結(jié)合能力（EC50＜10nM）。-細胞功能活性：如T細胞重定向雙抗，需通過細胞毒性assay（如LDH釋放法）檢測T細胞對靶細胞的殺傷活性（EC50＜1ng/mL）；如免疫檢查點雙抗，需檢測T細胞增殖（CFSE法）或細胞因子釋放（IFN-γELISA）。-Fc功能活性：如ADCC效應(yīng)，需通過FcγR結(jié)合assay（SPR或BLI）檢測與FcγRIIIa的結(jié)合力（KD＜10nM）；CDC效應(yīng)檢測補體依賴的細胞毒性。成品控制：全面評估產(chǎn)品質(zhì)量屬性安全性：保障患者生命安全-無菌：薄膜過濾法培養(yǎng)14天，無菌生長。-細菌內(nèi)毒素：鱟試劑法檢測（＜5EU/mg）。-異常毒性：小鼠注射法，觀察7天，無死亡、異常反應(yīng)。-殘留物：宿主蛋白（＜100ppm，ELISA法）、宿主DNA（＜10ng/dose，qPCR法）、ProteinA（＜100ppm，ELISA法）、溶劑（如三氟乙醇，＜5000ppm，GC法）。成品控制：全面評估產(chǎn)品質(zhì)量屬性穩(wěn)定性研究：確定有效期與儲存條件穩(wěn)定性研究是確定產(chǎn)品有效期和儲存條件的關(guān)鍵，包括：-實時穩(wěn)定性：在擬儲存條件（如2-8℃）下放置，分別于0、3、6、9、12、18、24個月檢