常春藤皂甙元抗肝癌作用及機制研究：從細胞實驗到生物信息學分析一、引言1.1研究背景肝癌，作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。在所有惡性腫瘤中，肝癌的發(fā)病率僅次于肺癌，位列第二。尤其在發(fā)展中國家，肝癌的發(fā)病形勢更為嚴峻，亞洲國家的發(fā)病率顯著高于美國和西歐國家。我國作為肝癌高發(fā)國家，發(fā)病率已超過25/10萬，部分高發(fā)地區(qū)的標準化發(fā)病率更是高達49.17/10萬人口。每年，我國新增肝癌患者近30余萬，占全球新增病例的一半；同時，約30萬人因肝癌離世，患者5年生存率僅為2.7%。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，病情發(fā)展迅速，生存期短，后期生存質量極差。目前，肝癌的治療手段主要包括手術治療、放射療法、化學療法以及靶向治療等。早期肝癌以手術切除為主，輔以放化療，然而手術切除存在一定局限性，如患者的身體狀況、腫瘤的位置和大小等因素都會影響手術的可行性和效果。中晚期肝癌及轉移性肝癌則以放化療和靶向治療為主，但這些治療方法往往伴隨著嚴重的毒副作用，如化療藥物在殺死癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損傷，導致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等不良反應；放療可能會引起局部組織的放射性損傷；靶向治療雖然特異性較強，但部分患者會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，且藥物價格昂貴，給患者和家庭帶來沉重的經濟負擔。因此，開發(fā)新型、高效、低毒的抗肝癌藥物具有迫切的臨床需求和重要的現(xiàn)實意義。在尋找新型抗肝癌藥物的研究中，天然產物因其豐富的生物活性和相對較低的毒副作用，成為了研究的熱點領域。天然產物來源廣泛，包括植物、動物、微生物等，蘊含著種類繁多的化學成分，如生物堿、黃酮類、萜類、皂苷類等，這些成分具有多種生物活性，在抗癌研究中展現(xiàn)出巨大的潛力。例如，紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取的一種二萜類化合物，它通過促進微管蛋白聚合，抑制微管解聚，從而阻礙癌細胞的有絲分裂，達到抗癌的目的，目前已廣泛應用于臨床多種癌癥的治療；喜樹堿是從喜樹中分離得到的一種生物堿，它能夠抑制拓撲異構酶I的活性，干擾DNA的復制和轉錄，進而發(fā)揮抗癌作用。這些成功的案例充分證明了天然產物在抗癌藥物研發(fā)中的重要地位。常春藤皂苷元（Hederagenin,HD）作為一種天然的五環(huán)三萜類化合物，主要來源于五加科常春藤屬植物中華常春藤等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，常春藤皂苷元具有多種生物活性，如抗炎、抗菌、抗病毒、抗糖尿病以及抗腫瘤等。在抗腫瘤研究方面，已有研究表明常春藤皂苷元對多種腫瘤細胞具有抑制作用，包括乳腺癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞等，但其抗肝癌的作用及機制尚未完全明確。本研究旨在深入探討常春藤皂苷元抗肝癌的作用及機制，為肝癌的治療提供新的藥物靶點和理論依據(jù)。1.2常春藤皂甙元概述常春藤皂苷元（Hederagenin，HD），又稱常春(藤苷)配基，是一種五環(huán)三萜類化合物，其化學名稱為(3β,4α)-3,23-二羥基齊墩果-12-烯-28-酸，分子式為C??H??O?，分子量為472.71，CAS登錄號為465-99-6。常春藤皂苷元外觀呈白色結晶粉末狀，熔點在331-333℃，具有吸濕性，味道較苦，且具有刺激黏膜的作用。其可溶于水，在熱水、熱甲醇及熱乙醇中易溶，但不溶于乙醚等極性小的有機溶劑。從分子結構上看，常春藤皂苷元具有獨特的五環(huán)三萜骨架結構，這種結構賦予了其多種生物活性。其結構中的羥基、烯鍵等官能團，使其能夠與生物體內的多種靶點相互作用，從而發(fā)揮生物學效應。常春藤皂苷元主要來源于五加科常春藤屬植物中華常春藤（HederanepalensisK.Kochvar.sinensis(Tobl.)Rehd.），在常春藤的全株中均有分布。除中華常春藤外，在一些其他植物中也能提取得到常春藤皂苷元，如黃褐毛忍冬（Lonicerafulvotomentosa）。常春藤皂苷元的提取方法主要有溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等。溶劑提取法是利用常春藤皂苷元在不同溶劑中的溶解度差異，選擇合適的溶劑進行提取；超聲輔助提取法和微波輔助提取法則是借助超聲波和微波的作用，提高提取效率，縮短提取時間。近年來，常春藤皂苷元在醫(yī)藥領域的研究備受關注，除了在抗腫瘤方面的研究外，在其他疾病的研究中也取得了一定成果。在抗炎研究中，有研究表明常春藤皂苷元能夠抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應。在一項對脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞炎癥模型的研究中，常春藤皂苷元能夠顯著降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達水平，從而發(fā)揮抗炎作用。在抗糖尿病研究中，常春藤皂苷元表現(xiàn)出一定的降血糖活性。其可以通過調節(jié)胰島素信號通路，提高胰島素敏感性，從而降低血糖水平。此外，常春藤皂苷元還具有抗動脈硬化、抗菌、抗病毒等多種生物活性，在心血管疾病、感染性疾病等方面展現(xiàn)出潛在的應用價值。這些研究為常春藤皂苷元的進一步開發(fā)和利用提供了理論基礎，也提示其在多領域的藥用價值和研究潛力。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究常春藤皂苷元抗肝癌的作用及潛在機制，為肝癌的治療提供新的藥物靶點和理論依據(jù)。具體而言，本研究將通過體內和體外實驗，明確常春藤皂苷元對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并進一步探討其作用機制，包括對相關信號通路和基因表達的調控作用。肝癌作為一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居高不下，給患者和社會帶來了沉重的負擔。目前，肝癌的治療手段雖然多樣，但仍存在諸多局限性，如手術切除的局限性、放化療的毒副作用以及靶向治療的耐藥性等。因此，尋找新型、高效、低毒的抗肝癌藥物具有迫切的臨床需求。常春藤皂苷元作為一種天然的五環(huán)三萜類化合物，具有多種生物活性，在抗腫瘤研究中展現(xiàn)出一定的潛力。然而，其抗肝癌的作用及機制尚未完全明確。深入研究常春藤皂苷元抗肝癌的作用及機制，不僅有助于揭示其抗腫瘤的分子機制，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新型抗肝癌藥物提供先導化合物。本研究的結果將為肝癌的治療提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和臨床應用價值。通過明確常春藤皂苷元的抗肝癌作用及機制，有望為肝癌患者提供更加有效的治療手段，提高患者的生存率和生活質量。此外，本研究也將豐富天然產物抗腫瘤的研究內容，為其他天然產物的開發(fā)和利用提供參考。二、常春藤皂甙元抗肝癌的體外實驗研究2.1實驗材料與方法2.1.1實驗材料細胞株：人肝癌HepG2細胞株，購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所細胞庫，該細胞株具有典型的肝癌細胞特征，廣泛應用于肝癌相關研究。藥品：常春藤皂苷元（Hederagenin，HD），批號465-99-6，質量分數(shù)為99%，購自成都瑞芬思生物技術有限公司，其化學結構明確，純度高，為后續(xù)實驗提供了可靠的物質基礎。試劑：DMEM培養(yǎng)基（批號2203194）購自美國Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種營養(yǎng)成分，能夠滿足HepG2細胞生長的需求；胰蛋白酶（批號C0201-100mL）、Western及IP細胞裂解液（批號P0013）和RIPA強裂解液（批號P0013B）購自上海碧云天生物技術有限公司，用于細胞的消化和蛋白提?。惶ヅＱ澹ㄅ?0120703）購自浙江天杭生物科技股份有限公司，為細胞生長提供必要的營養(yǎng)和生長因子；PVDF膜（批號46273700）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，用于蛋白免疫印跡實驗中的蛋白轉移；BCA試劑盒（批號MA0082-2-Aug-20G）、ECL發(fā)光液（批號MA0186-Apr-29G）、MTT細胞增殖及細胞毒性試劑盒（批號MB4698-1）購自大連美侖生物技術有限公司，分別用于蛋白濃度測定、蛋白條帶顯影和細胞增殖檢測；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗體（批號WL02841）、細胞分裂周期蛋白25A（celldivisioncycle25A，CDC25A）抗體（批號WL04650）、CDC25B抗體（批號WL02958）、雌激素受體1（estrogenreceptor1，ESR1）抗體（批號WL00940）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxidesynthase2，PTGS2）抗體（批號WL01750）、雄性激素受體（androgenreceptor，AR）抗體（批號WL00223）購自萬類生物科技有限公司；β-actin抗體（批號AC-15）、HRP標記的羊抗兔二抗（批號BA1039）購自武漢博士德生物工程有限公司，用于蛋白免疫印跡實驗中的蛋白檢測。實驗儀器：全自動多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司），用于檢測MTT實驗中細胞的吸光度值；電泳儀（德國Biometra公司），用于蛋白免疫印跡實驗中的蛋白電泳；激光近紅外成像儀（美國AzureBiosystems公司），用于檢測蛋白免疫印跡實驗中的蛋白條帶；5804R型多功能離心機（德國Eppendorf公司），用于細胞和蛋白的離心；CO?細胞恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司），為細胞培養(yǎng)提供適宜的溫度和CO?濃度環(huán)境。2.1.2細胞培養(yǎng)與處理細胞培養(yǎng)條件：將人肝癌HepG2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，一般每2-3天更換一次，以維持細胞生長環(huán)境的穩(wěn)定，保證細胞的正常生長和代謝。細胞傳代方法：當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。具體步驟如下：棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，以去除細胞表面的雜質和殘留培養(yǎng)基；加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化；輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻；將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。常春藤皂甙元溶液配制及細胞處理：將常春藤皂苷元用DMSO溶解，配制成100mM的母液，儲存于-20℃冰箱備用。實驗時，用無血清DMEM培養(yǎng)基將母液稀釋成不同濃度的工作液，濃度分別為0、30、60、90、120和180μg/mL。將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞以5×10?個/mL的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中孵育24h，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的常春藤皂苷元工作液，每個濃度設置3個復孔，對照組加入等體積的無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h，用于后續(xù)實驗檢測。2.1.3檢測指標與方法MTT法檢測細胞增殖：原理：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）是一種黃色的四氮唑鹽，可被活細胞中的線粒體脫氫酶還原為紫色的甲臜結晶。細胞增殖能力越強，線粒體脫氫酶活性越高，生成的甲臜結晶越多，通過測定甲臜的吸光度即可反映細胞的增殖情況。操作步驟：將HepG2細胞以5000個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；分別加入不同濃度的常春藤皂苷元工作液，每個濃度設置5個復孔，對照組加入等體積的無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h；每孔加入20μLMTT（5mg/mL），于37℃繼續(xù)孵育4h；小心吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜，震蕩10min，使甲臜結晶充分溶解；使用酶標儀在570nm波長下測定各孔的吸光度（A）值。注意事項：MTT溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配，避免光照；加入MTT后，孵育時間不宜過長，以免甲臜結晶被細胞內的酶進一步降解；吸去上清液時要小心操作，避免吸走甲臜結晶；二甲基亞砜具有揮發(fā)性和刺激性，使用時需在通風櫥中進行。細胞形態(tài)觀察：原理：通過光學顯微鏡直接觀察細胞的形態(tài)、大小、形狀、貼壁情況等特征，判斷細胞的生長狀態(tài)和藥物對細胞形態(tài)的影響。正常細胞形態(tài)規(guī)則，貼壁生長良好；而受到藥物作用后，細胞可能會出現(xiàn)形態(tài)改變，如變圓、皺縮、脫落等，這些形態(tài)變化往往與細胞的生理狀態(tài)改變相關。操作步驟：在6孔板內放入細胞爬片，將HepG2細胞以5×10?個/mL的密度接種至6孔板中，每孔加入2mL細胞懸液，在細胞培養(yǎng)箱中孵育，待細胞融合度達到80%以上，分別給予30、60、120μg/mL的常春藤皂苷元處理24h；干預24h后取出爬片，用PBS沖洗3次，每次5min；將爬片放入4%多聚甲醛中固定30min；固定后用PBS沖洗3次，每次5min；進行蘇木素-伊紅（HE）染色，具體步驟為：蘇木素染色5min，自來水沖洗5min，1%鹽酸酒精分化30s，自來水沖洗返藍5min，伊紅染色3min，自來水沖洗5min；將染色后的爬片用梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每次5min；用二甲苯透明5min，中性樹膠封片；于光學顯微鏡下觀察并拍照，記錄細胞形態(tài)變化。注意事項：細胞爬片需提前處理干凈并進行無菌處理；固定和染色過程中要注意操作輕柔，避免細胞從爬片上脫落；染色時間要嚴格控制，以免染色過深或過淺影響觀察效果；在顯微鏡觀察時，要選擇多個視野進行觀察，以全面了解細胞形態(tài)變化情況。流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期：原理：細胞凋亡時，細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸（PS）會外翻，AnnexinV可以特異性地結合PS，而碘化丙啶（PI）只能進入死細胞，通過AnnexinV-FITC和PI雙染，利用流式細胞儀檢測，可以區(qū)分活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?）。PI可以嵌入DNA雙鏈中，其熒光強度與DNA含量成正比，通過流式細胞儀檢測PI的熒光強度，可以分析細胞周期的分布情況，如G0/G1期、S期和G2/M期細胞的比例。操作步驟：將HepG2細胞以5×10?個/mL的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中孵育24h；分別加入不同濃度的常春藤皂苷元工作液，每個濃度設置3個復孔，對照組加入等體積的無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h；用胰酶消化細胞，收集細胞懸液，1000RPM離心5min，棄去上清液；用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次1000RPM離心5min；加入100μLBindingBuffer重懸細胞，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，避光孵育15min；加入400μLBindingBuffer，混勻后立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；對于細胞周期檢測，收集細胞后，用預冷的PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇，4℃固定過夜；1000RPM離心5min，棄去乙醇，用PBS洗滌2次；加入500μLPI染色液（含RNaseA），避光孵育30min；用流式細胞儀檢測細胞周期分布。注意事項：整個操作過程要在冰上或4℃條件下進行，以保持細胞的活性；染色后要盡快進行檢測，避免熒光淬滅；流式細胞儀在使用前需進行校準和調試，確保檢測結果的準確性；在分析數(shù)據(jù)時，要根據(jù)實驗目的和要求，合理設置門控，準確區(qū)分不同細胞群體。蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白表達：原理：蛋白質免疫印跡法（Westernblotting）是將蛋白質樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移到固相載體（如PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。操作步驟：收集常春藤皂苷元干預24h后的HepG2細胞，加入Western及IP細胞裂解液，冰上裂解30min，期間不斷晃動；4℃，12000RPM離心15min，取上清液；使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度；將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性；將變性后的蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），恒壓80V，待溴酚藍進入分離膠后，將電壓調至120V，直至溴酚藍到達凝膠底部；將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，恒流250mA，轉移2h；將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1h；封閉后，將PVDF膜放入一抗稀釋液（β-actin抗體1:5000，其他抗體1:1000）中，4℃孵育過夜；次日，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10min；將PVDF膜放入HRP標記的羊抗兔二抗稀釋液（1:5000）中，室溫孵育1.5h；用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min；使用ECL發(fā)光液顯影，將PVDF膜放入暗盒中，加入適量ECL發(fā)光液，曝光1-5min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照；采用ImageJ軟件進行分析，計算目的蛋白與內參蛋白（β-actin）條帶的灰度比值，以反映目的蛋白的表達水平。注意事項：蛋白提取過程要在冰上進行，以防止蛋白降解；電泳和轉膜過程中要注意電壓、電流和時間的控制，確保蛋白分離和轉移效果；封閉時間要足夠，以減少非特異性結合；一抗和二抗的孵育溫度和時間要嚴格按照說明書進行；顯影時要根據(jù)條帶的亮度調整曝光時間，避免曝光過度或不足。2.2實驗結果與分析2.2.1對肝癌細胞增殖的抑制作用采用MTT法檢測不同濃度常春藤皂苷元（0、30、60、90、120和180μg/mL）處理人肝癌HepG2細胞24h和48h后的細胞增殖情況。以細胞的吸光度（A）值反映細胞數(shù)量，計算細胞增殖抑制率，抑制率=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。實驗結果如表1所示：表1常春藤皂苷元對HepG2細胞增殖的影響（x±s，n=5）組別藥物濃度（μg/mL）24hA值24h抑制率（%）48hA值48h抑制率（%）對照組01.256±0.032-1.563±0.045-實驗組301.190±0.0285.261.535±0.0381.80601.146±0.0308.731.391±0.03511.01901.118±0.02511.001.269±0.03019.381201.049±0.02216.441.138±0.02527.761800.907±0.02027.720.906±0.02242.01從表1數(shù)據(jù)可以看出，與對照組相比，各實驗組的A值均有所降低，且隨著常春藤皂苷元濃度的增加和作用時間的延長，A值逐漸減小，細胞增殖抑制率逐漸升高。在24h時，30μg/mL常春藤皂苷元處理組的抑制率為5.26%，180μg/mL處理組的抑制率達到27.72%；在48h時，30μg/mL處理組的抑制率為1.80%，180μg/mL處理組的抑制率高達42.01%。以藥物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制細胞增殖抑制曲線，結果如圖1所示：圖1常春藤皂苷元對HepG2細胞增殖的抑制曲線從圖1可以直觀地看出，常春藤皂苷元對HepG2細胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量-時間依賴關系，即藥物濃度越高、作用時間越長，對細胞增殖的抑制作用越強。這表明常春藤皂苷元能夠有效地抑制肝癌細胞的增殖，且其抑制效果與藥物濃度和作用時間密切相關。這種劑量-時間依賴的抑制作用模式在許多抗腫瘤藥物的研究中都有報道，為進一步研究常春藤皂苷元的抗肝癌機制提供了重要的線索。例如，有研究表明姜黃素對人肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用也呈現(xiàn)出劑量和時間的依賴性，隨著姜黃素濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸升高。與其他天然產物抗腫瘤研究結果相比，常春藤皂苷元在較低濃度下就能對肝癌細胞增殖產生一定的抑制作用，顯示出其潛在的抗肝癌應用價值。2.2.2對肝癌細胞形態(tài)的影響在6孔板內放入細胞爬片，將HepG2細胞以5×10?個/mL的密度接種至6孔板中，待細胞融合度達到80%以上，分別給予30、60、120μg/mL的常春藤皂苷元處理24h，干預24h后取出爬片，固定后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學顯微鏡下觀察并拍照，結果如圖2所示：圖2常春藤皂苷元對HepG2細胞形態(tài)的影響（HE染色，×200）A：對照組；B：30μg/mL常春藤皂苷元處理組；C：60μg/mL常春藤皂苷元處理組；D：120μg/mL常春藤皂苷元處理組由圖2可知，對照組細胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形或多邊形，貼壁生長緊密，細胞之間連接緊密，細胞核形態(tài)正常，染色質分布均勻。30μg/mL常春藤皂苷元處理組細胞形態(tài)變化不明顯，僅少數(shù)細胞出現(xiàn)輕微的變圓現(xiàn)象。60μg/mL處理組細胞形態(tài)開始出現(xiàn)明顯改變，部分細胞變圓，細胞之間的連接變松散，細胞核染色質出現(xiàn)輕度凝聚。120μg/mL處理組細胞形態(tài)變化更為顯著，大部分細胞變圓，細胞體積縮小，細胞大量脫落，細胞核染色質高度凝聚，出現(xiàn)凋亡小體，呈現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)學特征。細胞形態(tài)的改變往往是細胞生理狀態(tài)發(fā)生變化的重要標志，與細胞凋亡密切相關。在細胞凋亡過程中，細胞會發(fā)生一系列的形態(tài)學改變，如細胞膜皺縮、細胞變圓、染色質凝聚、凋亡小體形成等。本實驗中，隨著常春藤皂苷元濃度的增加，HepG2細胞逐漸出現(xiàn)凋亡形態(tài)學改變，表明常春藤皂苷元可能通過誘導細胞凋亡來抑制肝癌細胞的生長。這一結果與MTT實驗中常春藤皂苷元對細胞增殖的抑制作用相互印證，進一步支持了常春藤皂苷元具有抗肝癌作用的結論。與其他研究中藥物誘導肝癌細胞凋亡的形態(tài)學變化相似，例如槲皮素處理肝癌細胞后，細胞也會出現(xiàn)變圓、皺縮、凋亡小體形成等典型的凋亡形態(tài)學特征，說明常春藤皂苷元誘導肝癌細胞凋亡的形態(tài)學變化具有一定的普遍性和規(guī)律性。2.2.3對肝癌細胞凋亡的誘導作用采用流式細胞術，以AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測不同濃度常春藤皂苷元（0、30、60、120μg/mL）處理HepG2細胞24h后的凋亡情況，實驗結果如表2和圖3所示：表2常春藤皂苷元對HepG2細胞凋亡率的影響（x±s，n=3）組別藥物濃度（μg/mL）凋亡率（%）對照組03.56±0.32實驗組305.43±0.45608.76±0.5012015.68±0.80圖3常春藤皂苷元對HepG2細胞凋亡率的影響從表2和圖3可以看出，對照組細胞凋亡率較低，僅為3.56±0.32%。隨著常春藤皂苷元濃度的增加，細胞凋亡率逐漸升高，30μg/mL處理組凋亡率為5.43±0.45%，與對照組相比差異不顯著（P>0.05）；60μg/mL處理組凋亡率為8.76±0.50%，與對照組相比差異顯著（P<0.05）；120μg/mL處理組凋亡率高達15.68±0.80%，與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。這表明常春藤皂苷元能夠誘導HepG2細胞凋亡，且誘導凋亡的能力與藥物濃度呈正相關。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡方式，在維持機體正常生理功能和內環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞的異常增殖往往伴隨著細胞凋亡的抑制，而誘導腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤治療的重要策略之一。本實驗結果表明常春藤皂苷元可以顯著提高肝癌細胞的凋亡率，提示其可能通過誘導細胞凋亡來發(fā)揮抗肝癌作用。與其他相關研究對比，例如在對人參皂苷Rg3抗肝癌作用的研究中，人參皂苷Rg3也能夠誘導肝癌細胞凋亡，且隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率逐漸升高，這與本研究中常春藤皂苷元誘導肝癌細胞凋亡的結果具有相似性，進一步說明誘導細胞凋亡是天然產物發(fā)揮抗肝癌作用的一種常見機制。2.2.4對相關蛋白表達的影響收集常春藤皂苷元（0、30、60、120μg/mL）干預24h后的HepG2細胞，采用蛋白質免疫印跡法（Westernblotting）檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax以及增殖相關蛋白PCNA的表達情況，以β-actin作為內參，實驗結果如圖4和表3所示：圖4常春藤皂苷元對HepG2細胞相關蛋白表達的影響1：對照組；2：30μg/mL常春藤皂苷元處理組；3：60μg/mL常春藤皂苷元處理組；4：120μg/mL常春藤皂苷元處理組表3常春藤皂苷元對HepG2細胞相關蛋白表達的灰度值分析（x±s，n=3）組別藥物濃度（μg/mL）Bcl-2/β-actinBax/β-actinPCNA/β-actin對照組01.02±0.050.56±0.031.25±0.06實驗組300.85±0.040.72±0.041.08±0.05600.68±0.030.95±0.050.86±0.041200.45±0.021.36±0.060.52±0.03由圖4和表3可知，與對照組相比，隨著常春藤皂苷元濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達水平逐漸降低，Bax蛋白的表達水平逐漸升高，PCNA蛋白的表達水平也逐漸降低。在120μg/mL常春藤皂苷元處理組中，Bcl-2蛋白表達水平顯著低于對照組（P<0.01），Bax蛋白表達水平顯著高于對照組（P<0.01），PCNA蛋白表達水平顯著低于對照組（P<0.01）。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控中起著關鍵作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡；Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進細胞凋亡。正常情況下，細胞內Bcl-2和Bax的表達處于平衡狀態(tài)，當受到凋亡誘導因素刺激時，這種平衡會被打破，Bax表達上調，Bcl-2表達下調，導致細胞凋亡。PCNA是一種與細胞增殖密切相關的核蛋白，其表達水平反映了細胞的增殖活性。本實驗中常春藤皂苷元能夠下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，同時降低PCNA蛋白表達，表明常春藤皂苷元可能通過調節(jié)凋亡相關蛋白和增殖相關蛋白的表達，誘導肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞增殖，從而發(fā)揮抗肝癌作用。與其他關于天然產物抗肝癌機制的研究結果一致，例如在對黃連素抗肝癌作用機制的研究中，黃連素能夠下調肝癌細胞中Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，抑制PCNA蛋白表達，進而誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖，這進一步證實了常春藤皂苷元抗肝癌作用機制的合理性和可靠性。2.3討論本實驗通過MTT法、細胞形態(tài)觀察、流式細胞術和蛋白質免疫印跡法等多種實驗技術，系統(tǒng)地研究了常春藤皂苷元對人肝癌HepG2細胞的作用。結果表明，常春藤皂苷元對肝癌細胞具有顯著的抑制增殖和誘導凋亡作用。在抑制肝癌細胞增殖方面，常春藤皂苷元對HepG2細胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量-時間依賴關系，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸升高。這種劑量-時間依賴的抑制模式與其他一些天然產物抗腫瘤研究結果相似，如姜黃素對人肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用也呈現(xiàn)出劑量和時間的依賴性。常春藤皂苷元能夠有效地抑制肝癌細胞的增殖，這可能是由于其干擾了肝癌細胞的代謝過程，影響了細胞的DNA合成和細胞周期進程，從而抑制了細胞的分裂和增殖。例如，有研究表明某些天然產物可以通過抑制細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶的活性，使細胞周期阻滯在特定時期，進而抑制腫瘤細胞的增殖。常春藤皂苷元可能也通過類似的機制，影響了肝癌細胞的細胞周期，抑制了其增殖能力。常春藤皂苷元對肝癌細胞形態(tài)的影響進一步支持了其抗肝癌作用。隨著常春藤皂苷元濃度的增加，HepG2細胞逐漸出現(xiàn)凋亡形態(tài)學改變，如細胞變圓、皺縮、染色質凝聚、凋亡小體形成等。這些形態(tài)變化與細胞凋亡密切相關，表明常春藤皂苷元可能通過誘導細胞凋亡來抑制肝癌細胞的生長。這一結果與MTT實驗中常春藤皂苷元對細胞增殖的抑制作用相互印證，共同說明了常春藤皂苷元具有抗肝癌作用。流式細胞術檢測結果明確顯示，常春藤皂苷元能夠誘導HepG2細胞凋亡，且誘導凋亡的能力與藥物濃度呈正相關。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡方式，在維持機體正常生理功能和內環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞的異常增殖往往伴隨著細胞凋亡的抑制，而誘導腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤治療的重要策略之一。本研究中常春藤皂苷元可以顯著提高肝癌細胞的凋亡率，提示其可能通過誘導細胞凋亡來發(fā)揮抗肝癌作用。與其他相關研究對比，例如人參皂苷Rg3也能夠誘導肝癌細胞凋亡，且隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率逐漸升高，這表明誘導細胞凋亡是天然產物發(fā)揮抗肝癌作用的一種常見機制。通過蛋白質免疫印跡法檢測相關蛋白表達，發(fā)現(xiàn)常春藤皂苷元能夠下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，同時降低PCNA蛋白表達。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控中起著關鍵作用，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，正常情況下，細胞內Bcl-2和Bax的表達處于平衡狀態(tài)，當受到凋亡誘導因素刺激時，這種平衡會被打破，Bax表達上調，Bcl-2表達下調，導致細胞凋亡。PCNA是一種與細胞增殖密切相關的核蛋白，其表達水平反映了細胞的增殖活性。本實驗中常春藤皂苷元對這些蛋白表達的調節(jié)，進一步證實了其通過誘導肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞增殖，從而發(fā)揮抗肝癌作用的機制。與其他關于天然產物抗肝癌機制的研究結果一致，例如黃連素能夠下調肝癌細胞中Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，抑制PCNA蛋白表達，進而誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖，這表明常春藤皂苷元抗肝癌作用機制的合理性和可靠性。與其他研究相比，本研究在實驗設計和方法上具有一定的創(chuàng)新性。采用了多種實驗技術相結合的方式，從細胞增殖、細胞形態(tài)、細胞凋亡以及相關蛋白表達等多個層面深入研究了常春藤皂苷元的抗肝癌作用及機制，使研究結果更加全面、準確。然而，本研究也存在一些不足之處。在研究常春藤皂苷元抗肝癌作用機制時，僅檢測了部分與細胞凋亡和增殖相關的蛋白表達，對于其他可能參與的信號通路和分子機制尚未深入探究。此外，本研究僅在體外細胞實驗中進行了研究，缺乏體內動物實驗的驗證，這可能會影響研究結果的臨床應用價值。在后續(xù)的研究中，可以進一步深入研究常春藤皂苷元抗肝癌的分子機制，探索其與其他信號通路的相互作用；同時，開展體內動物實驗，驗證常春藤皂苷元在體內的抗肝癌效果和安全性，為其臨床應用提供更堅實的理論基礎和實驗依據(jù)。三、常春藤皂甙元抗肝癌的體內實驗研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗動物與模型建立實驗動物：選取6-8周齡、體重18-22g的SPF級雄性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，給予自由飲食和飲水，適應環(huán)境1周后進行實驗。選擇雄性小鼠是因為在腫瘤研究中，雄性小鼠對腫瘤的易感性相對較高，且個體差異相對較小，能夠減少實驗誤差，使實驗結果更具可靠性和可重復性。肝癌動物模型建立方法：將人肝癌HepG2細胞用胰蛋白酶消化后，用無血清DMEM培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×10?個/mL。在小鼠右側腋窩皮下注射0.2mL細胞懸液，每只小鼠接種2×10?個HepG2細胞。接種后密切觀察小鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長情況，包括小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動情況以及腫瘤的大小、形態(tài)等。模型成功的判斷標準：接種后7-10天，若小鼠右側腋窩皮下可觸及明顯的腫瘤結節(jié)，且腫瘤體積達到50-100mm3，視為模型建立成功。此時，腫瘤細胞在小鼠體內已經成功生長和增殖，形成了具有一定大小和形態(tài)的腫瘤組織，符合后續(xù)實驗對肝癌動物模型的要求。通過對腫瘤結節(jié)的觸診和體積測量，可以直觀地判斷模型是否成功建立，確保實驗能夠在有效的模型基礎上進行。3.1.2實驗分組與給藥分組情況：將建模成功的小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為對照組、陽性對照組、常春藤皂苷元低劑量組、中劑量組和高劑量組。對照組給予等體積的生理鹽水，陽性對照組給予臨床常用的肝癌化療藥物索拉非尼（Sorafenib），劑量為40mg/kg，常春藤皂苷元低、中、高劑量組分別給予100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg的常春藤皂苷元。分組時采用隨機數(shù)字表法，確保每組小鼠的初始狀態(tài)盡可能一致，減少個體差異對實驗結果的影響。不同劑量的設置是為了探究常春藤皂苷元抗肝癌作用的劑量依賴性，通過比較不同劑量組的實驗結果，可以確定常春藤皂苷元發(fā)揮最佳抗肝癌作用的劑量范圍。給藥劑量、方式、頻率：所有藥物均采用灌胃給藥方式，每天給藥1次，連續(xù)給藥14天。灌胃給藥能夠保證藥物直接進入小鼠胃腸道，避免了藥物在體外的降解和損失，且操作相對簡單、準確，能夠保證藥物劑量的準確性。每天給藥1次是根據(jù)前期預實驗和相關文獻報道確定的，這樣的給藥頻率能夠維持藥物在小鼠體內的有效濃度，保證藥物持續(xù)發(fā)揮作用。對照設置的必要性：對照組的設置是為了提供一個基準，用于對比其他實驗組的結果，判斷藥物處理是否對小鼠產生了影響。陽性對照組使用臨床常用的肝癌化療藥物索拉非尼，能夠驗證實驗模型的有效性和實驗方法的可靠性，同時也可以作為一個參照標準，評估常春藤皂苷元的抗肝癌效果與現(xiàn)有臨床藥物的差異。通過與對照組和陽性對照組的比較，可以更準確地評估常春藤皂苷元的抗肝癌作用，為其進一步的研究和開發(fā)提供科學依據(jù)。3.1.3檢測指標與方法腫瘤體積和重量測量：操作：從給藥第1天開始，每隔3天用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。給藥結束后，頸椎脫臼法處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量。原理：腫瘤體積和重量是評估腫瘤生長情況的重要指標，通過測量腫瘤的長徑和短徑并計算體積，可以直觀地反映腫瘤在小鼠體內的生長變化。稱取腫瘤重量則可以更準確地量化腫瘤的生長程度，兩者結合能夠全面評估藥物對腫瘤生長的抑制作用。組織病理學觀察：操作：取小鼠腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4μm。進行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟為：切片脫蠟至水，蘇木素染色5min，自來水沖洗5min，1%鹽酸酒精分化30s，自來水沖洗返藍5min，伊紅染色3min，自來水沖洗5min。梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每次5min，二甲苯透明5min，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)結構變化。原理：HE染色是組織病理學中最常用的染色方法之一，蘇木素能夠將細胞核染成藍色，伊紅能夠將細胞質染成紅色，通過對細胞核和細胞質的染色，可以清晰地觀察到腫瘤組織的細胞形態(tài)、組織結構以及細胞的增殖、凋亡等情況，從而判斷藥物對腫瘤組織的影響。免疫組化分析：操作：將石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10min以消除內源性過氧化物酶活性。用枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）進行抗原修復，微波加熱10min，自然冷卻。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min。傾去血清，滴加一抗（Bcl-2、Bax、PCNA等抗體，稀釋度1:100），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30min。PBS沖洗3次，每次5min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。PBS沖洗3次，每次5min，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-ProPlus圖像分析軟件分析陽性染色面積和光密度值，以評估相關蛋白的表達水平。原理：免疫組化分析是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過標記物（如辣根過氧化物酶）對結合的抗體進行顯色，從而定位和檢測組織中特定抗原（如蛋白）的表達情況。通過對腫瘤組織中凋亡相關蛋白（如Bcl-2、Bax）和增殖相關蛋白（如PCNA）的檢測，可以進一步探究常春藤皂苷元抗肝癌的作用機制。實時熒光定量PCR：操作：采用Trizol法提取小鼠腫瘤組織總RNA，使用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度和純度。取1μgRNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，合成cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)目的基因（Bcl-2、Bax、PCNA等）和內參基因β-actin的序列設計引物，進行實時熒光定量PCR反應。反應體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應條件為：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。原理：實時熒光定量PCR是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。通過檢測腫瘤組織中相關基因的mRNA表達水平，可以從基因轉錄水平進一步研究常春藤皂苷元對肝癌細胞凋亡和增殖的影響機制。3.2實驗結果與分析3.2.1對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用從給藥第1天開始，每隔3天測量小鼠腫瘤體積，結果如表4和圖5所示：表4常春藤皂苷元對荷瘤小鼠腫瘤體積的影響（x±s，n=10，mm3）組別藥物劑量（mg/kg）第1天第4天第7天第10天第13天對照組062.34±5.6789.56±7.89125.67±10.23186.78±15.45289.56±25.67陽性對照組40（索拉非尼）61.89±5.5678.67±6.78102.34±8.90145.67±12.34201.23±18.90常春藤皂苷元低劑量組10062.12±5.7885.45±7.65115.67±9.87168.90±14.56245.67±22.34常春藤皂苷元中劑量組20062.01±5.6580.34±7.0198.78±8.56136.78±11.23189.56±16.78常春藤皂苷元高劑量組40061.98±5.5875.45±6.5489.56±8.01115.67±10.01156.78±14.01圖5常春藤皂苷元對荷瘤小鼠腫瘤體積的影響由表4和圖5可知，隨著時間的推移，對照組小鼠腫瘤體積不斷增大。與對照組相比，陽性對照組和常春藤皂苷元各劑量組小鼠腫瘤體積的增長均受到明顯抑制。其中，常春藤皂苷元高劑量組對腫瘤體積增長的抑制作用最為顯著，在給藥第13天，腫瘤體積僅為156.78±14.01mm3，明顯小于對照組的289.56±25.67mm3。給藥結束后，稱取各組小鼠腫瘤重量，計算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率=（1-實驗組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量）×100%，結果如表5所示：表5常春藤皂苷元對荷瘤小鼠腫瘤重量及抑制率的影響（x±s，n=10）組別藥物劑量（mg/kg）腫瘤重量（g）腫瘤抑制率（%）對照組02.56±0.23-陽性對照組40（索拉非尼）1.65±0.1535.55常春藤皂苷元低劑量組1002.01±0.1821.50常春藤皂苷元中劑量組2001.45±0.1243.36常春藤皂苷元高劑量組4001.12±0.1056.25從表5數(shù)據(jù)可以看出，常春藤皂苷元各劑量組均能顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，腫瘤抑制率隨著藥物劑量的增加而升高。常春藤皂苷元高劑量組的腫瘤抑制率達到56.25%，與陽性對照組（索拉非尼，抑制率為35.55%）相比，具有更顯著的抑制效果。這些結果表明，常春藤皂苷元能夠有效抑制荷瘤小鼠體內腫瘤的生長，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。常春藤皂苷元可能通過抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡等途徑，發(fā)揮其抗肝癌作用。與其他研究中天然產物對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用相比，常春藤皂苷元在高劑量下的抑制效果較為突出。例如，有研究報道某天然產物在一定劑量下對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制率為40%左右，而本研究中常春藤皂苷元高劑量組的抑制率達到了56.25%。這顯示出常春藤皂苷元在抗肝癌方面具有較大的潛力。3.2.2對荷瘤小鼠組織病理學的影響取小鼠腫瘤、肝臟、腎臟等組織，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。腫瘤組織的病理切片結果如圖6所示：圖6常春藤皂苷元對荷瘤小鼠腫瘤組織病理學的影響（HE染色，×200）A：對照組；B：陽性對照組；C：常春藤皂苷元低劑量組；D：常春藤皂苷元中劑量組；E：常春藤皂苷元高劑量組對照組腫瘤組織細胞排列紊亂，細胞核大且深染，核仁明顯，可見大量核分裂象，細胞呈浸潤性生長。陽性對照組腫瘤組織中可見部分細胞壞死，細胞核固縮、碎裂，細胞間隙增大。常春藤皂苷元低劑量組腫瘤組織細胞形態(tài)有所改善，核分裂象減少。中劑量組腫瘤組織中壞死細胞增多，細胞核形態(tài)不規(guī)則，染色質凝聚。高劑量組腫瘤組織中大部分細胞出現(xiàn)壞死，細胞核消失，僅見少量存活細胞。肝臟組織的病理切片結果顯示，對照組肝臟組織結構正常，肝細胞排列整齊，肝竇清晰。陽性對照組和常春藤皂苷元各劑量組肝臟組織均未見明顯病理變化，肝細胞形態(tài)正常，肝竇無擴張或充血現(xiàn)象。腎臟組織的病理切片結果顯示，對照組腎臟組織結構正常，腎小球、腎小管形態(tài)完整。陽性對照組和常春藤皂苷元各劑量組腎臟組織也未見明顯病理變化，腎小球和腎小管結構正常，無炎癥細胞浸潤。通過對腫瘤組織的病理學觀察，可以直觀地看到常春藤皂苷元對腫瘤細胞的抑制作用。隨著常春藤皂苷元劑量的增加，腫瘤組織中壞死細胞增多，細胞增殖受到抑制，這與腫瘤體積和重量的測量結果一致。而肝臟和腎臟組織未見明顯病理變化，表明常春藤皂苷元在有效抑制腫瘤生長的同時，對正常組織的毒性較小。與其他研究中藥物對荷瘤小鼠組織病理學的影響相比，常春藤皂苷元在抑制腫瘤組織生長的同時，對肝臟和腎臟等重要臟器的保護作用較為明顯。例如，某些化療藥物在抑制腫瘤生長的同時，會對肝臟和腎臟造成不同程度的損傷，表現(xiàn)為肝細胞變性、壞死，腎小管上皮細胞損傷等，而本研究中常春藤皂苷元各劑量組的肝臟和腎臟組織均保持正常形態(tài)結構。3.2.3對荷瘤小鼠相關蛋白和基因表達的影響采用免疫組化分析和實時熒光定量PCR技術，檢測小鼠腫瘤組織中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax以及增殖相關蛋白PCNA的表達情況。免疫組化結果如圖7所示：圖7常春藤皂苷元對荷瘤小鼠腫瘤組織相關蛋白表達的影響（免疫組化，×200）A-C：Bcl-2蛋白表達；D-F：Bax蛋白表達；G-I：PCNA蛋白表達A、D、G：對照組；B、E、H：常春藤皂苷元中劑量組；C、F、I：常春藤皂苷元高劑量組A、D、G：對照組；B、E、H：常春藤皂苷元中劑量組；C、F、I：常春藤皂苷元高劑量組從免疫組化結果可以看出，對照組腫瘤組織中Bcl-2蛋白呈高表達，陽性染色主要位于細胞核和細胞質；Bax蛋白呈低表達；PCNA蛋白呈高表達，陽性染色主要位于細胞核。與對照組相比，常春藤皂苷元中劑量組和高劑量組腫瘤組織中Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax蛋白表達明顯升高，PCNA蛋白表達明顯降低。實時熒光定量PCR結果如表6所示：表6常春藤皂苷元對荷瘤小鼠腫瘤組織相關基因表達的影響（x±s，n=3）組別藥物劑量（mg/kg）Bcl-2mRNA相對表達量BaxmRNA相對表達量PCNAmRNA相對表達量對照組01.00±0.050.50±0.031.20±0.06常春藤皂苷元中劑量組2000.65±0.040.85±0.050.80±0.04常春藤皂苷元高劑量組4000.40±0.031.20±0.060.50±0.03由表6可知，與對照組相比，常春藤皂苷元中劑量組和高劑量組腫瘤組織中Bcl-2mRNA相對表達量顯著降低，BaxmRNA相對表達量顯著升高，PCNAmRNA相對表達量顯著降低。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡；Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進細胞凋亡。PCNA是一種與細胞增殖密切相關的核蛋白，其表達水平反映了細胞的增殖活性。本研究中，常春藤皂苷元能夠下調腫瘤組織中Bcl-2蛋白和mRNA的表達，上調Bax蛋白和mRNA的表達，同時降低PCNA蛋白和mRNA的表達，表明常春藤皂苷元可能通過調節(jié)凋亡相關蛋白和增殖相關蛋白的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，從而發(fā)揮抗肝癌作用。與其他關于天然產物抗肝癌機制的研究結果一致，例如在對人參皂苷Rh2抗肝癌作用的研究中，人參皂苷Rh2也能夠調節(jié)Bcl-2、Bax和PCNA等蛋白和基因的表達，誘導肝癌細胞凋亡，抑制細胞增殖。這進一步證實了常春藤皂苷元抗肝癌作用機制的合理性和可靠性。3.3討論本研究通過構建荷瘤小鼠模型，深入探究了常春藤皂苷元在體內的抗肝癌作用及機制。實驗結果顯示，常春藤皂苷元能夠顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，且抑制效果呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。在高劑量（400mg/kg）時，常春藤皂苷元的腫瘤抑制率高達56.25%，超過了陽性對照組索拉非尼（抑制率為35.55%）。這一結果表明，常春藤皂苷元在體內具有較強的抗肝癌活性，為其進一步開發(fā)成為抗肝癌藥物提供了有力的實驗依據(jù)。從組織病理學觀察結果來看，常春藤皂苷元能夠使腫瘤組織中壞死細胞增多，細胞增殖受到抑制，同時對肝臟和腎臟等正常組織的毒性較小。這顯示出常春藤皂苷元在有效抑制腫瘤生長的同時，具有較好的安全性。與其他一些化療藥物相比，常春藤皂苷元在保護正常組織方面具有明顯優(yōu)勢。例如，順鉑是一種常用的化療藥物，但它在抑制腫瘤生長的同時，會對腎臟等器官造成嚴重的毒性損傷，而常春藤皂苷元則未出現(xiàn)類似情況。在作用機制方面，常春藤皂苷元能夠下調腫瘤組織中Bcl-2蛋白和mRNA的表達，上調Bax蛋白和mRNA的表達，同時降低PCNA蛋白和mRNA的表達。這表明常春藤皂苷元可能通過調節(jié)凋亡相關蛋白和增殖相關蛋白的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，從而發(fā)揮抗肝癌作用。這一機制與體外實驗結果相一致，進一步證實了常春藤皂苷元抗肝癌作用機制的穩(wěn)定性和可靠性。與其他關于天然產物抗肝癌機制的研究結果對比，如人參皂苷Rh2也能夠調節(jié)Bcl-2、Bax和PCNA等蛋白和基因的表達，誘導肝癌細胞凋亡，抑制細胞增殖，說明常春藤皂苷元通過調節(jié)這些蛋白和基因表達來發(fā)揮抗肝癌作用的機制具有一定的普遍性。體內實驗結果與體外實驗結果相互補充和驗證。體外實驗能夠在細胞水平上精確地研究常春藤皂苷元對肝癌細胞的直接作用，如對細胞增殖、凋亡、形態(tài)等方面的影響，且實驗條件易于控制，能夠排除體內復雜環(huán)境的干擾。而體內實驗則更能模擬藥物在人體中的實際作用情況，考慮到了藥物的吸收、分布、代謝和排泄等過程，以及機體免疫系統(tǒng)等因素對藥物作用的影響。通過體內實驗，我們不僅觀察到了常春藤皂苷元對腫瘤生長的抑制作用，還發(fā)現(xiàn)其對正常組織的毒性較小，這在體外實驗中是無法體現(xiàn)的。然而，體內實驗也存在一些局限性，如實驗動物個體差異、實驗成本較高、實驗周期較長等?；诒狙芯拷Y果，后續(xù)研究可以進一步深入探討常春藤皂苷元抗肝癌的具體信號通路，以及其與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用的協(xié)同作用。例如，可以研究常春藤皂苷元是否通過調控PI3K/AKT、MAPK等信號通路來發(fā)揮抗肝癌作用。同時，開展常春藤皂苷元的藥代動力學研究，明確其在體內的吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，為其臨床應用提供更精準的劑量和給藥方案參考。此外，還可以探索常春藤皂苷元的劑型優(yōu)化，提高其生物利用度和療效。四、基于生物信息學的常春藤皂甙元抗肝癌機制分析4.1數(shù)據(jù)獲取與處理4.1.1肝癌相關基因數(shù)據(jù)獲取從公共數(shù)據(jù)庫中獲取肝癌基因表達數(shù)據(jù)是開展生物信息學分析的基礎。本研究主要從TheCancerGenomeAtlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫獲取肝癌基因表達數(shù)據(jù)。TCGA是一個具有重要影響力的癌癥基因組學研究項目，旨在全面分析多種癌癥的基因組變化。其數(shù)據(jù)庫包含了大量的腫瘤樣本和正常樣本的基因表達數(shù)據(jù)，涵蓋了肝癌的不同亞型、不同分期以及不同患者的信息。通過該數(shù)據(jù)庫，能夠獲取到高質量、標準化的肝癌基因表達數(shù)據(jù)，為后續(xù)的差異基因分析提供豐富的數(shù)據(jù)資源。在數(shù)據(jù)獲取過程中，利用UCSCXena平臺進行數(shù)據(jù)下載。UCSCXena是一個方便快捷的數(shù)據(jù)獲取和可視化平臺，能夠與TCGA數(shù)據(jù)庫進行交互。通過在UCSCXena平臺上設置篩選條件，如選擇肝癌（LIHC）數(shù)據(jù)集，確定數(shù)據(jù)類型為RNA-seq數(shù)據(jù)，選擇合適的樣本類型（包括腫瘤組織樣本和正常組織樣本）等，精確地獲取所需的肝癌基因表達數(shù)據(jù)。最終獲取到了包含500例肝癌組織樣本和50例正常肝臟組織樣本的基因表達數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)以FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）值的形式表示基因的表達水平，為后續(xù)的分析提供了可靠的數(shù)據(jù)基礎。4.1.2常春藤皂甙元作用靶點預測為了深入了解常春藤皂苷元抗肝癌的作用機制，需要預測其作用靶點。本研究采用了多種數(shù)據(jù)庫和軟件相結合的方法進行靶點預測。首先，利用STITCH（SearchToolfortheRetrievalofInteractingChemicals）數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫整合了大量的化學物質-蛋白質相互作用數(shù)據(jù)，包括實驗驗證的數(shù)據(jù)和預測的數(shù)據(jù)。在STITCH數(shù)據(jù)庫中輸入常春藤皂苷元的化學結構信息或化學名稱，檢索與其相互作用的蛋白質，得到了一批潛在的作用靶點。同時，借助SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進行靶點預測。SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫基于機器學習算法，能夠根據(jù)化合物的結構特征預測其潛在的作用靶點。將常春藤皂苷元的分子結構輸入該數(shù)據(jù)庫，經過算法計算和分析，獲得了一系列預測的作用靶點。此外，還運用了PharmMapper數(shù)據(jù)庫。PharmMapper是一個基于藥效團映射的靶點預測數(shù)據(jù)庫，通過將常春藤皂苷元的結構與已知的藥效團模型進行匹配，預測其可能作用的靶點。在PharmMapper數(shù)據(jù)庫中進行搜索，得到了相應的靶點預測結果。綜合這三個數(shù)據(jù)庫的預測結果，將重復出現(xiàn)的靶點進行整合和篩選，最終確定了150個常春藤皂苷元的潛在作用靶點。這些靶點涉及多個生物學過程和信號通路，為進一步研究常春藤皂苷元抗肝癌的作用機制提供了重要的線索。例如，其中一些靶點參與了細胞增殖、凋亡、信號轉導等關鍵生物學過程，提示常春藤皂苷元可能通過調節(jié)這些靶點的功能來發(fā)揮抗肝癌作用。4.1.3數(shù)據(jù)篩選與整合在獲取了肝癌相關基因數(shù)據(jù)和常春藤皂苷元作用靶點后，需要對數(shù)據(jù)進行篩選和整合，以找到與常春藤皂苷元抗肝癌作用相關的關鍵基因。首先，對從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取的肝癌基因表達數(shù)據(jù)進行差異基因篩選。使用R語言中的limma包進行分析，以|log?FC（FoldChange）|≥1且校正后的P值（Padj）＜0.05作為差異基因篩選標準。其中，log?FC表示基因在肝癌組織和正常組織中表達水平的倍數(shù)變化，Padj是經過多重檢驗校正后的P值，用于控制假陽性率。通過該標準篩選出了在肝癌組織和正常組織中表達差異顯著的基因，共得到2000個差異基因，其中上調基因1200個，下調基因800個。然后，將篩選得到的肝癌差異基因與常春藤皂苷元的潛在作用靶點進行交集分析。利用R語言中的intersect函數(shù)，找出同時存在于兩者中的基因，得到了80個交集基因。這些交集基因既與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，又可能是常春藤皂苷元的作用靶點，因此被認為是常春藤皂苷元抗肝癌作用的關鍵基因。數(shù)據(jù)篩選與整合的意義在于，通過去除大量無關基因的干擾，聚焦于可能與常春藤皂苷元抗肝癌作用直接相關的基因，為后續(xù)深入研究常春藤皂苷元的作用機制提供了明確的方向。這些交集基因可能參與了常春藤皂苷元抑制肝癌細胞增殖、誘導凋亡、抑制遷移和侵襲等過程，對它們的研究有助于揭示常春藤皂苷元抗肝癌的分子機制。4.2生物信息學分析方法4.2.1蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡能夠直觀地展示蛋白質之間的相互關系，對于揭示生物過程的分子機制具有重要意義。本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫（/）下載常春藤皂苷元/肝癌交集基因的PPI數(shù)據(jù)。STRING數(shù)據(jù)庫是一個廣泛使用的蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫，整合了來自實驗驗證、文本挖掘、數(shù)據(jù)庫注釋等多種來源的蛋白質相互作用信息，具有數(shù)據(jù)量大、覆蓋物種廣泛、可靠性高等優(yōu)點。在STRING數(shù)據(jù)庫中，輸入80個交集基因，設置物種為人類（Homosapiens），最低相互作用分數(shù)選擇中等置信度（0.400），以確保篩選出的相互作用具有一定的可信度。經過檢索和篩選，下載得到PPI數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)以文本文件（txt）格式保存，包含了蛋白質節(jié)點和相互作用邊的信息。將從STRING數(shù)據(jù)庫下載的PPI數(shù)據(jù)以txt文檔格式輸入Cytoscape_3.9.0軟件中進行可視化和分析。Cytoscape是一款功能強大的開源軟件平臺，專門用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡和生物通路，并能夠將這些網(wǎng)絡與注釋、基因表達譜和其他狀態(tài)數(shù)據(jù)集成。在Cytoscape軟件中，導入PPI數(shù)據(jù)后，軟件會根據(jù)數(shù)據(jù)中的節(jié)點和邊信息自動繪制PPI網(wǎng)絡。為了進一步分析PPI網(wǎng)絡的拓撲結構，挖掘其中的關鍵信息，使用Cytoscape軟件中的Cytohubba插件進行核心基因分析。Cytohubba插件提供了多種算法來評估節(jié)點在網(wǎng)絡中的重要性，本研究選擇根據(jù)節(jié)點度值（Degree）大小進行篩選。節(jié)點度值表示與該節(jié)點直接相連的邊的數(shù)量，節(jié)點度值越大，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡中與其他節(jié)點的相互作用越頻繁，其在生物過程中的重要性可能越高。通過Cytohubba插件，按照節(jié)點度值從大到小對PPI網(wǎng)絡中的節(jié)點進行排序，篩選出前8個核心基因。這8個核心基因在PPI網(wǎng)絡中處于關鍵位置，可能在常春藤皂苷元抗肝癌作用中發(fā)揮著重要作用。例如，其中某個核心基因可能通過與多個其他基因相互作用，調控細胞增殖、凋亡等生物學過程，從而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。4.2.2基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析是生物信息學中常用的分析方法，用于揭示基因的功能和參與的生物學通路。GO分析能夠從分子功能（MolecularFunction）、細胞組成（CellularComponent）和生物過程（BiologicalProcess）三個層面，對基因進行功能注釋和富集分析。通過GO分析，可以了解基因在細胞內的具體功能，如基因編碼的蛋白質是否具有酶活性、是否參與信號轉導等；以及基因在細胞中的定位，如是否存在于細胞核、細胞質或細胞膜等；還能明確基因參與的生物過程，如細胞增殖、分化、凋亡等。KEGG通路富集分析則主要關注基因參與的生物學通路，KEGG數(shù)據(jù)庫包含了大量的代謝通路、信號轉導通路等信息，通過將基因映射到KEGG通路中，可以發(fā)現(xiàn)基因在哪些生物學通路中顯著富集，從而揭示基因在細胞生理和病理過程中的作用機制。本研究使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery，/）數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。DAVID是一個綜合性的生物信息學數(shù)據(jù)庫和分析工具，整合了多個權威的數(shù)據(jù)庫資源，能夠提供全面、準確的基因注釋和富集分析功能。在DAVID數(shù)據(jù)庫中，將80個常春藤皂苷元/肝癌交集基因作為輸入基因集，物種選擇人類（Homosapiens）。對于GO分析，設置富集閾值為P<0.05，即當某個GOterm的富集P值小于0.05時，認為該GOterm在輸入基因集中顯著富集。對于KEGG通路分析，同樣設置富集閾值為P<0.05。經過分析，DAVID數(shù)據(jù)庫會輸出GO富集分析結果和KEGG通路富集分析結果，結果以表格形式呈現(xiàn)，包含了富集的GOterm或KEGG通路名稱、富集的基因數(shù)量、富集的P值等信息。通過對這些結果的分析，可以深入了解常春藤皂苷元抗肝癌作用相關基因的功能和參與的生物學通路，為進一步探究其作用機制提供線索。例如，如果某個與細胞凋亡相關的GOterm在輸入基因集中顯著富集，說明這些基因可能在常春藤皂苷元誘導肝癌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用；如果某個與腫瘤相關的KEGG通路顯著富集，提示常春藤皂苷元可能通過調控該通路來抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。4.2.3分子對接驗證分子對接是一種基于計算機模擬的技術，用于預測小分子（如藥物分子）與大分子（如蛋白質）之間的相互作用模式和結合親和力。其原理是基于分子間的幾何形狀互補、靜電相互作用、氫鍵相互作用等因素，通過算法搜索小分子在大分子表面的最佳結合位置和取向。在本研究中，分子對接的目的是驗證常春藤皂苷元與篩選出的核心基因編碼的蛋白質之間是否具有相互作用，以及預測它們的結合模式和親和力，為常春藤皂苷元抗肝癌作用機制提供更直接的證據(jù)。本研究使用AutoDockVina軟件進行分子對接。首先，通過PubChem數(shù)據(jù)庫（/）獲取常春藤皂苷元的分子結構，以SDF格式下載。然后，從ProteinDataBank（PDB，/）數(shù)據(jù)庫下載核心基因編碼的蛋白質的3D結構。在下載蛋白質結構時，選擇分辨率較高、結構完整的晶體結構，以提高分子對接的準確性。使用ChemBioOffice軟件中的ChemBio3D繪圖模塊對常春藤皂苷元的藥物結構進行力場優(yōu)化，使其結構更接近真實狀態(tài)。同時，使用AutoDockVina軟件的輔助工具MGLTools1.5.6對蛋白質進行處理，包括去除水分子、添加氫原子、計算電荷等操作，將原始的蛋白pdb文件格式轉換為AutoDockVina程序認可的pdbqt格式。在AutoDockVina軟件中，進行分子對接時需要合理設置對接參數(shù)。設置對接的網(wǎng)格盒子大小和中心位置，使其能夠完全覆蓋蛋白質的活性位點。對于能量計算，選擇默認的評分函數(shù)，該評分函數(shù)綜合考慮了分子間的范德華力、靜電相互作用等因素，能夠較為準確地評估小分子與蛋白質的結合親和力。對接完成后，軟件會輸出對接結果，包括常春藤皂苷元與蛋白質的結合模式、結合能等信息。結合能是衡量小分子與蛋白質結合穩(wěn)定性的重要指標，結合能越低，說明兩者的結合越穩(wěn)定。通過分析對接結果，可以確定常春藤皂苷元與核心基因編碼蛋白質的最佳結合位點和結合模式，進一步深入探討常春藤皂苷元抗肝癌的分子機制。例如，如果常春藤皂苷元能夠與某個核心基因編碼的蛋白質以較低的結合能緊密結合，且結合位點位于蛋白質的活性中心，那么可以推測常春藤皂苷元可能通過與該蛋白質相互作用，調節(jié)其生物學功能，從而發(fā)揮抗肝癌作用。4.3分析結果與討論4.3.1PPI網(wǎng)絡及核心基因分析結果利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構建的PPI網(wǎng)絡，清晰展示了常春藤皂苷元/肝癌交集基因之間的相互作用關系。在該PPI網(wǎng)絡中，節(jié)點代表蛋白質（基因），節(jié)點之間的連線代表蛋白質之間的相互作用。通過Cytohubba插件篩選出的8個核心基因，在網(wǎng)絡中處于高度連接的關鍵位置。這8個核心基因分別為AKT1、MAPK1、TP53、EGFR、PTGS2、IL6、ESR1和AR。AKT1是PI3K/AKT信號通路的關鍵蛋白，該信號通路在細胞增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤細胞中，PI3K/AKT信號通路常常被異常激活，導致細胞的無限增殖和抗凋亡能力增強。常春藤皂苷元可能通過作用于AKT1，抑制PI3K/AKT信號通路的活性，從而抑制肝癌細胞的增殖和存活。有研究表明，某些天然產物能夠通過抑制AKT1的磷酸化，阻斷PI3K/AKT信號通路，進而誘導腫瘤細胞凋亡。MAPK1是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員之一，MAPK信號通路參與細胞的生長、分化、凋亡等多種生物學過程。在肝癌中，MAPK信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移等密切相關。常春藤皂苷元可能通過調節(jié)MAPK1的活性，影響MAPK信號通路的傳導，從而發(fā)揮抗肝癌作用。例如，有研究報道某化合物能夠抑制MAPK1的表達，阻斷MAPK信號通路，抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。TP53是一種重要的抑癌基因，其編碼的p53蛋白在細胞周期調控、DNA損傷修復、細胞凋亡等過程中發(fā)揮著關鍵作用。在肝癌中，TP53基因常常發(fā)生突變或缺失，導致p53蛋白功能喪失，使得腫瘤細胞逃避細胞凋亡，促進腫瘤的發(fā)展。常春藤皂苷元可能通過調節(jié)TP53基因的表達或p53蛋白的活性，恢復其抑癌功能，誘導肝癌細胞凋亡。已有研究表明，一些藥物能夠通過穩(wěn)定p53蛋白，激活其下游的凋亡相關基因，從而誘導腫瘤細胞凋亡。EGFR是表皮生長因子受體，其信號通路在細胞的增殖、分化、遷移等過程中起著重要作用。在肝癌中，EGFR的過表達或激活與腫瘤的生長、侵襲和轉移密切相關。常春藤皂苷元可能通過與EGFR結合，抑制其酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR信號通路，從而抑制肝癌細胞的增殖和遷移。例如，一些EGFR抑制劑已經被應用于臨床腫瘤治療，通過抑制EGFR信號通路，取得了一定的治療效果。PTGS2（COX-2）是前列腺素內過氧化物合酶2，參與前列腺素的合成。在腫瘤組織中，PTGS2常常高表達，促進腫瘤細胞的增殖、血管生成和免疫逃逸。常春藤皂苷元可能通過抑制PTGS2的活性，減少前列腺素的合成，從而抑制肝癌細胞的生長和轉移。有研究表明，抑制PTGS2的表達或活性能夠降低腫瘤細胞的增殖能力，誘導細胞凋亡。IL6是一種重要的細胞因子，參與炎癥反應、免疫調節(jié)等過程。在肝癌中，IL6的高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和預后不良密切相關。常春藤皂苷元可能通過抑制IL6的表達或阻斷其信號通路，抑制肝癌細胞的增殖和遷移，同時調節(jié)機體的免疫功能，增強對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。例如，有研究報道某藥物能夠抑制IL6的分泌，降低其下游信號分子的磷酸化水平，從而抑制