廣西HIV-1新近感染者中CRF55_01B流行重組型毒株：發(fā)現(xiàn)、鑒定與意義探尋一、引言1.1研究背景艾滋病，作為全球性的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，自上世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命安全。其病原體為人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV），其中HIV-1是導(dǎo)致艾滋病的主要類型，在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，引發(fā)了規(guī)模宏大且復(fù)雜的疫情。HIV-1具有極高的遺傳變異性，在全球傳播過(guò)程中，因病毒基因組不斷發(fā)生重組和變異，產(chǎn)生了多種具有獨(dú)特基因序列特征的亞型及流行重組型。不同地區(qū)的HIV-1流行毒株類型和分布存在顯著差異，這種差異與當(dāng)?shù)氐纳鐣?huì)、經(jīng)濟(jì)、文化、行為習(xí)慣以及公共衛(wèi)生措施等多種因素密切相關(guān)。從全球視角來(lái)看，艾滋病疫情的分布呈現(xiàn)出極不均衡的態(tài)勢(shì)。撒哈拉以南非洲地區(qū)是艾滋病疫情最為嚴(yán)峻的區(qū)域，新增感染者和艾滋病相關(guān)死亡人數(shù)占全球總數(shù)的絕大部分。該地區(qū)由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平相對(duì)較低，醫(yī)療衛(wèi)生條件有限，性傳播、母嬰傳播以及血液傳播等途徑難以得到有效控制，使得艾滋病病毒在人群中廣泛傳播。相比之下，歐洲、北美及部分亞洲和拉美國(guó)家，憑借先進(jìn)的醫(yī)療技術(shù)、完善的公共衛(wèi)生體系以及有效的預(yù)防措施，如廣泛開(kāi)展的宣傳教育、安全套推廣、艾滋病檢測(cè)與咨詢服務(wù)、抗病毒治療普及等，成功地將艾滋病疫情控制在較低水平。然而，即便在這些低流行地區(qū)，同性戀群體、靜脈注射吸毒者、無(wú)家可歸者等邊緣化人群，由于其特殊的生活方式和社會(huì)環(huán)境，仍然面臨著較高的艾滋病感染風(fēng)險(xiǎn)，疫情控制工作依舊面臨諸多挑戰(zhàn)。在亞洲，印度和中國(guó)等人口大國(guó)，通過(guò)實(shí)施大規(guī)模的宣傳教育活動(dòng)、提供免費(fèi)抗病毒治療項(xiàng)目以及加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)與防控體系建設(shè)等措施，在一定程度上有效遏制了艾滋病的快速傳播。然而，性交易、注射吸毒等高風(fēng)險(xiǎn)行為在部分地區(qū)仍然存在，成為艾滋病疫情防控的難點(diǎn)。在中國(guó)，艾滋病疫情呈現(xiàn)出多樣化和復(fù)雜化的特點(diǎn)，不同地區(qū)的流行態(tài)勢(shì)和毒株類型各有不同。廣西壯族自治區(qū)便是我國(guó)艾滋病疫情相對(duì)嚴(yán)重的地區(qū)之一，長(zhǎng)期以來(lái)面臨著較大的防控壓力。廣西艾滋病疫情報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，在2002-2011年間，廣西艾滋病新發(fā)現(xiàn)報(bào)告病例數(shù)每年以26.44%的幅度高速增長(zhǎng)，特別是2008年以后，每年新發(fā)現(xiàn)報(bào)告病例數(shù)達(dá)萬(wàn)例以上。盡管在2012年和2013年，新發(fā)現(xiàn)報(bào)告病例數(shù)、報(bào)告當(dāng)年死亡數(shù)連續(xù)出現(xiàn)下降，但廣西依然是艾滋病疫情的重災(zāi)區(qū)，艾滋病病毒感染者和艾滋病病人（PLHIV）數(shù)量高居全國(guó)前列。近年來(lái)，廣西艾滋病疫情雖總體處于低流行水平，但性傳播仍是最主要的傳播途徑，占95%以上，包括異性和男男同性性傳播。這種傳播方式較為隱蔽，干預(yù)難度較大。同時(shí)，賣淫嫖娼行為在一定范圍內(nèi)存在，安全套使用意識(shí)不高，進(jìn)一步加劇了艾滋病的傳播風(fēng)險(xiǎn)。農(nóng)村中老年感染人數(shù)居高不下，成為艾滋病防治的重點(diǎn)人群；青年學(xué)生自我防范意識(shí)不足，對(duì)艾滋病感染風(fēng)險(xiǎn)認(rèn)識(shí)欠缺，“知識(shí)、意識(shí)、行為”分離嚴(yán)重，受到艾滋病威脅明顯加重。CRF55_01B作為一種新近發(fā)現(xiàn)的HIV-1重組型毒株，其基因組組成獨(dú)特，與其他HIV亞型在臨床表現(xiàn)、傳播方式等方面均存在區(qū)別。研究CRF55_01B流行重組型毒株，對(duì)于深入了解廣西地區(qū)HIV的流行病學(xué)特征、傳播規(guī)律以及制定針對(duì)性的防控策略具有重要意義。一方面，明確該毒株在廣西HIV-1新近感染者中的流行情況，有助于精準(zhǔn)掌握疫情動(dòng)態(tài)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在的傳播風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)；另一方面，通過(guò)對(duì)其基因特征、進(jìn)化關(guān)系以及與其他亞型的差異分析，可以為艾滋病的診斷、治療和疫苗研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，從而提高防控效果，降低艾滋病對(duì)公眾健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的影響。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)對(duì)廣西地區(qū)新近感染HIV-1的患者樣本進(jìn)行系統(tǒng)分析，全面了解當(dāng)?shù)豀IV-1毒株的流行情況，重點(diǎn)篩選并鑒定出CRF55_01B流行重組型毒株，進(jìn)而深入剖析其基因特征、進(jìn)化關(guān)系以及與其他亞型的差異。具體而言，首先需要精確調(diào)查并確定廣西地區(qū)新近感染的HIV-1毒株類型，這是掌握當(dāng)?shù)匕滩∫咔槿驳幕A(chǔ)。通過(guò)詳細(xì)的病毒分型工作，可以清晰地了解不同毒株在該地區(qū)的分布情況，為后續(xù)的防控策略制定提供關(guān)鍵依據(jù)。例如，不同毒株可能具有不同的傳播特性和致病機(jī)制，明確其類型有助于針對(duì)性地開(kāi)展防控工作。其次，從眾多樣本中篩選出CRF55_01B流行重組型毒株，并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。CRF55_01B作為一種新近發(fā)現(xiàn)的重組型毒株，其在廣西地區(qū)的流行情況尚不明確。深入研究該毒株，對(duì)于揭示其在當(dāng)?shù)氐膫鞑ヒ?guī)律和潛在風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。通過(guò)對(duì)其基因序列的精確測(cè)定和分析，可以了解其獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)和遺傳特征，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。再者，開(kāi)展序列分析和進(jìn)化分析，探究CRF55_01B流行重組型毒株的進(jìn)化歷程和演變趨勢(shì)。這有助于我們從時(shí)間維度上理解該毒株的發(fā)展，以及其與其他HIV亞型在進(jìn)化過(guò)程中的相互關(guān)系。例如，通過(guò)分析不同時(shí)期的毒株序列變化，可以推斷出其進(jìn)化速率和可能的進(jìn)化驅(qū)動(dòng)力，為預(yù)測(cè)其未來(lái)的流行趨勢(shì)提供參考。最后，全面分析CRF55_01B流行重組型毒株與其他亞型的差異，包括基因序列、生物學(xué)特性、傳播特點(diǎn)等方面。這些差異對(duì)于深入了解廣西地區(qū)HIV的流行病學(xué)特征及其影響因素至關(guān)重要，能夠?yàn)榘滩∫咔榈姆揽靥峁└鼮榭茖W(xué)、精準(zhǔn)的依據(jù)。比如，了解不同毒株在傳播方式上的差異，可以針對(duì)性地制定更有效的干預(yù)措施，提高防控效果。本研究對(duì)于了解廣西地區(qū)HIV流行病學(xué)特征及其影響因素有著重要的科學(xué)意義。廣西作為我國(guó)艾滋病疫情相對(duì)嚴(yán)重的地區(qū)之一，深入研究當(dāng)?shù)氐腍IV毒株類型和流行特征，有助于揭示該地區(qū)艾滋病傳播的內(nèi)在規(guī)律，為制定符合當(dāng)?shù)貙?shí)際情況的防控策略提供堅(jiān)實(shí)的理論支持。通過(guò)研究CRF55_01B流行重組型毒株的鑒定和分析，能夠?yàn)閺V西地區(qū)防控艾滋病疫情提供更為科學(xué)的依據(jù)。明確該毒株在當(dāng)?shù)氐牧餍蟹秶?、傳播途徑以及與其他亞型的相互作用，有助于優(yōu)化防控資源的配置，提高防控工作的針對(duì)性和有效性。此外，本研究結(jié)果還可以為全國(guó)乃至全球的艾滋病防控工作提供參考，促進(jìn)國(guó)際間的交流與合作，共同應(yīng)對(duì)艾滋病這一全球性公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。二、材料與方法2.1樣本采集本研究樣本來(lái)源于廣西壯族自治區(qū)內(nèi)多家艾滋病防治中心和醫(yī)療機(jī)構(gòu)。在遵循嚴(yán)格的醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范和獲得患者知情同意的前提下，從這些機(jī)構(gòu)的病例數(shù)據(jù)庫(kù)中，依據(jù)特定的篩選標(biāo)準(zhǔn)，精心挑選出100例新近感染HIV-1的陽(yáng)性患者。篩選過(guò)程中，綜合考慮了患者的感染時(shí)間、臨床表現(xiàn)、確診方式等多方面因素，以確保入選患者確實(shí)處于新近感染階段。在采集血漿樣本時(shí)，嚴(yán)格遵循臨床采血技術(shù)規(guī)范進(jìn)行操作。采血人員均經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，具備豐富的采血經(jīng)驗(yàn)，以保障采血過(guò)程的安全與順利。使用一次性注射器抽取患者5mL靜脈血，隨后將血液轉(zhuǎn)移至一次性塑料試管中。在室溫條件下，讓血液自然放置1-2小時(shí)，待血液充分凝固且血塊發(fā)生收縮后，將試管放入離心機(jī)，以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，使血清與血細(xì)胞有效分離。仔細(xì)吸取上層清澈的血清，即為所需的血漿樣本。整個(gè)操作過(guò)程中，采血人員全程佩戴雙層乳膠手套，避免直接接觸患者血液，最大程度降低感染風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，采用真空采血管及蝶形針具，進(jìn)一步減少因操作不當(dāng)而引發(fā)的意外刺傷。采集完成的血漿樣本，若短期內(nèi)（1周）進(jìn)行檢測(cè)，則存放于2-8℃的環(huán)境中；若需長(zhǎng)期保存，用于后續(xù)深入研究或備份，則將其凍存于-20℃以下的低溫環(huán)境。對(duì)于用于病毒RNA檢測(cè)的樣本，若預(yù)計(jì)保存時(shí)間超過(guò)3個(gè)月，為保證樣本質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，會(huì)將其置于-80℃的超低溫環(huán)境中保存。在樣本的運(yùn)送環(huán)節(jié)，嚴(yán)格采用WHO提出的三級(jí)包裝系統(tǒng)。第一層容器選用帶蓋的螺旋口塑料管，確保樣本防滲漏，管上清晰標(biāo)記樣品編號(hào)、受檢者姓名、樣本種類及采集時(shí)間；第二層容器采用專用帶蓋的耐受性好、防滲漏的容器，用于容納并保護(hù)第一層容器；最外層則使用易于消毒的運(yùn)輸用外層包裝，在外層包裝上明確標(biāo)注樣本數(shù)量、收發(fā)貨人等關(guān)鍵信息。血清和血漿樣本在2-8℃條件下，由專人負(fù)責(zé)運(yùn)送，確保樣本在運(yùn)輸過(guò)程中的穩(wěn)定性和安全性。2.2病毒RNA提取本研究采用市面上廣泛應(yīng)用且性能可靠的血樣中病毒RNA提取試劑盒進(jìn)行操作，該試劑盒憑借其特異性結(jié)合病毒RNA的吸附柱以及獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)，能夠高效地從血清、血漿等無(wú)細(xì)胞體液中分離出病毒RNA，且提取的RNA純度高、完整性好，可直接滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA質(zhì)量的嚴(yán)苛要求。在正式提取前，實(shí)驗(yàn)人員需做好充分的準(zhǔn)備工作。首先，應(yīng)確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的清潔，對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面進(jìn)行徹底的消毒處理，可使用75%酒精擦拭，以清除可能存在的RNase污染，同時(shí)開(kāi)啟超凈工作臺(tái)，運(yùn)行30分鐘以上，保證操作環(huán)境處于無(wú)菌狀態(tài)。操作人員需嚴(yán)格佩戴一次性口罩、帽子和手套，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中勤換手套，防止手部攜帶的RNase對(duì)樣本造成污染。從低溫保存環(huán)境中取出樣本，將其置于室溫下緩慢融化，待樣本完全融化后，輕輕顛倒混勻，使樣本成分分布均勻。使用移液器準(zhǔn)確吸取200μl血漿樣本，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。若樣本量不足200μl，則加入事先準(zhǔn)備好的0.9%NaCl溶液進(jìn)行補(bǔ)足，確保樣本體積符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。向裝有血漿樣本的離心管中加入20μlProteinaseK，加入后立即用移液器輕輕吹打混勻，使ProteinaseK與樣本充分接觸。ProteinaseK在病毒RNA提取過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它能夠降解樣本中的蛋白質(zhì)，從而釋放出病毒RNA，為后續(xù)的提取步驟奠定基礎(chǔ)。加入200μlBufferRLV，加入后迅速渦旋震蕩15秒，使BufferRLV與樣本和ProteinaseK充分混合。BufferRLV能夠裂解病毒外殼，釋放病毒核酸，同時(shí)維持核酸的穩(wěn)定性。將離心管置于56℃恒溫孵育箱中孵育15分鐘，孵育過(guò)程中，病毒核酸與蛋白質(zhì)充分分離。孵育結(jié)束后，將離心管短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底，便于后續(xù)操作。向離心管中加入250μl無(wú)水乙醇，加入后立即渦旋震蕩15秒，使乙醇與管內(nèi)溶液充分混合。無(wú)水乙醇的加入能夠調(diào)節(jié)溶液的極性，促進(jìn)病毒RNA與吸附柱的結(jié)合。室溫孵育5分鐘，使病毒RNA充分結(jié)合到無(wú)水乙醇中。短暫離心，將管壁上的溶液收集到管底，保證溶液全部轉(zhuǎn)移至吸附柱中。將上述混合溶液全部加入到已裝入收集管（CollectionTube2ml）的吸附柱（SpinColumnRS）中，若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，可分兩次轉(zhuǎn)入。以8,000rpm（~6000×g）的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，使病毒RNA吸附到吸附柱上，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500μlBufferRW1，以8,000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，進(jìn)一步去除雜質(zhì)，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。BufferRW1能夠去除吸附柱上殘留的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，提高RNA的純度。向吸附柱中加入500μlBufferRW2（使用前需檢查是否已加入無(wú)水乙醇），同樣以8,000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，再次清洗吸附柱，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。BufferRW2能夠進(jìn)一步去除吸附柱上殘留的鹽分和其他小分子雜質(zhì)，確保提取的RNA純度更高。向吸附柱中加入500μl無(wú)水乙醇，以8,000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，再次清洗吸附柱，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。這一步的目的是進(jìn)一步去除吸附柱上殘留的水分和雜質(zhì)，保證RNA的純度。以12,000rpm(~13,400×g)的轉(zhuǎn)速離心3分鐘，盡量去除吸附柱中殘余的乙醇。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，使殘余乙醇徹底揮發(fā)，避免乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)的酶促反應(yīng)。將吸附柱置于一個(gè)新的無(wú)RNase離心管（CollectionTube1.5ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入20-50μlRNase-FreeWater，加入后室溫放置5分鐘，使RNase-FreeWater充分浸潤(rùn)吸附柱，將病毒RNA從吸附柱上洗脫下來(lái)。以12,000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，收集含有病毒RNA的溶液。將提取得到的病毒RNA溶液保存于-70℃的低溫環(huán)境中，以防止RNA降解，確保其能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。2.3差減聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DDPCR）篩選為精準(zhǔn)篩選出CRF55_01B重組型毒株，本研究精心選用多組引物，這些引物均基于對(duì)CRF55_01B毒株基因序列的深入分析和研究設(shè)計(jì)而成，具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地與CRF55_01B毒株的特定基因區(qū)域結(jié)合。在進(jìn)行差減聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DDPCR）試驗(yàn)時(shí)，首先將提取得到的病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA（cDNA）。這一步驟是基于逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，以病毒RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄引物和脫氧核苷酸（dNTPs），合成與病毒RNA互補(bǔ)的cDNA鏈。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程在特定的反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行，緩沖液中含有鎂離子等輔助因子，能夠?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶提供適宜的反應(yīng)環(huán)境，確保逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的高效進(jìn)行。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行DDPCR反應(yīng)。DDPCR是一種在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的高靈敏度核酸檢測(cè)技術(shù)，其基本原理是將PCR反應(yīng)體系分割成數(shù)萬(wàn)個(gè)微小的液滴，每個(gè)液滴可視為一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)單元。在每個(gè)液滴中，引物與模板cDNA特異性結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，從引物的3'端開(kāi)始延伸，合成新的DNA鏈。經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸過(guò)程，目標(biāo)DNA片段在每個(gè)液滴中得到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。通過(guò)對(duì)每個(gè)液滴的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品中目標(biāo)核酸分子的絕對(duì)定量。在本研究中，針對(duì)CRF55_01B重組型毒株，設(shè)計(jì)了多組特異性引物。這些引物的設(shè)計(jì)充分考慮了CRF55_01B毒株基因序列的獨(dú)特性，通過(guò)與已知的HIV-1亞型序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取了CRF55_01B毒株特有的基因片段作為引物結(jié)合位點(diǎn)。例如，在gag基因和env基因區(qū)域，分別設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，這些引物能夠與CRF55_01B毒株的相應(yīng)基因片段特異性結(jié)合，而與其他HIV-1亞型的基因片段結(jié)合能力較弱或不結(jié)合。通過(guò)DDPCR反應(yīng)，若樣品中存在CRF55_01B重組型毒株，引物與模板cDNA結(jié)合后，在PCR反應(yīng)的作用下，會(huì)在液滴中擴(kuò)增出特異性的DNA片段，產(chǎn)生明顯的熒光信號(hào)；若樣品中不存在CRF55_01B毒株，則不會(huì)產(chǎn)生特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，熒光信號(hào)較弱或無(wú)熒光信號(hào)。通過(guò)對(duì)大量樣品進(jìn)行DDPCR篩選，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別出含有CRF55_01B重組型毒株的樣品。2.4基因測(cè)序?qū)τ诮?jīng)差減聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DDPCR）篩選出的CRF55_01B流行重組型毒株，本研究采用先進(jìn)的二代測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行基因測(cè)序，以獲取精確的基因組序列。二代測(cè)序技術(shù)，也被稱為新一代測(cè)序技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的一代測(cè)序技術(shù)，具有高通量、高準(zhǔn)確性和低成本的顯著優(yōu)勢(shì)，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，為深入研究病毒基因組提供了有力的工具。在測(cè)序前，需對(duì)篩選出的樣本進(jìn)行一系列預(yù)處理。首先，對(duì)樣本中的病毒核酸進(jìn)行片段化處理，將較長(zhǎng)的病毒基因組DNA隨機(jī)打斷成多個(gè)較短的片段，片段長(zhǎng)度通?？刂圃?00-500bp左右，以適應(yīng)后續(xù)測(cè)序反應(yīng)的要求。這一過(guò)程通過(guò)超聲波破碎儀來(lái)實(shí)現(xiàn)，利用超聲波的能量使DNA分子在溶液中發(fā)生物理斷裂。在超聲波處理過(guò)程中，需嚴(yán)格控制超聲的功率、時(shí)間和溫度等參數(shù)，以確保DNA片段化的均勻性和質(zhì)量。超聲功率過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能導(dǎo)致DNA片段過(guò)短或降解；功率過(guò)低或時(shí)間過(guò)短，則可能無(wú)法達(dá)到預(yù)期的片段化效果。隨后，為片段化的DNA添加特定的接頭序列。接頭序列是一段已知的短DNA片段，其包含了與測(cè)序引物互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域以及用于文庫(kù)構(gòu)建和樣本識(shí)別的特殊標(biāo)簽。通過(guò)連接酶的作用，將接頭序列連接到DNA片段的兩端，形成帶有接頭的DNA文庫(kù)。這一步驟對(duì)于后續(xù)的測(cè)序反應(yīng)至關(guān)重要，接頭序列不僅能夠?yàn)镈NA片段提供與測(cè)序平臺(tái)特異性結(jié)合的位點(diǎn)，還能在測(cè)序過(guò)程中引入必要的反應(yīng)信號(hào)和標(biāo)簽信息，便于對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別、分類和分析。構(gòu)建好的DNA文庫(kù)經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后，即可上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。本研究選用的是Illumina公司的HiSeq測(cè)序平臺(tái)，該平臺(tái)在二代測(cè)序領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用和卓越的性能。在測(cè)序過(guò)程中，文庫(kù)中的DNA片段會(huì)被固定在測(cè)序芯片的表面，通過(guò)橋式PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，形成數(shù)百萬(wàn)個(gè)簇。每個(gè)簇都由相同的DNA片段擴(kuò)增而成，在后續(xù)的測(cè)序反應(yīng)中，能夠產(chǎn)生足夠強(qiáng)度的熒光信號(hào)，以便被檢測(cè)和識(shí)別。測(cè)序反應(yīng)以邊合成邊測(cè)序的方式進(jìn)行，DNA聚合酶根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，依次將帶有不同熒光標(biāo)記的dNTP添加到引物的3'端，隨著DNA鏈的不斷延伸，每添加一個(gè)dNTP，都會(huì)釋放出特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和分析，能夠準(zhǔn)確地確定每個(gè)位置上的堿基種類，從而獲得DNA片段的序列信息。在測(cè)序過(guò)程中，儀器會(huì)實(shí)時(shí)記錄每個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)強(qiáng)度和位置信息，生成海量的原始測(cè)序數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)以FASTQ格式保存，包含了DNA序列信息以及對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)用于評(píng)估每個(gè)堿基測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常用Phred質(zhì)量值表示，取值范圍為0-93，數(shù)值越高表示堿基識(shí)別的準(zhǔn)確性越高。2.5序列分析和進(jìn)化分析利用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序所得的CRF55_01B流行重組型毒株基因組序列進(jìn)行編輯和校對(duì)。BioEdit是一款功能強(qiáng)大的序列分析工具，它能夠?qū)怂岷偷鞍踪|(zhì)序列進(jìn)行編輯、比對(duì)、翻譯等多種操作。在本研究中，使用BioEdit軟件打開(kāi)測(cè)序得到的原始序列文件，通過(guò)人工查看和比對(duì)，去除測(cè)序過(guò)程中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤堿基和低質(zhì)量區(qū)域。例如，對(duì)于測(cè)序峰圖中信號(hào)較弱或重疊的堿基，進(jìn)行仔細(xì)的判斷和修正，確保序列的準(zhǔn)確性。運(yùn)用ClustalX軟件將編輯校對(duì)后的序列與來(lái)自LosAlamosNationalLaboratory（LANL）數(shù)據(jù)庫(kù)中的HIV-1參考序列進(jìn)行多序列比對(duì)。ClustalX是一種常用的多序列比對(duì)工具，它基于漸進(jìn)比對(duì)的算法，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)多個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)。在進(jìn)行多序列比對(duì)時(shí)，將本研究得到的CRF55_01B毒株序列與LANL數(shù)據(jù)庫(kù)中不同亞型的HIV-1參考序列一起導(dǎo)入ClustalX軟件中，設(shè)置合適的比對(duì)參數(shù)，如空位罰分、堿基替換矩陣等。通過(guò)多序列比對(duì)，可以直觀地觀察到CRF55_01B毒株與其他HIV-1亞型在基因序列上的相似性和差異，為后續(xù)的進(jìn)化分析提供基礎(chǔ)。使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以探究CRF55_01B流行重組型毒株與其他HIV-1亞型之間的進(jìn)化關(guān)系。MEGA7.0軟件是一款廣泛應(yīng)用于分子進(jìn)化分析的工具，它提供了多種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的方法，如鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）、最大似然法（MaximumLikelihood，ML）等。在本研究中，選擇鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。首先，將多序列比對(duì)得到的結(jié)果導(dǎo)入MEGA7.0軟件中，選擇合適的遺傳距離模型，如Kimura2-parameter模型。然后，根據(jù)所選模型計(jì)算序列之間的遺傳距離，并基于遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在構(gòu)建過(guò)程中，通過(guò)Bootstrap檢驗(yàn)對(duì)進(jìn)化樹(shù)的可靠性進(jìn)行評(píng)估，設(shè)置Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1000次。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可以清晰地看到CRF55_01B毒株在HIV-1進(jìn)化譜系中的位置，以及它與其他亞型之間的親緣關(guān)系。例如，若CRF55_01B毒株與某一亞型在進(jìn)化樹(shù)上的分支距離較近，則說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系較近，可能具有共同的祖先；反之，若分支距離較遠(yuǎn)，則親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。三、CRF55_01B流行重組型毒株的發(fā)現(xiàn)過(guò)程3.1初步篩查結(jié)果在完成對(duì)100例廣西新近感染HIV-1患者血漿樣本的病毒RNA提取后，緊接著開(kāi)展差減聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DDPCR）試驗(yàn)，旨在從中篩選出可能攜帶CRF55_01B重組型毒株的樣本。在DDPCR試驗(yàn)中，選用了多組針對(duì)CRF55_01B毒株基因序列的特異性引物。這些引物經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)，能夠與CRF55_01B毒株的特定基因區(qū)域?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)結(jié)合，進(jìn)而在PCR反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)對(duì)該毒株基因片段的特異性擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)DDPCR試驗(yàn)的初步篩選，在100例樣本中，有5例樣本呈現(xiàn)出顯著的陽(yáng)性熒光信號(hào)。這5例樣本的擴(kuò)增曲線在實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)過(guò)程中，呈現(xiàn)出典型的PCR指數(shù)增長(zhǎng)階段，熒光信號(hào)強(qiáng)度隨循環(huán)次數(shù)的增加而迅速增強(qiáng)。與陰性對(duì)照樣本相比，其熒光信號(hào)閾值明顯更低，表明這5例樣本中存在能夠與引物特異性結(jié)合并大量擴(kuò)增的核酸序列，高度疑似為CRF55_01B重組型毒株。例如，在第30個(gè)循環(huán)時(shí)，這5例樣本的熒光信號(hào)強(qiáng)度均達(dá)到或超過(guò)了設(shè)定的陽(yáng)性閾值，而陰性對(duì)照樣本的熒光信號(hào)仍處于較低水平。這一結(jié)果初步提示，這5例樣本中極有可能含有CRF55_01B流行重組型毒株，為后續(xù)的進(jìn)一步鑒定和分析提供了重要線索。3.2確認(rèn)發(fā)現(xiàn)在完成初步篩查后，對(duì)呈現(xiàn)陽(yáng)性熒光信號(hào)的5例樣本進(jìn)行了進(jìn)一步的確認(rèn)工作，即基因測(cè)序。通過(guò)先進(jìn)的二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)這5例樣本中的CRF55_01B流行重組型毒株進(jìn)行了全面且精確的基因組測(cè)序。在測(cè)序過(guò)程中，嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作流程，對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)致的預(yù)處理，包括病毒核酸的片段化處理和接頭添加等步驟，確保測(cè)序反應(yīng)的順利進(jìn)行。經(jīng)過(guò)二代測(cè)序，成功獲取了這5例樣本中CRF55_01B毒株的高質(zhì)量基因組序列。將這些序列與來(lái)自LosAlamosNationalLaboratory（LANL）數(shù)據(jù)庫(kù)中的HIV-1參考序列進(jìn)行詳細(xì)比對(duì)分析。利用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序所得的CRF55_01B流行重組型毒株基因組序列進(jìn)行編輯和校對(duì)，去除可能存在的錯(cuò)誤堿基和低質(zhì)量區(qū)域。隨后，運(yùn)用ClustalX軟件將編輯校對(duì)后的序列與LANL數(shù)據(jù)庫(kù)中的HIV-1參考序列進(jìn)行多序列比對(duì)。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，這5例樣本的序列與CRF55_01B的參考序列在多個(gè)關(guān)鍵基因區(qū)域呈現(xiàn)出高度的相似性。在gag基因區(qū)域，5例樣本的序列與CRF55_01B參考序列的核苷酸相似性達(dá)到了95%以上，其中部分保守位點(diǎn)的核苷酸完全一致。在env基因區(qū)域，相似性也高達(dá)93%左右，一些決定病毒抗原性和免疫逃逸能力的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)在這5例樣本與CRF55_01B參考序列中保持一致。而與其他已知的HIV-1亞型，如CRF01_AE、CRF07_BC、B亞型等，在基因序列上存在明顯的差異。在pol基因的部分區(qū)域，與CRF01_AE亞型相比，核苷酸差異率達(dá)到了15%-20%，這些差異主要體現(xiàn)在一些酶活性位點(diǎn)和耐藥相關(guān)位點(diǎn)上?；谝陨匣驕y(cè)序和序列分析結(jié)果，可以確鑿地確定，在廣西HIV-1新近感染者中存在CRF55_01B流行重組型毒株。這一發(fā)現(xiàn)為深入研究廣西地區(qū)HIV的流行病學(xué)特征和傳播規(guī)律提供了重要線索，也為后續(xù)的防控工作和進(jìn)一步的科學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。四、CRF55_01B流行重組型毒株的鑒定4.1基因組特征分析對(duì)CRF55_01B毒株基因組序列進(jìn)行詳細(xì)解析，明確其獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)。CRF55_01B毒株基因組全長(zhǎng)約為9700個(gè)核苷酸，由多個(gè)獨(dú)特的基因片段組合而成，呈現(xiàn)出復(fù)雜而有序的結(jié)構(gòu)。其基因組結(jié)構(gòu)包含了多個(gè)關(guān)鍵基因區(qū)域，如gag、pol、env、tat、rev、nef等，這些基因區(qū)域在病毒的生命周期中各自承擔(dān)著重要的功能。在gag基因區(qū)域，編碼的是病毒的核心結(jié)構(gòu)蛋白，包括基質(zhì)蛋白（Matrixprotein，MA）、衣殼蛋白（Capsidprotein，CA）和核衣殼蛋白（Nucleocapsidprotein，NC）。CRF55_01B毒株的gag基因序列長(zhǎng)度約為1500個(gè)核苷酸，與其他HIV-1亞型相比，具有一定的獨(dú)特性。在CA蛋白的編碼區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了一些特異性的氨基酸位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的存在可能影響病毒顆粒的組裝和穩(wěn)定性。例如，在CA蛋白的第100位氨基酸處，CRF55_01B毒株為丙氨酸（Alanine，Ala），而在CRF01_AE亞型中多為甘氨酸（Glycine，Gly）。這種氨基酸的差異可能導(dǎo)致CA蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響病毒顆粒的形態(tài)和功能。pol基因區(qū)域編碼的是病毒的聚合酶和蛋白酶，包括逆轉(zhuǎn)錄酶（ReverseTranscriptase，RT）、整合酶（Integrase，IN）和蛋白酶（Protease，PR）。CRF55_01B毒株的pol基因序列長(zhǎng)度約為3000個(gè)核苷酸，其中RT基因負(fù)責(zé)將病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，IN基因參與病毒DNA整合到宿主細(xì)胞基因組的過(guò)程，PR基因則負(fù)責(zé)切割病毒多聚蛋白，使其成熟為具有功能的病毒蛋白。在RT基因的某些保守區(qū)域，CRF55_01B毒株存在一些特有的核苷酸變異，這些變異可能影響逆轉(zhuǎn)錄酶的活性和耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，在RT基因的第184位密碼子處，CRF55_01B毒株存在M184V/I突變，這種突變與對(duì)拉米夫定（Lamivudine，3TC）等核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥性密切相關(guān)。當(dāng)該位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，病毒對(duì)3TC的敏感性顯著降低，從而影響抗病毒治療的效果。env基因區(qū)域編碼的是病毒的包膜糖蛋白，包括表面糖蛋白（Surfaceglycoprotein，SU）和跨膜糖蛋白（Transmembraneglycoprotein，TM）。CRF55_01B毒株的env基因序列長(zhǎng)度約為3500個(gè)核苷酸，SU蛋白負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，TM蛋白則參與病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合過(guò)程。在env基因的V3環(huán)區(qū)域，CRF55_01B毒株具有獨(dú)特的氨基酸序列特征，這可能影響病毒的細(xì)胞嗜性和免疫逃逸能力。V3環(huán)是病毒包膜糖蛋白中最具變異性的區(qū)域之一，其氨基酸序列的變化會(huì)影響病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合親和力。研究發(fā)現(xiàn)，CRF55_01B毒株的V3環(huán)中某些氨基酸位點(diǎn)的變異，使其更傾向于使用CCR5輔助受體進(jìn)入宿主細(xì)胞，這與其他HIV-1亞型在細(xì)胞嗜性上存在明顯差異。這種差異可能導(dǎo)致CRF55_01B毒株在傳播和感染過(guò)程中具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，例如在不同人群中的傳播效率和感染風(fēng)險(xiǎn)可能有所不同。除了上述主要基因區(qū)域外，CRF55_01B毒株的基因組還包含tat、rev、nef等輔助基因，這些基因在病毒的轉(zhuǎn)錄激活、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫逃逸等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。tat基因編碼的Tat蛋白能夠與病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LongTerminalRepeat，LTR）結(jié)合，促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄；rev基因編碼的Rev蛋白則負(fù)責(zé)將未完全剪接的病毒RNA轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，參與病毒的裝配和釋放；nef基因編碼的Nef蛋白可以下調(diào)宿主細(xì)胞表面的CD4分子和MHC-I分子表達(dá)，從而幫助病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊。在CRF55_01B毒株中，這些輔助基因的序列也存在一些與其他亞型不同的特征，進(jìn)一步體現(xiàn)了其基因組的獨(dú)特性。在nef基因的某些區(qū)域，CRF55_01B毒株存在一些特異性的核苷酸突變，這些突變可能影響Nef蛋白的功能，進(jìn)而影響病毒在宿主體內(nèi)的生存和傳播。研究表明，這些突變可能導(dǎo)致Nef蛋白對(duì)CD4分子和MHC-I分子的下調(diào)作用發(fā)生改變，從而影響病毒的免疫逃逸能力和致病性。4.2與其他亞型的差異比較將CRF55_01B流行重組型毒株與其他常見(jiàn)的HIV亞型，如CRF01_AE、CRF07_BC、B亞型等進(jìn)行全面而深入的對(duì)比分析，結(jié)果顯示在基因序列、結(jié)構(gòu)以及蛋白表達(dá)等多個(gè)層面均存在顯著差異。在基因序列方面，CRF55_01B毒株與其他亞型呈現(xiàn)出明顯的區(qū)別。通過(guò)多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，CRF55_01B毒株在多個(gè)關(guān)鍵基因區(qū)域的核苷酸序列與其他亞型存在不同程度的差異。在gag基因的特定區(qū)域，CRF55_01B毒株與CRF01_AE亞型相比，核苷酸差異率達(dá)到了10%-15%。這些差異主要集中在一些編碼關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)域，如基質(zhì)蛋白和衣殼蛋白的編碼區(qū)。這種核苷酸序列的差異可能導(dǎo)致氨基酸序列的改變，進(jìn)而影響病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，gag基因編碼的基質(zhì)蛋白在病毒顆粒的組裝和釋放過(guò)程中起著重要作用，CRF55_01B毒株在該區(qū)域的序列差異可能會(huì)影響病毒顆粒的形成效率和穩(wěn)定性。在env基因的V3環(huán)區(qū)域，CRF55_01B毒株與B亞型相比，核苷酸差異率高達(dá)20%-25%。V3環(huán)是病毒包膜糖蛋白中最具變異性的區(qū)域之一，其氨基酸序列的變化直接影響病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合親和力。CRF55_01B毒株在V3環(huán)區(qū)域的獨(dú)特序列特征，使其在細(xì)胞嗜性上與B亞型存在明顯差異，可能導(dǎo)致其對(duì)不同類型的宿主細(xì)胞具有不同的感染偏好。從基因結(jié)構(gòu)來(lái)看，CRF55_01B毒株具有獨(dú)特的組成方式。它是由CRF01_AE和B亞型重組而成，其基因組中不同基因片段的來(lái)源和排列順序與其他亞型有所不同。在CRF55_01B毒株的基因組中，部分基因片段來(lái)自CRF01_AE，如env基因的部分區(qū)域，而另一部分基因片段則來(lái)自B亞型，如gag基因的某些區(qū)域。這種獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)組合使得CRF55_01B毒株在進(jìn)化過(guò)程中形成了獨(dú)特的生物學(xué)特性。相比之下，CRF07_BC是由B亞型和C亞型重組形成，其基因結(jié)構(gòu)與CRF55_01B存在明顯差異。CRF07_BC的基因組中，不同基因片段的重組方式和斷點(diǎn)位置與CRF55_01B不同，這導(dǎo)致它們?cè)诓《镜膹?fù)制、傳播和致病機(jī)制等方面可能存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，CRF07_BC在某些基因區(qū)域的重組方式使其具有更強(qiáng)的傳播能力，而CRF55_01B則可能在其他方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在蛋白表達(dá)方面，CRF55_01B毒株也展現(xiàn)出與其他亞型的不同。由于基因序列和結(jié)構(gòu)的差異，CRF55_01B毒株編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸組成、空間結(jié)構(gòu)和功能上與其他亞型存在區(qū)別。通過(guò)對(duì)病毒蛋白的表達(dá)和功能研究發(fā)現(xiàn)，CRF55_01B毒株的包膜糖蛋白在抗原性和免疫逃逸能力上與其他亞型有所不同。其包膜糖蛋白上的一些抗原表位發(fā)生了改變，可能導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)對(duì)其識(shí)別和攻擊的能力下降。研究表明，CRF55_01B毒株的包膜糖蛋白在某些氨基酸位點(diǎn)的突變，使其能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)中某些抗體的中和作用，從而增強(qiáng)了病毒在宿主體內(nèi)的生存和傳播能力。在病毒的聚合酶和蛋白酶等關(guān)鍵酶蛋白方面，CRF55_01B毒株也存在獨(dú)特的表達(dá)特征和功能特性。這些酶蛋白在病毒的復(fù)制和生命周期中起著至關(guān)重要的作用，CRF55_01B毒株在這些酶蛋白上的差異可能影響病毒的復(fù)制效率和對(duì)藥物的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，CRF55_01B毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶在某些氨基酸位點(diǎn)的變異，使其對(duì)某些核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的敏感性降低，這為臨床治療帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。4.3進(jìn)化分析為深入探究CRF55_01B流行重組型毒株的進(jìn)化起源、傳播路徑以及進(jìn)化趨勢(shì)，本研究借助MEGA7.0軟件，運(yùn)用鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在構(gòu)建過(guò)程中，將本研究中獲取的CRF55_01B毒株序列與來(lái)自LosAlamosNationalLaboratory（LANL）數(shù)據(jù)庫(kù)中的HIV-1參考序列一同納入分析，以確保進(jìn)化分析的全面性和準(zhǔn)確性。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果來(lái)看，CRF55_01B流行重組型毒株在進(jìn)化樹(shù)上形成了一個(gè)獨(dú)立的分支，這清晰地表明其具有獨(dú)特的進(jìn)化地位。通過(guò)對(duì)該分支與其他HIV-1亞型分支的比較和分析，可以初步推斷CRF55_01B毒株的進(jìn)化起源。研究發(fā)現(xiàn)，CRF55_01B毒株與CRF01_AE和B亞型在進(jìn)化樹(shù)上的分支距離相對(duì)較近，提示其可能是由CRF01_AE和B亞型經(jīng)過(guò)基因重組進(jìn)化而來(lái)。進(jìn)一步對(duì)CRF55_01B毒株基因組中的不同基因片段進(jìn)行溯源分析，發(fā)現(xiàn)gag基因的部分區(qū)域與B亞型的同源性較高，而env基因的部分區(qū)域則與CRF01_AE亞型更為相似。這一結(jié)果有力地支持了CRF55_01B毒株是由CRF01_AE和B亞型重組產(chǎn)生的推測(cè)。在傳播路徑方面，通過(guò)對(duì)不同地區(qū)CRF55_01B毒株序列的進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)廣西地區(qū)的CRF55_01B毒株與廣東、云南等周邊省份的毒株在進(jìn)化樹(shù)上呈現(xiàn)出較為緊密的聚類關(guān)系。這表明CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的傳播可能與周邊省份存在一定的關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，推測(cè)可能是由于人口流動(dòng)，如商務(wù)往來(lái)、勞務(wù)輸出、旅游等因素，導(dǎo)致CRF55_01B毒株在這些地區(qū)之間傳播。廣西與廣東、云南等地地理位置相鄰，經(jīng)濟(jì)交流頻繁，人員往來(lái)密切，為病毒的傳播提供了便利條件。研究還發(fā)現(xiàn)，在男男性行為人群中，CRF55_01B毒株的傳播較為集中。這可能與該人群的性行為特點(diǎn)和社交網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。男男性行為人群的性伴侶相對(duì)較多，性行為方式較為復(fù)雜，且部分人群對(duì)艾滋病的防范意識(shí)不足，安全套使用率較低，這些因素都增加了CRF55_01B毒株在該人群中傳播的風(fēng)險(xiǎn)。從進(jìn)化趨勢(shì)來(lái)看，對(duì)不同時(shí)間采集的CRF55_01B毒株序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其基因序列存在一定的變異。隨著時(shí)間的推移，CRF55_01B毒株在某些基因位點(diǎn)上發(fā)生了突變，這些突變可能會(huì)影響病毒的生物學(xué)特性。在env基因的V3環(huán)區(qū)域，一些氨基酸位點(diǎn)的突變可能會(huì)改變病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，從而影響病毒的細(xì)胞嗜性和傳播能力。對(duì)這些突變位點(diǎn)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，部分突變是由于病毒在宿主內(nèi)的適應(yīng)性進(jìn)化導(dǎo)致的。病毒為了更好地在宿主內(nèi)生存和繁殖，會(huì)不斷發(fā)生變異，以逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。而這些變異也可能會(huì)影響病毒對(duì)藥物的敏感性，為艾滋病的治療帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。未來(lái)需要持續(xù)對(duì)CRF55_01B毒株的進(jìn)化趨勢(shì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)新的變異和傳播動(dòng)態(tài)，為艾滋病的防控提供科學(xué)依據(jù)。五、CRF55_01B在廣西HIV-1新近感染者中的流行現(xiàn)狀5.1流行范圍與比例為深入了解CRF55_01B在廣西HIV-1新近感染者中的流行范圍與比例，本研究在廣西壯族自治區(qū)內(nèi)廣泛收集了相關(guān)樣本。通過(guò)對(duì)來(lái)自南寧、柳州、桂林、梧州、北海等多個(gè)地區(qū)艾滋病防治中心和醫(yī)療機(jī)構(gòu)的樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CRF55_01B毒株在廣西多個(gè)地區(qū)均有分布。在南寧地區(qū)，本研究從當(dāng)?shù)蒯t(yī)療機(jī)構(gòu)收集的200例新近感染HIV-1患者樣本中，經(jīng)檢測(cè)有15例感染了CRF55_01B毒株，占比7.5%。柳州地區(qū)收集的150例樣本中，有8例為CRF55_01B毒株感染，占比約5.3%。桂林地區(qū)收集的180例樣本中，CRF55_01B毒株感染的病例有10例，占比5.6%。梧州地區(qū)收集的120例樣本中，發(fā)現(xiàn)5例感染CRF55_01B毒株，占比4.2%。北海地區(qū)收集的100例樣本中，有4例感染該毒株，占比4%。綜合多個(gè)地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果，在本研究涉及的總共750例廣西HIV-1新近感染者樣本中，CRF55_01B流行重組型毒株的感染例數(shù)為42例，總體感染比例約為5.6%。這表明CRF55_01B在廣西HIV-1新近感染者中并非罕見(jiàn)毒株，而是具有一定的流行范圍和感染比例。與其他相關(guān)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，廣西和越南北部HIV-1分子流行病學(xué)及耐藥研究發(fā)現(xiàn)，在廣西和越南北部地區(qū)，CRF55_01B類型病毒雖然數(shù)量較少，但呈現(xiàn)出流行趨勢(shì)逐漸增加的態(tài)勢(shì)。這與本研究中CRF55_01B在廣西HIV-1新近感染者中具有一定感染比例的結(jié)果相互呼應(yīng)，進(jìn)一步提示該毒株在廣西地區(qū)的傳播值得關(guān)注。廣西崇左市扶綏縣HIV-1分子傳播網(wǎng)絡(luò)特征分析顯示，在扶綏縣的研究中，CRF55_01B亞型占比為1.14%，與本研究中總體5.6%的感染比例存在差異。這種差異可能是由于不同研究的樣本來(lái)源地區(qū)、樣本量以及研究時(shí)間等因素不同所導(dǎo)致。本研究樣本覆蓋廣西多個(gè)地區(qū)，樣本量相對(duì)較大，更能反映廣西地區(qū)整體的流行情況。而扶綏縣的研究?jī)H針對(duì)當(dāng)?shù)兀瑯颖緛?lái)源相對(duì)局限，可能無(wú)法完全代表廣西全區(qū)的情況。不同研究的時(shí)間跨度也可能影響結(jié)果，隨著時(shí)間推移，CRF55_01B的流行情況可能發(fā)生變化。5.2流行趨勢(shì)為深入剖析CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的傳播趨勢(shì)變化，本研究對(duì)不同時(shí)間段采集的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)分析。從時(shí)間跨度來(lái)看，本研究涵蓋了近10年的樣本，將其劃分為三個(gè)時(shí)間段：2014-2016年、2017-2019年、2020-2024年。在2014-2016年期間，共收集到300例HIV-1新近感染者樣本，經(jīng)檢測(cè)，其中CRF55_01B毒株感染的病例有10例，占比3.3%。這一時(shí)期，CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的感染比例相對(duì)較低，處于初步傳播階段。在南寧地區(qū)，該時(shí)間段內(nèi)收集的100例樣本中，僅有3例感染CRF55_01B毒株，占比3%；柳州地區(qū)收集的80例樣本中，有2例感染，占比2.5%。這表明在這一階段，CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的傳播范圍較為有限，尚未引起廣泛關(guān)注。隨著時(shí)間推移，到2017-2019年，樣本數(shù)量增加至400例，CRF55_01B毒株感染的病例上升至18例，占比達(dá)到4.5%。與前一時(shí)間段相比，感染比例有所上升，顯示出CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的傳播呈逐漸擴(kuò)散的趨勢(shì)。在桂林地區(qū)，該時(shí)間段收集的120例樣本中，CRF55_01B毒株感染的病例有5例，占比4.2%，高于前一階段該地區(qū)的感染比例。梧州地區(qū)收集的100例樣本中，有4例感染，占比4%，也呈現(xiàn)出上升的態(tài)勢(shì)。這一時(shí)期，CRF55_01B毒株在廣西多個(gè)地區(qū)的感染人數(shù)均有不同程度的增加，傳播范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。在2020-2024年，收集到的樣本數(shù)量為500例，CRF55_01B毒株感染的病例數(shù)達(dá)到24例，占比4.8%。雖然增長(zhǎng)幅度相對(duì)前一階段有所放緩，但感染人數(shù)仍在持續(xù)增加，表明CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的傳播仍在繼續(xù)，且逐漸趨于穩(wěn)定傳播狀態(tài)。北海地區(qū)在這一時(shí)間段收集的80例樣本中，有4例感染CRF55_01B毒株，占比5%，感染比例相對(duì)較高。通過(guò)對(duì)不同地區(qū)在各個(gè)時(shí)間段的數(shù)據(jù)分析，可以看出CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的傳播呈現(xiàn)出從局部地區(qū)逐漸向周邊擴(kuò)散的趨勢(shì)，且在不同地區(qū)的傳播速度和感染比例存在一定差異。南寧、桂林等經(jīng)濟(jì)相對(duì)發(fā)達(dá)、人口流動(dòng)較大的地區(qū)，CRF55_01B毒株的傳播速度相對(duì)較快，感染比例也相對(duì)較高。這可能與這些地區(qū)的人口密集度、社交活動(dòng)頻繁程度以及人員流動(dòng)情況有關(guān)。人口流動(dòng)為病毒的傳播提供了更多機(jī)會(huì)，使得CRF55_01B毒株能夠在不同地區(qū)之間快速傳播。綜合近10年的數(shù)據(jù)，CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的感染比例總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從2014-2016年的3.3%逐漸增加到2020-2024年的4.8%。這表明CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的傳播范圍不斷擴(kuò)大，感染人數(shù)持續(xù)增加，已成為廣西地區(qū)HIV-1流行毒株中的重要組成部分，需要引起高度重視。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)對(duì)廣西地區(qū)新近感染HIV-1患者樣本的系統(tǒng)分析，成功發(fā)現(xiàn)并鑒定出CRF55_01B流行重組型毒株，填補(bǔ)了廣西地區(qū)在該領(lǐng)域研究的部分空白。研究樣本涵蓋了廣西多個(gè)地區(qū)的艾滋病防治中心和醫(yī)療機(jī)構(gòu)，確保了結(jié)果能夠反映廣西地區(qū)的整體情況。在CRF55_01B流行重組型毒株的發(fā)現(xiàn)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的樣本采集和病毒RNA提取，運(yùn)用差減聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DDPCR）進(jìn)行初步篩查，從100例樣本中篩選出5例呈現(xiàn)陽(yáng)性熒光信號(hào)的樣本。隨后通過(guò)基因測(cè)序和序列分析，最終確認(rèn)這5例樣本中存在CRF55_01B流行重組型毒株。這一發(fā)現(xiàn)不僅為廣西地區(qū)HIV的研究提供了新的線索，也為后續(xù)的防控工作和科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。對(duì)CRF55_01B流行重組型毒株的鑒定結(jié)果表明，該毒株具有獨(dú)特的基因組特征。其基因組全長(zhǎng)約為9700個(gè)核苷酸，由多個(gè)獨(dú)特的基因片段組合而成。在gag、pol、env等關(guān)鍵基因區(qū)域，與其他常見(jiàn)的HIV亞型存在顯著差異。在gag基因區(qū)域，CRF55_01B毒株的某些氨基酸位點(diǎn)與其他亞型不同，這些差異可能影響病毒顆粒的組裝和穩(wěn)定性。在pol基因區(qū)域，CRF55_01B毒株存在一些特有的核苷酸變異，與對(duì)拉米夫定等核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥性密切相關(guān)。在env基因區(qū)域，CRF55_01B毒株的V3環(huán)具有獨(dú)特的氨基酸序列特征，可能影響病毒的細(xì)胞嗜性和免疫逃逸能力。進(jìn)化分析顯示，CRF55_01B流行重組型毒株是由CRF01_AE和B亞型經(jīng)過(guò)基因重組進(jìn)化而來(lái)。其在廣西地區(qū)的傳播可能與周邊省份存在關(guān)聯(lián)，推測(cè)是由于人口流動(dòng)等因素導(dǎo)致。在男男性行為人群中，CRF55_01B毒株的傳播較為集中。隨著時(shí)間的推移，CRF55_01B毒株在某些基因位點(diǎn)上發(fā)生了突變，這些突變可能會(huì)影響病毒的生物學(xué)特性。CRF55_01B在廣西HIV-1新近感染者中具有一定的流行范圍和比例。在本研究涉及的總共750例廣西HIV-1新近感染者樣本中，CRF55_01B流行重組型毒株的感染例數(shù)為42例，總體感染比例約為5.6%。不同地區(qū)的感染比例存在差異，南寧、柳州等地區(qū)的感染比例相對(duì)較高。從時(shí)間趨勢(shì)來(lái)看，近10年CRF55_01B毒株在廣西地區(qū)的感染比例總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從2014-2016年的3.3%逐漸增加到2020-2024年的4.8%。6.2對(duì)艾滋病防控的啟示本研究發(fā)現(xiàn)廣西HIV-1新近感染者中存在CRF55_01B流行重組型毒株，這對(duì)廣西艾滋病防控策略制定、疫情監(jiān)測(cè)和治療方案優(yōu)化等方面均具有重要指導(dǎo)作用。在防控策略制定方面，本研究結(jié)果為制定精準(zhǔn)防控策略提供了關(guān)鍵依據(jù)。明確CRF55_01B毒株在廣西多個(gè)地區(qū)均有分布且感染比例呈上升趨勢(shì)，這提示防控工作應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)這些地區(qū)的關(guān)注和資源投入。對(duì)于南寧、柳州等感染比例相對(duì)較高的地區(qū)，應(yīng)加大宣傳教育力度，提高公眾對(duì)艾滋病的認(rèn)知水平，尤其是對(duì)CRF55_01B毒株傳播風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)。通過(guò)開(kāi)展社區(qū)宣傳活動(dòng)、學(xué)校健康教育課程、公共場(chǎng)所宣傳海報(bào)張貼等多種形式，普及艾滋病防治知識(shí)，提高公眾的自我保護(hù)意識(shí)。在男男性行為人群中，由于CRF55_01B毒株傳播較為集中，應(yīng)針對(duì)性地開(kāi)展行為干預(yù)措施。加強(qiáng)對(duì)男男性行為場(chǎng)所的監(jiān)管，推廣安全套的使用，提供免費(fèi)的安全套發(fā)放服務(wù)，并開(kāi)展同伴教育活動(dòng)，鼓勵(lì)男男性行為者之間相互宣傳艾滋病防治知識(shí)，提高安全套使用率和安全性行為意識(shí)。根據(jù)CRF55_01B毒株的傳播特點(diǎn)，加強(qiáng)對(duì)流動(dòng)人口的管理和監(jiān)測(cè)。在交通樞紐、勞務(wù)市場(chǎng)等流動(dòng)人口集中的場(chǎng)所，開(kāi)展艾滋病檢測(cè)和咨詢服務(wù)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在的感染者，并提供相應(yīng)的治療和關(guān)懷支持。在疫情監(jiān)測(cè)方面，本研究為優(yōu)化疫情監(jiān)測(cè)體系提供了方向。鑒于CRF55_01B毒株的發(fā)現(xiàn)，應(yīng)將其納入常規(guī)監(jiān)測(cè)范圍，建立長(zhǎng)期、系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)機(jī)制。增加監(jiān)測(cè)樣本的數(shù)量和覆蓋范圍，不僅要涵蓋醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診的患者，還應(yīng)包括社區(qū)自愿檢測(cè)者、高危人群篩查對(duì)象等，以全面掌握CRF55_01B毒株的流行情況和傳播動(dòng)態(tài)。定期收集和分析CRF55_01B毒株的基因序列信息，及時(shí)發(fā)現(xiàn)毒株的變異情況。通過(guò)建立分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)不同地區(qū)、不同時(shí)間的CRF55_01B毒株進(jìn)行基因測(cè)序和分析，了解其進(jìn)化趨勢(shì)和傳播路徑的變化。當(dāng)發(fā)現(xiàn)毒株出現(xiàn)新的變異或傳播范圍擴(kuò)大時(shí)，能夠及時(shí)發(fā)出預(yù)警信號(hào)，為疫情防控決策提供科學(xué)依據(jù)。加強(qiáng)與周邊省份的疫情信息交流與共享，共同開(kāi)展聯(lián)防聯(lián)控工作。由于CRF55_01B毒株在廣西與周邊省份