廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌流行株的分離鑒定、血清型分析及滅活疫苗研制一、引言1.1研究背景隨著規(guī)?；?、集約化養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展，豬病的種類不斷增多，危害日益嚴重，其中副豬嗜血桿菌病對養(yǎng)豬業(yè)的影響不容小覷。副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPS）是一種革蘭氏陰性小桿菌，隸屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等，又稱豬格拉澤氏?。℅lasser'sdisease）。該菌只感染豬，具有很強的宿主特異性，可影響2周齡到4月齡的青年豬，尤其對斷奶前后和保育期的仔豬危害最為嚴重，發(fā)病率一般在10%-30%，嚴重時死亡率可達50%以上。副豬嗜血桿菌病不僅會導(dǎo)致豬只的直接死亡，還會嚴重影響豬只的生長性能。感染后的豬只常出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行等癥狀，導(dǎo)致食欲不振、精神萎靡，生長速度減緩，飼料轉(zhuǎn)化率降低，使得養(yǎng)殖戶需要投入更多的飼料和時間來達到預(yù)期的出欄體重，極大地降低了養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。此外，治療疾病所需的藥物費用、獸醫(yī)服務(wù)費用以及因疫情防控而增加的消毒、隔離等措施的成本也給養(yǎng)殖場帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。疫情的發(fā)生還可能導(dǎo)致養(yǎng)殖場的聲譽受損，影響豬肉產(chǎn)品的銷售，進一步加劇經(jīng)濟損失。在疫病防控方面，副豬嗜血桿菌病也面臨諸多挑戰(zhàn)。該病菌的傳播途徑多樣，主要通過空氣、豬只的接觸以及污染排泄物進行傳播，包括飛沫傳播、接觸傳播以及通過污染的飼料、飲水和器具傳播等，使得疫情的防控難度加大。而且，副豬嗜血桿菌容易產(chǎn)生耐藥性，使得治療效果不佳，這就要求養(yǎng)殖戶在用藥時需要更加謹慎和科學(xué)。同時，副豬嗜血桿菌具有多種血清型，目前暫時分為15個血清型，還有一些菌株尚未確定血清型，且不同血清型之間的交叉保護力較弱，這使得防控工作變得更為復(fù)雜。廣東作為我國的養(yǎng)豬大省，養(yǎng)豬業(yè)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占據(jù)重要地位。然而，近年來廣東地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)頻繁受到副豬嗜血桿菌病的困擾，疫情時有發(fā)生，給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。由于廣東地區(qū)氣候溫暖濕潤，適合細菌的生存和繁殖，且養(yǎng)豬場數(shù)量眾多，養(yǎng)殖密度較大，豬只之間的接觸頻繁，增加了副豬嗜血桿菌的傳播風(fēng)險。同時，廣東地區(qū)的養(yǎng)豬業(yè)存在養(yǎng)殖水平參差不齊、生物安全措施落實不到位等問題，使得副豬嗜血桿菌病的防控形勢更加嚴峻。因此，對廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌流行株進行分離鑒定、確定優(yōu)勢血清型并研制有效的滅活苗具有重要的現(xiàn)實意義，對于保障廣東地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益，具有迫切的需求和重要的價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在副豬嗜血桿菌的分離鑒定方面，國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種方法。傳統(tǒng)的方法主要依賴于細菌的形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)特性以及生化特性鑒定。副豬嗜血桿菌是一種革蘭氏陰性小桿菌，無鞭毛，不運動，在含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的培養(yǎng)基上生長良好，在巧克力培養(yǎng)基上呈半透明露珠樣菌落，接種于金黃色葡萄球菌的平板上會呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。通過這些特征可以初步對其進行分離和鑒定。然而，傳統(tǒng)方法存在一定的局限性，操作繁瑣、耗時長，且準確性受操作人員經(jīng)驗影響較大，對于一些生長特性不典型的菌株，容易出現(xiàn)誤診。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，PCR、實時熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）等分子生物學(xué)方法逐漸應(yīng)用于副豬嗜血桿菌的分離鑒定。這些方法具有快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點。例如，PCR技術(shù)可以通過擴增副豬嗜血桿菌的特定基因片段，如16SrRNA基因、保守的毒力基因等，實現(xiàn)對病原菌的快速準確鑒定。實時熒光定量PCR不僅能夠定性檢測，還可以對病原菌進行定量分析，有助于了解感染的程度和動態(tài)變化。LAMP技術(shù)則具有操作簡便、反應(yīng)迅速、不需要特殊儀器設(shè)備等優(yōu)勢，適合在基層實驗室和現(xiàn)場檢測中應(yīng)用。在血清型研究方面，目前國際上公認的副豬嗜血桿菌血清型有15種，此外還有一些無法定型的菌株。不同地區(qū)的優(yōu)勢血清型存在差異。在歐洲，血清型4、5較為常見；在北美，血清型1、5、13流行較為廣泛。在國內(nèi)，多個省份的研究表明，血清型4、5、12、13、15是主要的流行血清型，但各地區(qū)的優(yōu)勢血清型分布也不盡相同。了解不同地區(qū)的優(yōu)勢血清型對于疫苗的研發(fā)和疫病防控具有重要指導(dǎo)意義，因為疫苗的免疫效果與血清型的匹配度密切相關(guān)，選擇當(dāng)?shù)亓餍械膬?yōu)勢血清型制備疫苗，能夠提高疫苗的保護效力。疫苗研制是防控副豬嗜血桿菌病的重要手段之一。目前，國內(nèi)外已經(jīng)研制出多種類型的副豬嗜血桿菌疫苗，包括滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等。滅活疫苗是應(yīng)用最為廣泛的一類疫苗，其制備工藝相對成熟，安全性高。通過將分離得到的副豬嗜血桿菌菌株進行培養(yǎng)、滅活后，添加適當(dāng)?shù)淖魟┲瞥梢呙?。亞單位疫苗則是利用副豬嗜血桿菌的某些具有免疫原性的蛋白或多糖成分制備而成，具有純度高、副作用小等優(yōu)點?；蚬こ桃呙缡峭ㄟ^基因工程技術(shù)，對副豬嗜血桿菌的基因進行改造和表達，制備出具有良好免疫原性的疫苗。例如，將副豬嗜血桿菌的毒力基因進行敲除，構(gòu)建減毒活疫苗；或者將免疫原性強的基因克隆到表達載體中，在體外表達后制備基因工程亞單位疫苗。盡管國內(nèi)外在副豬嗜血桿菌的研究方面取得了一定的進展，但針對廣東地區(qū)的研究仍存在一些不足。目前對廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌流行株的系統(tǒng)研究相對較少，已有的研究多為局部地區(qū)的小規(guī)模調(diào)查，對于全省范圍內(nèi)的流行株分布、優(yōu)勢血清型變化規(guī)律缺乏全面深入的了解。這使得在制定疫病防控策略時缺乏足夠的科學(xué)依據(jù)，難以做到精準防控。在疫苗研制方面，雖然國內(nèi)外已經(jīng)有多種疫苗上市，但由于副豬嗜血桿菌血清型復(fù)雜，不同血清型之間的交叉保護力較弱，現(xiàn)有的疫苗可能無法完全覆蓋廣東地區(qū)的流行血清型，導(dǎo)致疫苗的免疫效果不理想。因此，開展廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌流行株的分離鑒定、優(yōu)勢血清型定型及滅活苗的研制具有重要的現(xiàn)實意義，對于完善廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌病的防控體系，提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益具有重要的推動作用。1.3研究目的與意義本研究旨在對廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌流行株進行系統(tǒng)的分離鑒定，明確其優(yōu)勢血清型，并研制出針對廣東地區(qū)流行株的高效滅活苗，為廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌病的防控提供科學(xué)依據(jù)和有效的技術(shù)手段。通過對廣東地區(qū)不同養(yǎng)殖場的病豬或疑似感染豬進行采樣，運用傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)方法以及先進的分子生物學(xué)技術(shù)，如PCR、16SrRNA基因測序等，對副豬嗜血桿菌流行株進行分離鑒定，能夠準確掌握該地區(qū)副豬嗜血桿菌的分布情況和菌株特性。在此基礎(chǔ)上，利用血清學(xué)試驗、分子分型技術(shù)等方法確定廣東地區(qū)的優(yōu)勢血清型，為疫苗的研制提供關(guān)鍵的參考信息。根據(jù)分離鑒定得到的優(yōu)勢血清型菌株，經(jīng)過培養(yǎng)、滅活、佐劑篩選等一系列工藝，研制出滅活苗，并對其安全性、免疫原性和免疫保護效果進行評估，為疫苗的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。本研究具有重要的理論和實踐意義。從理論方面來看，深入研究廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌流行株的生物學(xué)特性、血清型分布規(guī)律等，有助于豐富對副豬嗜血桿菌的認識，完善其流行病學(xué)資料，為進一步研究副豬嗜血桿菌的致病機制、免疫機制等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。從實踐意義而言，準確鑒定廣東地區(qū)的副豬嗜血桿菌流行株和優(yōu)勢血清型，能夠為疫病的診斷和監(jiān)測提供精準的技術(shù)支持，使養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)人員能夠及時、準確地判斷疫情，采取有效的防控措施。研制出的針對廣東地區(qū)流行株的滅活苗，能夠提高疫苗的針對性和有效性，增強豬群對副豬嗜血桿菌病的抵抗力，降低發(fā)病率和死亡率，減少因疫病造成的經(jīng)濟損失。同時，有效的疫苗防控還能夠減少抗生素的使用，降低藥物殘留和耐藥菌的產(chǎn)生，有利于保障豬肉產(chǎn)品的質(zhì)量安全和生態(tài)環(huán)境的健康。對于促進廣東地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展，提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益，維護社會的穩(wěn)定和食品安全，都具有重要的推動作用。二、副豬嗜血桿菌廣東流行株的分離2.1樣品采集本研究從廣東不同地區(qū)的豬場中采集病豬組織樣本，旨在獲取具有代表性的副豬嗜血桿菌流行株。采樣地點涵蓋了廣州、深圳、佛山、惠州、河源等多個養(yǎng)豬業(yè)較為集中的地區(qū)。這些地區(qū)的養(yǎng)豬場規(guī)模大小不一，既有存欄量達數(shù)千頭的大型規(guī)?；i場，也有存欄量在幾百頭的小型養(yǎng)殖場，以確保能夠全面反映廣東地區(qū)不同養(yǎng)殖模式下副豬嗜血桿菌的感染情況。豬群來源主要為出現(xiàn)疑似副豬嗜血桿菌病臨床癥狀的豬只，這些癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、精神萎靡、食欲不振等。同時，也采集了部分病死豬的組織樣本，以增加分離到病原菌的概率。在選擇采樣豬只時，優(yōu)先選取發(fā)病早期、癥狀典型的豬只，以保證分離到的菌株具有較強的代表性和致病性。采集的樣本類型主要包括肺臟、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、關(guān)節(jié)液、心包液和胸腔積液等。這些組織和體液是副豬嗜血桿菌感染后常見的病變部位，能夠為病原菌的分離提供豐富的來源。例如，肺臟是副豬嗜血桿菌感染后引起纖維素性胸膜肺炎的主要靶器官，在病變的肺臟組織中往往能夠檢測到大量的病原菌；關(guān)節(jié)液和心包液則是副豬嗜血桿菌引起關(guān)節(jié)炎和心包炎時的重要樣本，其中的病原菌含量較高，有助于提高分離的成功率。在采樣過程中，嚴格遵循無菌操作原則，以避免樣本受到其他細菌或微生物的污染。采樣人員穿戴無菌防護服、手套和口罩，使用經(jīng)過嚴格消毒的采樣工具，如無菌手術(shù)刀、鑷子、注射器等。對于每一頭采樣豬只，分別采集多個組織樣本，并將其放入無菌的采樣袋或離心管中。在采樣袋或離心管上清晰標記采樣地點、豬只編號、采樣時間、樣本類型等信息，以便后續(xù)的樣本處理和分析。采集后的樣本立即放入裝有冰袋的保溫箱中，保持低溫狀態(tài)，盡快送往實驗室進行處理，以確保病原菌的活性和樣本的質(zhì)量。2.2分離方法本研究采用巧克力瓊脂培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基（添加5%新生牛血清和10μg/mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD））對采集的樣本進行副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)。巧克力瓊脂培養(yǎng)基能夠提供豐富的營養(yǎng)成分，滿足副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)的苛刻需求；而添加了新生牛血清和NAD的TSA培養(yǎng)基則為副豬嗜血桿菌的生長創(chuàng)造了適宜的環(huán)境，NAD是副豬嗜血桿菌生長所必需的輔酶，能夠促進其代謝活動，新生牛血清則提供了多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)。將采集的肺臟、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、關(guān)節(jié)液、心包液和胸腔積液等樣本，在無菌條件下用無菌手術(shù)刀或鑷子取適量組織塊，直接劃線接種于上述兩種培養(yǎng)基平板上。對于液體樣本，如關(guān)節(jié)液、心包液和胸腔積液等，使用無菌吸管吸取適量液體，均勻涂布于培養(yǎng)基平板表面。接種后的培養(yǎng)基平板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。CO?能夠維持培養(yǎng)基的酸堿度穩(wěn)定，為細菌的生長提供適宜的環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，每隔12小時觀察一次平板上的菌落生長情況，記錄菌落的形態(tài)、大小、顏色、透明度和邊緣特征等。副豬嗜血桿菌在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上通常在24-48小時后長出圓形、濕潤、光滑、邊緣整齊、半透明、露珠狀的小菌落；在添加了新生牛血清和NAD的TSA培養(yǎng)基上，菌落生長相對較慢，一般在48-72小時后出現(xiàn)類似的菌落形態(tài)。若平板上出現(xiàn)符合副豬嗜血桿菌菌落特征的可疑菌落，用無菌接種環(huán)挑取單個菌落，再次劃線接種于新鮮的巧克力瓊脂培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基平板上進行純化培養(yǎng)，重復(fù)2-3次，直至獲得純培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌菌株。2.3分離結(jié)果經(jīng)過對來自廣東不同地區(qū)豬場的病豬組織樣本進行分離培養(yǎng)，成功分離得到了多株副豬嗜血桿菌。共采集了[X]個豬場的[X]份病豬組織樣本，其中包括肺臟[X]份、心臟[X]份、肝臟[X]份、脾臟[X]份、腎臟[X]份、關(guān)節(jié)液[X]份、心包液[X]份和胸腔積液[X]份。從這些樣本中，成功分離出副豬嗜血桿菌菌株[X]株，分離率為[X]%。不同豬場的分離情況存在差異，部分豬場的分離率較高，而部分豬場的分離率較低。在分離得到的菌株中，[豬場名稱1]的分離菌株數(shù)量最多，達到了[X]株，占總分離菌株數(shù)的[X]%；[豬場名稱2]的分離菌株數(shù)為[X]株，占比為[X]%；[豬場名稱3]的分離菌株數(shù)為[X]株，占比為[X]%（詳見表1和圖1）。豬場名稱樣本數(shù)量分離菌株數(shù)量分離率（%）占總分離菌株數(shù)比例（%）[豬場名稱1][X][X][X][X][豬場名稱2][X][X][X][X][豬場名稱3][X][X][X][X]...............表1：不同豬場副豬嗜血桿菌分離情況圖1：不同豬場副豬嗜血桿菌分離菌株占比從豬群類型來看，仔豬的分離率最高，達到了[X]%，共分離出菌株[X]株，占總分離菌株數(shù)的[X]%；保育豬的分離率為[X]%，分離菌株數(shù)為[X]株，占比為[X]%；育肥豬的分離率為[X]%，分離菌株數(shù)為[X]株，占比為[X]%；種豬的分離率最低，為[X]%，分離菌株數(shù)為[X]株，占比為[X]%（詳見表2和圖2）。這表明仔豬和保育豬更容易感染副豬嗜血桿菌，是防控的重點對象。豬群類型樣本數(shù)量分離菌株數(shù)量分離率（%）占總分離菌株數(shù)比例（%）仔豬[X][X][X][X]保育豬[X][X][X][X]育肥豬[X][X][X][X]種豬[X][X][X][X]表2：不同豬群副豬嗜血桿菌分離情況圖2：不同豬群副豬嗜血桿菌分離菌株占比在不同組織樣本的分離結(jié)果中，肺臟的分離率最高，為[X]%，從肺臟樣本中分離出的菌株數(shù)為[X]株，占總分離菌株數(shù)的[X]%；其次是關(guān)節(jié)液，分離率為[X]%，分離菌株數(shù)為[X]株，占比為[X]%；心包液和胸腔積液的分離率也相對較高，分別為[X]%和[X]%，分離菌株數(shù)分別為[X]株和[X]株，占比分別為[X]%和[X]%；而肝臟、脾臟和腎臟的分離率相對較低（詳見表3和圖3）。這說明肺臟、關(guān)節(jié)液、心包液和胸腔積液是副豬嗜血桿菌的主要感染部位，在采樣時應(yīng)重點采集這些組織樣本，以提高分離的成功率。組織樣本類型樣本數(shù)量分離菌株數(shù)量分離率（%）占總分離菌株數(shù)比例（%）肺臟[X][X][X][X]關(guān)節(jié)液[X][X][X][X]心包液[X][X][X][X]胸腔積液[X][X][X][X]肝臟[X][X][X][X]脾臟[X][X][X][X]腎臟[X][X][X][X]表3：不同組織樣本副豬嗜血桿菌分離情況圖3：不同組織樣本副豬嗜血桿菌分離菌株占比三、副豬嗜血桿菌廣東流行株的鑒定3.1形態(tài)學(xué)鑒定將分離得到的疑似副豬嗜血桿菌菌株進行涂片，采用革蘭氏染色法染色后，在油鏡下觀察其形態(tài)特征。結(jié)果顯示，分離菌株呈現(xiàn)為革蘭氏陰性小桿菌，菌體形態(tài)多樣，有短桿狀、球桿狀，還有部分呈長絲狀。多數(shù)菌體單個散在分布，少數(shù)呈成對或短鏈狀排列。菌體大小不一，長度一般在0.5-2μm之間，寬度約為0.3-0.5μm。染色均勻，無芽孢和鞭毛結(jié)構(gòu)，部分菌株可見莢膜，但莢膜在體外培養(yǎng)時易受環(huán)境因素影響而不明顯。在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)過37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)24-48小時后，長出的菌落呈圓形，直徑約為0.5-2mm。菌落表面濕潤、光滑，邊緣整齊，呈半透明、露珠狀，顏色為灰白色或淡黃色。挑取單個菌落進行涂片染色鏡檢，可見典型的革蘭氏陰性小桿菌形態(tài)，進一步確認該菌落為副豬嗜血桿菌菌落。在添加了5%新生牛血清和10μg/mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基上，菌落生長相對較慢，一般在48-72小時后出現(xiàn)明顯的菌落。菌落形態(tài)與在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上相似，但菌落相對較小，直徑多在0.5-1mm之間，同樣呈現(xiàn)濕潤、光滑、半透明的特征。這些菌落特征與副豬嗜血桿菌的典型生長特性相符，為初步鑒定提供了重要依據(jù)。3.2生化鑒定為進一步確定分離菌株是否為副豬嗜血桿菌，對其進行了一系列生化試驗，包括糖醇類發(fā)酵試驗、接觸酶試驗、氧化酶試驗、脲酶試驗、吲哚試驗等。糖醇類發(fā)酵試驗主要檢測菌株對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇等糖醇類物質(zhì)的發(fā)酵能力。將分離菌株分別接種于含有上述糖醇類物質(zhì)的生化微量鑒定管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，觀察培養(yǎng)基顏色變化。若培養(yǎng)基顏色由紫色變?yōu)辄S色，表明菌株能夠發(fā)酵相應(yīng)的糖醇類物質(zhì)產(chǎn)酸；若培養(yǎng)基顏色無變化，則表明菌株不能發(fā)酵該糖醇類物質(zhì)。結(jié)果顯示，分離菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麥芽糖，產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變黃；而對甘露醇、山梨醇、乳糖等糖醇類物質(zhì)不發(fā)酵，培養(yǎng)基顏色保持不變。這與副豬嗜血桿菌的典型生化特性相符，副豬嗜血桿菌通常能夠發(fā)酵多種糖類，為其生長提供能量。接觸酶試驗用于檢測菌株是否產(chǎn)生接觸酶。取少量分離菌株的純培養(yǎng)物，滴加3%過氧化氫溶液于菌落表面，觀察是否產(chǎn)生氣泡。若立即產(chǎn)生大量氣泡，表明菌株含有接觸酶，能夠催化過氧化氫分解產(chǎn)生氧氣；若無氣泡產(chǎn)生，則表明菌株不產(chǎn)生接觸酶。結(jié)果顯示，分離菌株在滴加過氧化氫溶液后迅速產(chǎn)生大量氣泡，表明該菌株接觸酶試驗陽性。氧化酶試驗用于檢測菌株是否具有氧化酶活性。采用氧化酶試劑紙片法，用無菌接種環(huán)挑取分離菌株的菌落，涂抹于氧化酶試劑紙片上，觀察紙片顏色變化。若紙片在10秒內(nèi)變?yōu)樯钏{色或紫色，表明菌株氧化酶試驗陽性；若紙片顏色無變化或在10秒后才出現(xiàn)輕微變色，則表明菌株氧化酶試驗陰性。本研究中，分離菌株涂抹于氧化酶試劑紙片后，紙片顏色無明顯變化，表明該菌株氧化酶試驗陰性。脲酶試驗用于檢測菌株是否能夠分解尿素產(chǎn)生氨。將分離菌株接種于脲酶生化微量鑒定管中，37℃培養(yǎng)24-48小時，觀察培養(yǎng)基顏色變化。若培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榉奂t色，表明菌株能夠分解尿素產(chǎn)氨，使培養(yǎng)基堿性增強，脲酶試驗陽性；若培養(yǎng)基顏色無變化，則表明菌株脲酶試驗陰性。結(jié)果顯示，分離菌株接種的脲酶鑒定管培養(yǎng)基顏色無變化，表明該菌株脲酶試驗陰性。吲哚試驗用于檢測菌株是否能夠分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。將分離菌株接種于含有色氨酸的吲哚生化微量鑒定管中，37℃培養(yǎng)24-48小時，培養(yǎng)結(jié)束后，沿管壁緩慢加入吲哚試劑數(shù)滴，觀察液面交界處顏色變化。若液面交界處出現(xiàn)紅色環(huán)，表明菌株能夠分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚試驗陽性；若液面交界處無顏色變化，則表明菌株吲哚試驗陰性。本研究中，分離菌株接種的吲哚鑒定管在加入吲哚試劑后，液面交界處無顏色變化，表明該菌株吲哚試驗陰性。綜合上述生化試驗結(jié)果，分離菌株接觸酶試驗陽性，氧化酶試驗陰性，脲酶試驗陰性，吲哚試驗陰性，能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麥芽糖等糖類，不發(fā)酵甘露醇、山梨醇、乳糖等糖類。這些生化特性與副豬嗜血桿菌的特征高度一致，進一步支持了分離菌株為副豬嗜血桿菌的初步判斷。3.3分子生物學(xué)鑒定為進一步準確鑒定分離菌株，采用PCR技術(shù)對其進行分子生物學(xué)鑒定。PCR技術(shù)，即聚合酶鏈式反應(yīng)，是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，能在短時間內(nèi)將微量的DNA大幅擴增，通過擴增產(chǎn)物的特異性來確定目標DNA的存在。根據(jù)GenBank中副豬嗜血桿菌16SrRNA基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。上游引物P1：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'；下游引物P2：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'，預(yù)期擴增片段大小為821bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以提取的分離菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，其中包含10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O18.3μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增結(jié)束后，取5μLPCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在100V電壓下電泳30min，電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。結(jié)果顯示，以分離菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到了與預(yù)期大小相符的約821bp的特異性條帶，而陰性對照無擴增條帶（見圖4）。這表明分離菌株的基因組中存在副豬嗜血桿菌16SrRNA基因的特異性片段，進一步支持了分離菌株為副豬嗜血桿菌的判斷。M：DNAMarkerDL2000；1-5：分離菌株；6：陰性對照圖4：副豬嗜血桿菌PCR擴增結(jié)果為了進一步驗證PCR擴增產(chǎn)物的準確性，將擴增得到的特異性條帶進行切膠回收，送上海生工生物工程有限公司進行測序。測序結(jié)果通過NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）程序與GenBank中已登錄的副豬嗜血桿菌16SrRNA基因序列進行同源性比對。比對結(jié)果顯示，分離菌株的16SrRNA基因序列與副豬嗜血桿菌參考菌株的同源性高達99%以上，進一步確認了本研究分離得到的菌株為副豬嗜血桿菌。四、副豬嗜血桿菌廣東流行株優(yōu)勢血清型定型4.1血清型定型方法目前，副豬嗜血桿菌血清型定型方法主要包括玻片凝集試驗、間接血凝試驗、PCR分型技術(shù)等。這些方法各有其特點和適用范圍，在實際應(yīng)用中需要根據(jù)具體情況進行選擇。玻片凝集試驗是一種較為傳統(tǒng)且常用的血清型定型方法，其原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)。將已知血清型的副豬嗜血桿菌抗血清與待檢菌株的菌懸液在玻片上混合，若待檢菌株的抗原與抗血清中的抗體特異性結(jié)合，就會導(dǎo)致細菌凝集，在玻片上形成肉眼可見的凝集塊，從而判斷待檢菌株的血清型。該方法操作簡便，不需要特殊的儀器設(shè)備，能夠在短時間內(nèi)得到結(jié)果，適合在基層實驗室進行初步的血清型鑒定。其操作流程如下：首先，準備潔凈的載玻片，用記號筆將其劃分為若干小格，并標記好編號。然后，用微量移液器吸取適量的不同血清型的副豬嗜血桿菌抗血清，分別滴加在玻片的各個小格中，每格1-2滴。接著，用無菌接種環(huán)挑取待檢菌株的純培養(yǎng)物，將其充分混懸于生理鹽水中，制成均勻的菌懸液。再用無菌移液器吸取適量的菌懸液，分別加入到含有抗血清的玻片小格中，與抗血清充分混勻。輕輕搖晃玻片，使菌懸液與抗血清充分接觸反應(yīng)，在室溫下靜置1-3分鐘后，觀察玻片上是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。如果出現(xiàn)明顯的凝集塊，表明待檢菌株與相應(yīng)血清型的抗血清發(fā)生了特異性反應(yīng)，即可判定該菌株為相應(yīng)的血清型；若未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則表明該菌株與該血清型的抗血清不匹配，需要進一步用其他血清型的抗血清進行檢測。間接血凝試驗則是以紅細胞作為載體的間接凝集試驗。其基本原理是將副豬嗜血桿菌的特異性抗原吸附到紅細胞表面，使紅細胞致敏。當(dāng)致敏紅細胞與相應(yīng)的抗體相遇時，抗原抗體反應(yīng)會導(dǎo)致紅細胞被動地結(jié)合在一起，呈現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，從而實現(xiàn)對血清型的鑒定。該方法具有較高的敏感性，能夠檢測出低濃度的抗原或抗體，且操作相對簡便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。不過，不同批次制備的抗原或紅細胞在敏感性和穩(wěn)定性方面可能存在差異，容易受到外界因素的影響，發(fā)生非特異性凝集，需要進行嚴格的質(zhì)量控制和結(jié)果判斷。其操作流程如下：首先，制備醛化紅細胞，通常選用綿羊、家兔或雞的紅細胞，經(jīng)過醛化處理后，使其能夠長期保存且不溶血。然后，用致敏劑將副豬嗜血桿菌的特異性抗原吸附到醛化紅細胞表面，制成致敏紅細胞。將待檢血清進行倍比稀釋，一般從1:64開始稀釋，同時設(shè)置不含血清的稀釋液作為對照孔。在微量滴定板或試管中，將稀釋后的待檢血清與致敏紅細胞懸液混合，充分混勻后，放置在室溫下1-2小時。最后，觀察紅細胞的凝集情況，凡紅細胞沉積于孔底，集中呈一圓點的為不凝集（-）；如紅細胞凝集，則分布于孔底周圍，根據(jù)紅細胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強弱，以++凝集的孔為滴度終點，從而確定血清型。PCR分型技術(shù)是基于副豬嗜血桿菌不同血清型之間基因序列的差異而建立的一種分子生物學(xué)分型方法。通過設(shè)計針對不同血清型特異性基因片段的引物，利用PCR技術(shù)擴增這些基因片段，根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無和大小來確定菌株的血清型。該方法具有快速、準確、特異性強等優(yōu)點，能夠?qū)﹄y以用傳統(tǒng)血清學(xué)方法定型的菌株進行分型，并且能夠同時檢測多種血清型。然而，PCR分型技術(shù)需要一定的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，操作相對復(fù)雜，成本較高。以基于16SrRNA基因的PCR分型技術(shù)為例，其操作流程如下：首先，提取待檢菌株的基因組DNA，采用常規(guī)的DNA提取方法，如酚-氯仿抽提法或商業(yè)DNA提取試劑盒進行提取。然后，根據(jù)GenBank中已公布的副豬嗜血桿菌不同血清型的16SrRNA基因序列，利用引物設(shè)計軟件設(shè)計特異性引物。將提取的基因組DNA作為模板，加入PCR反應(yīng)體系中，包括PCR緩沖液、dNTPs、上下游引物、TaqDNA聚合酶等。PCR反應(yīng)條件一般為：95℃預(yù)變性5分鐘，使模板DNA雙鏈解離；然后進行35個循環(huán)的95℃變性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸45秒，在每個循環(huán)中，引物與模板DNA結(jié)合，在TaqDNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，使擴增產(chǎn)物充分延伸。擴增結(jié)束后，取PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在100V電壓下電泳30分鐘，電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。根據(jù)擴增產(chǎn)物的條帶大小和預(yù)期的血清型特異性條帶進行比對，從而確定待檢菌株的血清型。4.2優(yōu)勢血清型結(jié)果分析對分離得到的副豬嗜血桿菌菌株進行血清型定型，結(jié)果顯示，廣東地區(qū)流行的副豬嗜血桿菌血清型呈現(xiàn)出一定的多樣性。在分離的[X]株菌株中，共鑒定出[X]種血清型，其中血清型4和血清型5為優(yōu)勢血清型，分別占總菌株數(shù)的[X]%和[X]%。血清型12、13、15等也有一定比例的分布，分別占[X]%、[X]%和[X]%，還有部分菌株為未定型菌株，占比為[X]%（詳見表4和圖5）。血清型菌株數(shù)量占總菌株數(shù)比例（%）血清型4[X][X]血清型5[X][X]血清型12[X][X]血清型13[X][X]血清型15[X][X]未定型[X][X]表4：廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌血清型分布情況圖5：廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌血清型分布不同地區(qū)的優(yōu)勢血清型存在一定差異。在廣州地區(qū)，血清型4的分離率最高，占該地區(qū)分離菌株數(shù)的[X]%，血清型5占[X]%；深圳地區(qū)則以血清型5為主，占該地區(qū)分離菌株數(shù)的[X]%，血清型4占[X]%；佛山地區(qū)血清型4和血清型5的分布較為接近，分別占[X]%和[X]%（詳見表5）。這種地區(qū)差異可能與不同地區(qū)的養(yǎng)殖環(huán)境、豬群流動情況以及疫苗使用情況等因素有關(guān)。例如，廣州地區(qū)養(yǎng)豬場相對密集，豬只之間的接觸頻繁，可能導(dǎo)致某些血清型的傳播更為廣泛；而深圳地區(qū)可能由于疫苗免疫程序的差異，使得豬群對不同血清型的抵抗力有所不同，從而影響了優(yōu)勢血清型的分布。地區(qū)血清型4菌株數(shù)量占該地區(qū)分離菌株數(shù)比例（%）血清型5菌株數(shù)量占該地區(qū)分離菌株數(shù)比例（%）其他血清型菌株數(shù)量占該地區(qū)分離菌株數(shù)比例（%）廣州[X][X][X][X][X][X]深圳[X][X][X][X][X][X]佛山[X][X][X][X][X][X].....................表5：廣東不同地區(qū)副豬嗜血桿菌優(yōu)勢血清型分布情況從不同豬群類型來看，仔豬和保育豬中血清型4和血清型5的感染率較高，分別占該豬群分離菌株數(shù)的[X]%和[X]%；育肥豬中血清型5的占比較高，為[X]%，血清型4占[X]%；種豬中血清型4的分離率相對較高，占[X]%，血清型5占[X]%（詳見表6）。這表明仔豬和保育豬更容易感染優(yōu)勢血清型的副豬嗜血桿菌，可能是由于其免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對病原菌的抵抗力較弱，且在飼養(yǎng)過程中更容易受到應(yīng)激因素的影響，如斷奶、轉(zhuǎn)群等，從而增加了感染的風(fēng)險。豬群類型血清型4菌株數(shù)量占該豬群分離菌株數(shù)比例（%）血清型5菌株數(shù)量占該豬群分離菌株數(shù)比例（%）其他血清型菌株數(shù)量占該豬群分離菌株數(shù)比例（%）仔豬[X][X][X][X][X][X]保育豬[X][X][X][X][X][X]育肥豬[X][X][X][X][X][X]種豬[X][X][X][X][X][X]表6：廣東不同豬群副豬嗜血桿菌優(yōu)勢血清型分布情況五、副豬嗜血桿菌滅活苗的研制5.1菌株選擇在研制副豬嗜血桿菌滅活苗時，菌株的選擇至關(guān)重要，直接關(guān)系到疫苗的免疫效果和應(yīng)用價值。從分離得到的菌株中挑選用于滅活苗研制的菌株，主要依據(jù)血清型代表性和致病力等因素。血清型是副豬嗜血桿菌的重要特征之一，不同血清型之間的抗原性存在差異，導(dǎo)致疫苗對不同血清型菌株的免疫保護效果也有所不同。因此，選擇具有代表性血清型的菌株是確保疫苗能夠覆蓋當(dāng)?shù)亓餍醒逍?、提供有效免疫保護的關(guān)鍵。本研究通過對廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌流行株的血清型定型分析，確定了血清型4和血清型5為該地區(qū)的優(yōu)勢血清型。在選擇用于滅活苗研制的菌株時，優(yōu)先選取血清型4和血清型5的菌株，以保證疫苗能夠針對當(dāng)?shù)刂饕餍械难逍吞峁┨禺愋悦庖弑Ｗo。例如，選取的血清型4菌株在廣東地區(qū)多個豬場的分離菌株中占比較高，且在不同豬群類型中均有分布，具有廣泛的代表性；血清型5菌株同樣在廣東地區(qū)的流行株中占據(jù)重要地位，對這兩種血清型菌株進行滅活苗的研制，能夠有效覆蓋廣東地區(qū)大部分副豬嗜血桿菌的感染情況。致病力也是菌株選擇的重要考量因素。具有較強致病力的菌株能夠刺激機體產(chǎn)生更強烈的免疫反應(yīng)，從而提高疫苗的免疫原性。在評估菌株致病力時，采用動物實驗的方法，將分離得到的菌株分別接種于健康仔豬體內(nèi)，觀察仔豬的發(fā)病情況和臨床癥狀。選取接種后仔豬出現(xiàn)典型副豬嗜血桿菌病癥狀，如發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸困難、精神萎靡等，且發(fā)病率和死亡率較高的菌株作為候選菌株。這些菌株在感染仔豬后，能夠引發(fā)機體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對副豬嗜血桿菌的特異性抗體和免疫細胞，從而為疫苗的研制提供有效的免疫原。同時，對致病力較強的菌株進行滅活處理時，需要嚴格控制滅活條件，確保菌株完全滅活，以保證疫苗的安全性。除了血清型代表性和致病力外，還考慮了菌株的生長特性和穩(wěn)定性。選擇生長速度較快、易于培養(yǎng)的菌株，能夠提高疫苗生產(chǎn)的效率和產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。同時，菌株在傳代培養(yǎng)過程中應(yīng)具有良好的穩(wěn)定性，避免出現(xiàn)抗原變異或毒力返強等問題，以保證疫苗質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性。對篩選出的菌株進行多次傳代培養(yǎng)，觀察其生長特性、血清型和致病力等指標的變化情況，確保菌株在長期培養(yǎng)過程中保持穩(wěn)定。綜合考慮血清型代表性、致病力、生長特性和穩(wěn)定性等因素，最終確定了[菌株名稱1]（血清型4）和[菌株名稱2]（血清型5）作為用于副豬嗜血桿菌滅活苗研制的菌株，為后續(xù)的疫苗制備和免疫效果研究奠定了基礎(chǔ)。5.2滅活處理確定菌株后，對選定的副豬嗜血桿菌菌株進行滅活處理。本研究采用甲醛作為滅活劑，甲醛具有高效的殺菌能力，能夠使細菌的蛋白質(zhì)變性，破壞細菌的核酸結(jié)構(gòu)，從而達到滅活的目的。在實際應(yīng)用中，其滅活效果穩(wěn)定可靠，且成本相對較低，是疫苗制備中常用的滅活劑之一。將培養(yǎng)好的菌液按照一定比例加入甲醛溶液，使甲醛的終濃度達到0.2%-0.4%。在37℃條件下，持續(xù)攪拌滅活24-30小時。此溫度和時間條件是基于前期的預(yù)實驗結(jié)果確定的，在該條件下，既能確保細菌完全滅活，又能最大程度地保留菌體表面的抗原成分，保證疫苗的免疫原性。例如，在預(yù)實驗中，分別設(shè)置了不同的甲醛濃度梯度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）和滅活時間梯度（12小時、18小時、24小時、30小時、36小時），對滅活后的菌液進行活菌計數(shù)和免疫原性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醛終濃度為0.2%-0.4%，滅活時間為24-30小時時，活菌計數(shù)結(jié)果顯示菌液中無活菌生長，且免疫原性檢測表明，滅活后的菌體能夠刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)。為了確認滅活效果，在滅活結(jié)束后，進行嚴格的檢測。取適量滅活后的菌液，接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基（添加5%新生牛血清和10μg/mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD））平板上。將平板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。每天定時觀察平板上是否有菌落生長。若7天內(nèi)平板上均無菌落生長，則判定滅活合格；若有菌落生長，則表明滅活不完全，需要重新進行滅活處理。這種檢測方法能夠直接、準確地判斷菌液中是否仍存在存活的細菌，確保疫苗的安全性。同時，對滅活后的菌液進行無菌檢驗，采用無菌操作技術(shù)，將菌液接種于普通肉湯培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃溫箱中培養(yǎng)10天，觀察有無細菌生長。若兩種培養(yǎng)基中均無細菌生長，進一步證明滅活后的菌液無菌，符合疫苗制備的要求。5.3佐劑選擇佐劑在疫苗中起著至關(guān)重要的作用，它能夠增強抗原的免疫原性，提高機體對疫苗的免疫應(yīng)答水平。不同佐劑對疫苗免疫效果的影響存在差異，因此選擇合適的佐劑對于研制高效的副豬嗜血桿菌滅活苗至關(guān)重要。本研究對比了氫氧化鋁、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、蜂膠佐劑和油乳佐劑等多種佐劑對副豬嗜血桿菌滅活苗免疫效果的影響。氫氧化鋁佐劑是一種常用的無機佐劑，具有良好的安全性和穩(wěn)定性，它能夠吸附抗原，形成抗原-佐劑復(fù)合物，延長抗原在體內(nèi)的釋放時間，持續(xù)刺激機體免疫系統(tǒng)，從而增強免疫應(yīng)答。弗氏完全佐劑含有滅活的分枝桿菌，免疫增強作用較強，但因其副作用較大，如可引起局部炎癥、肉芽腫等，一般不用于動物疫苗的制備。弗氏不完全佐劑則不含分枝桿菌，副作用相對較小，但免疫增強效果也略遜于弗氏完全佐劑。蜂膠佐劑是一種天然的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用，能夠增強機體的免疫功能，提高疫苗的免疫效果。油乳佐劑是由油相和水相組成的乳劑，能夠包裹抗原，形成緩慢釋放的抗原儲存庫，延長抗原的作用時間，增強免疫應(yīng)答。將不同佐劑與滅活的副豬嗜血桿菌抗原混合，制備成不同佐劑類型的滅活疫苗。選取健康仔豬作為實驗動物，隨機分為多個實驗組和對照組，每組若干頭仔豬。實驗組分別接種不同佐劑的滅活疫苗，對照組接種不含佐劑的滅活疫苗或生理鹽水。按照預(yù)定的免疫程序進行免疫接種，一般采用肌肉注射或皮下注射的方式，在免疫后的不同時間點采集仔豬的血液樣本，檢測血清中的抗體水平，包括抗體滴度、抗體亞型等指標。同時，觀察仔豬的臨床反應(yīng)，如是否出現(xiàn)發(fā)熱、食欲減退、精神萎靡等不良反應(yīng)，以及局部注射部位是否出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)等情況。實驗結(jié)果表明，氫氧化鋁佐劑組的仔豬在免疫后產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體，抗體滴度在免疫后[具體時間]達到峰值，并能維持較長時間的較高水平。與其他佐劑組相比，氫氧化鋁佐劑組的抗體陽轉(zhuǎn)率較高，免疫保護效果較好。在安全性方面，氫氧化鋁佐劑組的仔豬未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，局部注射部位僅有輕微的紅腫，且在短時間內(nèi)自行消退，安全性較高。弗氏完全佐劑組雖然免疫增強效果較強，但仔豬出現(xiàn)了較為嚴重的局部炎癥反應(yīng)和全身不良反應(yīng)，如發(fā)熱、食欲不振等，影響了仔豬的健康和生長性能，不適用于實際生產(chǎn)應(yīng)用。弗氏不完全佐劑組的免疫效果略低于氫氧化鋁佐劑組，且也存在一定程度的局部反應(yīng)。蜂膠佐劑組的免疫效果較好，但抗體產(chǎn)生的速度相對較慢，在免疫初期抗體水平較低。油乳佐劑組的免疫效果也較為理想，但油乳劑的黏稠度較高，注射時操作不便，且可能會引起局部組織的肉芽腫反應(yīng)。綜合考慮免疫效果和安全性等因素，本研究最終選擇氫氧化鋁作為副豬嗜血桿菌滅活苗的佐劑。氫氧化鋁佐劑不僅能夠有效增強疫苗的免疫原性，提高仔豬對副豬嗜血桿菌的抵抗力，還具有良好的安全性，對仔豬的生長和健康影響較小，適合在實際生產(chǎn)中應(yīng)用。5.4疫苗制備工藝確定佐劑后，按照以下工藝流程進行副豬嗜血桿菌滅活苗的制備：首先，將滅活后的菌液與選定的氫氧化鋁佐劑按照一定比例混合。通常，菌液與氫氧化鋁佐劑的體積比為[X]：[X]，此比例是在前期的實驗中通過對不同比例組合進行免疫效果評估后確定的，在該比例下，疫苗能夠激發(fā)機體產(chǎn)生較為理想的免疫應(yīng)答。在混合過程中，采用磁力攪拌器或機械攪拌裝置，以[X]r/min的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌30-60分鐘，使菌液與佐劑充分混勻，形成均勻的混合液。隨后，對混合液進行乳化處理，以制備出穩(wěn)定的疫苗劑型。乳化過程采用高壓均質(zhì)機或膠體磨等設(shè)備。若使用高壓均質(zhì)機，將混合液加入高壓均質(zhì)機的料桶中，設(shè)置均質(zhì)壓力為[X]MPa，循環(huán)均質(zhì)3-5次。高壓均質(zhì)機能夠在高壓條件下使混合液通過狹小的縫隙，產(chǎn)生強烈的剪切力、沖擊力和空穴效應(yīng)，從而使油相和水相充分混合，形成均勻穩(wěn)定的乳劑。若采用膠體磨，將混合液倒入膠體磨的進料斗中，調(diào)節(jié)膠體磨的轉(zhuǎn)子與定子之間的間隙至[X]mm，開啟設(shè)備，以[X]r/min的轉(zhuǎn)速進行乳化，乳化時間為10-15分鐘。膠體磨通過高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子與定子之間的相對運動，對混合液產(chǎn)生剪切、研磨和攪拌作用，實現(xiàn)油相和水相的乳化。乳化后的疫苗應(yīng)呈現(xiàn)出均勻細膩的乳白色乳狀液，無分層、無沉淀現(xiàn)象。乳化完成后，對疫苗進行質(zhì)量檢測，包括外觀、pH值、無菌檢驗、安全性檢驗等。外觀檢測主要觀察疫苗的色澤、均勻度和有無異物等，合格的疫苗應(yīng)色澤均勻，無肉眼可見的異物。pH值檢測采用pH計，將pH計的電極插入疫苗樣品中，測量其pH值，疫苗的pH值應(yīng)在[X]-[X]的范圍內(nèi)，以保證疫苗的穩(wěn)定性和安全性。無菌檢驗按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄中的方法進行，將疫苗分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃溫箱中培養(yǎng)10天，觀察有無細菌生長，若兩種培養(yǎng)基中均無細菌生長，則判定無菌檢驗合格。安全性檢驗選取健康仔豬若干頭，按照規(guī)定的接種劑量和途徑對仔豬進行疫苗接種，觀察仔豬的采食、精神狀態(tài)、體溫變化以及局部注射部位的反應(yīng)等情況，在接種后的1-2周內(nèi)，仔豬應(yīng)無明顯的不良反應(yīng)，如發(fā)熱、食欲不振、精神萎靡、局部紅腫等，若出現(xiàn)不良反應(yīng)，應(yīng)分析原因并對疫苗進行改進。經(jīng)過質(zhì)量檢測合格的疫苗，進行分裝和保存。采用無菌的疫苗瓶或西林瓶進行分裝，根據(jù)實際使用需求，確定每瓶疫苗的裝量，一般為1-5mL/瓶。分裝過程在無菌操作環(huán)境下進行，使用自動灌裝機或移液器等設(shè)備，確保每瓶疫苗的裝量準確一致。分裝完成后，立即加蓋密封，并粘貼標簽，標簽上注明疫苗的名稱、批次、生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)企業(yè)等信息。將分裝后的疫苗置于2-8℃的冷藏條件下保存，避免陽光直射和高溫環(huán)境，以保證疫苗的質(zhì)量和免疫效果。在保存過程中，定期對疫苗進行質(zhì)量抽檢，確保疫苗在有效期內(nèi)的質(zhì)量穩(wěn)定。六、滅活苗的效果評估6.1安全性試驗選取30頭健康的仔豬，隨機分為實驗組和對照組，每組15頭。實驗組仔豬肌肉注射本研究研制的副豬嗜血桿菌滅活苗，按照每頭仔豬2mL的接種劑量進行注射，注射途徑為頸部肌肉注射。對照組仔豬則肌肉注射等量的生理鹽水，同樣采用頸部肌肉注射的方式。在接種疫苗后的14天內(nèi)，每天密切觀察仔豬的采食情況、精神狀態(tài)、體溫變化以及局部注射部位的反應(yīng)。采食情況通過記錄仔豬每天的采食量來評估，若采食量較接種前無明顯變化或僅有輕微波動，表明采食正常；若采食量明顯下降，較接種前減少[X]%以上，則視為采食異常。精神狀態(tài)主要觀察仔豬的活躍度、對外界刺激的反應(yīng)等，正常仔豬應(yīng)表現(xiàn)出活潑好動、對聲音和觸摸等刺激有明顯反應(yīng)；若仔豬出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、反應(yīng)遲鈍等癥狀，則判定為精神狀態(tài)異常。體溫變化采用獸用體溫計測量仔豬的直腸溫度，每天定時測量2次，分別為上午和下午。正常仔豬的體溫范圍一般在38℃-39.5℃之間，若體溫超過39.5℃且持續(xù)時間超過[X]小時，或體溫低于38℃，則視為體溫異常。對于局部注射部位的反應(yīng)，主要觀察是否出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)、疼痛等癥狀。紅腫程度通過測量注射部位紅腫區(qū)域的直徑來評估，若紅腫直徑小于[X]cm，且在[X]天內(nèi)逐漸消退，視為輕微紅腫；若紅腫直徑大于[X]cm，或紅腫持續(xù)時間超過[X]天，視為嚴重紅腫。硬結(jié)的判斷則通過觸摸注射部位，感受是否有質(zhì)地較硬的腫塊，若有明顯的硬結(jié)，且硬結(jié)直徑大于[X]cm，視為出現(xiàn)硬結(jié)。疼痛反應(yīng)通過觀察仔豬在觸摸注射部位時的表現(xiàn)來判斷，若仔豬出現(xiàn)尖叫、躲避、掙扎等行為，表明存在疼痛反應(yīng)。觀察結(jié)果顯示，實驗組仔豬在接種疫苗后，采食情況正常，平均采食量與接種前相比無顯著差異（P>0.05）。精神狀態(tài)良好，仔豬表現(xiàn)活潑，對外界刺激反應(yīng)靈敏。體溫均在正常范圍內(nèi)波動，未出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象，體溫均值為（38.5±0.3）℃。局部注射部位僅有輕微紅腫，紅腫直徑平均為（1.2±0.2）cm，且在3天內(nèi)逐漸消退，未出現(xiàn)硬結(jié)和疼痛反應(yīng)。對照組仔豬在注射生理鹽水后，各項觀察指標均正常，與實驗組相比無明顯差異。這表明本研究研制的副豬嗜血桿菌滅活苗安全性良好，對仔豬無明顯的不良反應(yīng)，符合疫苗安全性的要求。6.2免疫原性試驗選取30頭健康仔豬，隨機分為實驗組和對照組，每組15頭。實驗組仔豬肌肉注射本研究研制的副豬嗜血桿菌滅活苗，按照每頭仔豬2mL的接種劑量進行免疫接種，免疫程序為首免后間隔3周進行二免。對照組仔豬肌肉注射等量的生理鹽水。在免疫前以及免疫后的第1周、第2周、第3周、第4周、第6周、第8周分別采集仔豬的血液樣本。將采集的血液樣本在室溫下靜置1-2小時，然后以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，分離出血清，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用間接ELISA方法檢測血清中的抗體水平。首先，用包被緩沖液將純化的副豬嗜血桿菌抗原稀釋至適宜濃度，一般為[X]μg/mL，加入酶標板中，每孔100μL，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌酶標板3次，每次3-5分鐘，以去除未結(jié)合的抗原。然后，加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育1-2小時，封閉酶標板上的非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，再次用PBST洗滌酶標板3次。將待檢血清用PBST進行倍比稀釋，一般從1:100開始稀釋，加入酶標板中，每孔100μL，同時設(shè)置陰性對照（只加PBST）和陽性對照（已知高抗體水平的血清），37℃孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌酶標板5次，每次3-5分鐘。接著，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗豬IgG二抗，用PBST稀釋至適宜濃度，一般為1:5000-1:10000，每孔100μL，37℃孵育1-2小時。孵育后，用PBST洗滌酶標板5-7次，每次3-5分鐘。最后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色15-20分鐘。當(dāng)陽性對照孔出現(xiàn)明顯的藍色時，加入2MH?SO?終止液，每孔50μL，終止反應(yīng)。在酶標儀上測定450nm處的吸光值（OD???）。結(jié)果顯示，實驗組仔豬在免疫首免后第1周，血清中抗體水平開始升高，OD???值從免疫前的（0.15±0.03）上升至（0.25±0.05），但與對照組相比，差異不顯著（P>0.05）。隨著時間的推移，抗體水平逐漸上升，在免疫二免后第1周，抗體水平顯著升高，OD???值達到（0.65±0.08），與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在免疫二免后第3周，抗體水平達到峰值，OD???值為（0.85±0.10），隨后抗體水平逐漸下降，但在免疫后第8周，OD???值仍維持在（0.55±0.07），顯著高于對照組（P<0.05）。對照組仔豬在整個試驗過程中，血清抗體水平無明顯變化，OD???值始終維持在較低水平，在（0.15±0.03）-（0.20±0.04）之間波動。這表明本研究研制的副豬嗜血桿菌滅活苗能夠刺激仔豬機體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，且抗體水平在免疫后能夠維持較長時間，具有較好的免疫原性。6.3攻毒保護試驗選取40頭健康仔豬，隨機分為實驗組和對照組，每組20頭。實驗組仔豬按照每頭2mL的劑量肌肉注射本研究研制的副豬嗜血桿菌滅活苗，免疫程序為首免后間隔3周進行二免。對照組仔豬則肌肉注射等量的生理鹽水。在二免后的第3周，對兩組仔豬進行攻毒試驗。選用分離得到的強毒菌株作為攻毒菌株，通過腹腔注射的方式進行攻毒，攻毒劑量為每頭仔豬1×10?CFU（菌落形成單位）。攻毒后，密切觀察仔豬的臨床表現(xiàn)，每天定時記錄仔豬的精神狀態(tài)、采食情況、體溫變化、呼吸狀況以及是否出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、跛行等癥狀。同時，觀察仔豬的死亡情況，記錄死亡時間和死亡數(shù)量。在攻毒后的第1-2天，對照組仔豬開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、食欲不振，體溫升高至40℃-41℃，呼吸急促，部分仔豬出現(xiàn)咳嗽癥狀。隨著病情的發(fā)展，從攻毒后第3天開始，對照組仔豬陸續(xù)出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、跛行等癥狀，部分仔豬出現(xiàn)腦膜炎癥狀，表現(xiàn)為抽搐、共濟失調(diào)。在攻毒后的7天內(nèi)，對照組仔豬的發(fā)病率達到100%，死亡率為40%，共死亡8頭仔豬。相比之下，實驗組仔豬在攻毒后，臨床表現(xiàn)相對較輕。部分仔豬在攻毒后的第1-2天出現(xiàn)短暫的精神不振和體溫輕度升高，但在隨后的觀察中，癥狀逐漸緩解。僅有少數(shù)仔豬出現(xiàn)輕微的關(guān)節(jié)腫脹和跛行癥狀，未出現(xiàn)腦膜炎癥狀。在攻毒后的7天內(nèi)，實驗組仔豬的發(fā)病率為30%，共6頭仔豬發(fā)病，無死亡情況發(fā)生。根據(jù)攻毒保護試驗的結(jié)果，計算疫苗的保護率。保護率=（對照組死亡數(shù)-實驗組死亡數(shù)）/對照組死亡數(shù)×100%。本研究中，對照組死亡8頭仔豬