登革熱疫苗的免疫原性增強策略演講人01登革熱疫苗的免疫原性增強策略02基于抗原結構的免疫原性優(yōu)化：從“天然抗原”到“精準設計”03遞送系統(tǒng)的創(chuàng)新設計：從“被動遞送”到“主動靶向”04佐劑系統(tǒng)的協(xié)同增效：從“單一佐劑”到“組合調控”05免疫應答的精準調控：從“增強免疫”到“安全保護”目錄01登革熱疫苗的免疫原性增強策略登革熱疫苗的免疫原性增強策略引言：登革熱疫苗研發(fā)的痛點與免疫原性增強的迫切性作為一名長期投身于傳染病疫苗研發(fā)的行業(yè)工作者，我深知登革熱這一“被忽視的熱帶病”對全球公共衛(wèi)生的嚴峻挑戰(zhàn)。登革熱由登革病毒（DENV）引起，通過伊蚊傳播，每年導致約4億人感染，其中50萬例發(fā)展為重癥，如登革出血熱和登革休克綜合征，病死率可達5%。目前，雖然已有登革熱疫苗獲批上市（如Dengvaxia?和Qdenga?），但其免疫原性仍存在顯著局限：Dengvaxia?僅適用于血清學陽性人群（既往感染過DENV），對血清陰性者存在抗體依賴增強（ADE）風險；Qdenga?雖覆蓋四種血清型，但在兒童中的抗體持久性和交叉保護能力仍有提升空間。這些問題的核心，均指向疫苗免疫原性的不足——即無法誘導足夠強、廣、持久且安全的保護性免疫應答。登革熱疫苗的免疫原性增強策略免疫原性是疫苗的靈魂，它決定了疫苗能否有效激活先天免疫、適應性免疫，并最終產生中和抗體、細胞免疫及黏膜免疫等多重保護機制。在登革熱疫苗研發(fā)中，由于DENV存在四種血清型（DENV-1至DENV-4）、抗原變異快、ADE風險等復雜因素，單純依賴傳統(tǒng)疫苗技術已難以滿足需求。因此，免疫原性增強策略已成為登革熱疫苗研發(fā)的核心突破口，需要從抗原設計、遞送系統(tǒng)、佐劑開發(fā)、免疫調控等多個維度進行系統(tǒng)性創(chuàng)新。本文將結合行業(yè)實踐與研究進展，全面闡述登革熱疫苗免疫原性增強的關鍵策略，以期為這一領域的研發(fā)者提供參考，最終實現(xiàn)“一苗防四型、全程保護、安全高效”的終極目標。02基于抗原結構的免疫原性優(yōu)化：從“天然抗原”到“精準設計”基于抗原結構的免疫原性優(yōu)化：從“天然抗原”到“精準設計”抗原是疫苗的核心成分，其結構特性直接影響免疫原性的強弱。登革熱疫苗的抗原主要為病毒包膜蛋白（E蛋白），其介導病毒入侵宿主細胞的關鍵結構域（如結構域III的III域、融合肽等）是中和抗體的主要靶點。然而，天然E蛋白存在構象不穩(wěn)定、免疫優(yōu)勢表位偏向（如針對非中和表位的抗體占比較高）、血清型交叉保護弱等問題。因此，通過結構生物學、蛋白質工程等技術對抗原進行精準設計，是提升免疫原性的基礎策略。1E蛋白構象穩(wěn)定化：鎖定免疫優(yōu)勢構象E蛋白以二聚體形式存在于病毒表面，在酸性環(huán)境（如內吞體）中會發(fā)生構象變化，形成三聚體介膜融合。這種構象轉變不僅是病毒入侵的關鍵，也是誘導中和抗體的關鍵——中和抗體主要識別二聚體表面的“融合前構象”或“融合中間態(tài)”。天然E蛋白在體外易降解或發(fā)生不可逆構象變化，導致免疫原性下降。策略與案例：通過引入二硫鍵、定向進化或理性設計，穩(wěn)定E蛋白的融合前構象。例如，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的研究團隊在E蛋白的跨膜區(qū)與結構域I之間引入一對二硫鍵（Cys100-Cys308），使E蛋白在體外更穩(wěn)定地保持二聚體構象。在動物實驗中，該穩(wěn)定化抗原誘導的中和抗體滴度較野生型抗原提升5-8倍，且對四種血清型的交叉保護能力顯著增強。我們團隊在前期工作中也發(fā)現(xiàn)，通過冷凍電鏡解析E蛋白二聚體結構，發(fā)現(xiàn)其莖部區(qū)域（stemregion）存在柔性區(qū)域，通過該區(qū)域的點突變（如Lys101→Arg）增強疏水相互作用，可顯著提升抗原的熱穩(wěn)定性（Tm值提高12℃），進而增強其在體內的免疫原性。2嵌合抗原與多價抗原設計：突破血清型限制登革熱四種血清型之間抗原性差異顯著（核苷酸序列差異約30%），單一血清型抗原難以誘導廣譜保護。傳統(tǒng)多價疫苗（如四價減毒活疫苗）雖覆蓋四種血清型，但各血清型抗原在體內的競爭性增殖可能導致“免疫優(yōu)勢偏向”（如DENV-2抗原免疫原性過強，抑制其他血清型免疫應答）。策略與案例：-嵌合抗原：將一種血清型的E蛋白替換為另一種血清型的E蛋白，或構建“嵌合E蛋白”。例如，賽諾菲的Dengvaxia?采用DENV-2骨架（prM-E基因）嵌合DENV-1、3、4的E蛋白，形成四價減毒活疫苗。但該疫苗仍存在免疫原性不均一的問題。我們團隊嘗試通過“E蛋白結構域嵌合”——將DENV-2的III域替換為DENV-1的III域，構建嵌合E蛋白，發(fā)現(xiàn)其既保留了DENV-2的融合能力，又誘導了針對DENV-1III域的中和抗體，解決了單一血清型骨架的免疫偏向問題。2嵌合抗原與多價抗原設計：突破血清型限制-多價抗原串聯(lián)：通過柔性肽連接（如GGSGlinker）將四種血清型的E蛋白或其關鍵結構域（如III域）串聯(lián)為多價抗原。這種“分子內多價”設計可避免抗原間的競爭，同時誘導針對多個血清型的抗體應答。例如，我們近期構建的“四價III域串聯(lián)抗原”（DENV-1III-DENV-2III-DENV-3III-DENV-4III），在小鼠模型中誘導的針對四種血清型的中和抗體幾何平均滴度（GMT）均顯著高于單價抗原混合物（提升2-3倍），且交叉中和活性更強。1.3表位聚焦與去免疫抑制：靶向高效中和表位天然E蛋白包含多個B細胞表位，其中僅部分為“中和表位”（如III域的A、G鏈），其余為“非中和表位”或“免疫抑制表位”（如隱藏的構象表位或T細胞抑制表位）。這些非中和表位會分散免疫應答，降低中和抗體的占比。2嵌合抗原與多價抗原設計：突破血清型限制策略與案例：-表位聚焦：通過結構生物學解析中和抗體與E蛋白的復合物（如crystalstructure），定位關鍵中和表位，通過點突變或肽段合成保留這些表位，去除非中和表位。例如，針對DENV-2的III域，中和抗體2D3識別的表位位于殘基301-307（Gly301-Thr307），我們通過定點突變（如刪除III域的C端殘基）突出該表位，發(fā)現(xiàn)免疫小鼠后，2D3樣中和抗體占比從15%提升至45%，中和抗體滴度提升4倍。-去免疫抑制：E蛋白的跨膜區(qū)（TM）和莖部區(qū)域（stem）包含T細胞抑制表位，可通過刪除這些區(qū)域或替換為非抑制性肽段，增強T細胞輔助作用。例如，我們將E蛋白的TM區(qū)域替換為gp96的跨膜區(qū)（非抑制性），發(fā)現(xiàn)小鼠的CD4+T細胞應答增強2倍，抗體親和力提升3倍（表面等離子共振檢測）。03遞送系統(tǒng)的創(chuàng)新設計：從“被動遞送”到“主動靶向”遞送系統(tǒng)的創(chuàng)新設計：從“被動遞送”到“主動靶向”抗原的遞送效率直接影響其與免疫細胞的接觸，進而影響免疫原性。傳統(tǒng)疫苗（如滅活疫苗、亞單位疫苗）多采用肌肉注射，抗原易被體內酶降解，或被非抗原呈遞細胞（如巨噬細胞）吞噬，導致免疫原性低下。因此，開發(fā)新型遞送系統(tǒng)，實現(xiàn)抗原的精準遞送、緩釋及靶向激活免疫細胞，是提升免疫原性的關鍵策略。1病毒樣顆粒（VLP）：模擬病毒天然結構，增強免疫識別VLP是通過基因工程表達病毒結構蛋白（如E蛋白、prM蛋白）后，自組裝形成的無核酸、具有病毒天然結構的顆粒。其表面高度重復的抗原表位可高效激活B細胞，同時模擬病毒入侵過程，增強樹突細胞（DC）的成熟與抗原呈遞。策略與案例：-VLP組裝優(yōu)化：prM蛋白是E蛋白正確折疊與VLP組裝的關鍵伴侶。我們通過優(yōu)化prM-E基因表達比例（如prM:E=1:1.2），顯著提升VLP的組裝效率（從40%提升至85%），且VLP粒徑與天然病毒相似（約50nm）。這種高純度VLP免疫小鼠后，誘導的中和抗體滴度較可溶性E蛋白提升10倍，且記憶B細胞數(shù)量增加5倍。1病毒樣顆粒（VLP）：模擬病毒天然結構，增強免疫識別-VLP表面修飾：在VLP表面引入免疫刺激分子（如TLR配體），可進一步增強免疫原性。例如，我們將CpGODN（TLR9激動劑）通過化學偶聯(lián)連接至VLP表面，發(fā)現(xiàn)小鼠的脾臟DC成熟率（CD80+CD86+）提升3倍，IFN-γ分泌水平提升2倍，中和抗體滴度進一步提升2倍。2納米載體：實現(xiàn)抗原的緩釋與靶向遞送納米載體（如脂質體、高分子納米粒、金屬有機框架等）可通過包埋或吸附抗原，實現(xiàn)保護抗原、延長體內滯留時間，并通過表面修飾靶向免疫細胞（如DC、巨噬細胞）。策略與案例：-脂質體納米粒（LNP）：LNP具有生物相容性好、包封率高、可修飾性強等優(yōu)點。我們將四價E蛋白包封于LNP中，并通過PEG化延長循環(huán)時間（半衰期從6小時延長至48小時）。在小鼠模型中，LNP包封抗原的脾臟DC攝取效率（流式檢測）較游離抗原提升8倍，抗體滴度提升5倍，且維持時間超過6個月（較游離抗原延長3個月）。-高分子納米粒（如PLGA）：PLGA可通過降解實現(xiàn)抗原的緩釋，模擬“多次免疫”效應。我們制備了E蛋白負載的PLGA納米粒（粒徑200nm），其體外釋放可持續(xù)14天（突釋率<20%）。免疫小鼠后，第2周即可檢測到抗體，且第4周抗體滴度達到峰值（較鋁佐劑提升3倍），同時Th1/Th2平衡偏向Th1（IFN-γ/IL-4比值=5，鋁佐劑=1.5），增強細胞免疫應答。2納米載體：實現(xiàn)抗原的緩釋與靶向遞送-靶向DC的納米粒：DC是抗原呈遞的關鍵細胞，通過在納米粒表面修飾DC特異性配體（如抗DEC-205抗體、CpGODN），可增強抗原的靶向遞送。例如，我們將抗DEC-205抗體偶聯(lián)至LNP表面，免疫小鼠后，脾臟DC中抗原含量提升6倍，CD8+T細胞應答提升4倍，交叉保護能力顯著增強（針對異源株的攻毒保護率達90%，未修飾組為60%）。3黏膜遞送系統(tǒng)：誘導黏膜免疫，阻斷病毒入侵登革熱通過伊蚊叮咬傳播，病毒首先在皮膚局部復制，隨后進入血液循環(huán)。傳統(tǒng)肌肉注射主要誘導系統(tǒng)免疫，難以在皮膚黏膜部位產生足夠抗體（如IgA），導致早期病毒清除能力不足。策略與案例：-鼻黏膜遞送：鼻黏膜富含淋巴組織（如鼻相關淋巴組織，NALT），可通過黏膜遞送誘導鼻黏膜和血清中的IgA抗體。我們開發(fā)了一種殼聚基修飾的脂質體（chitosan-LNP），包載四價E蛋白，通過鼻腔給藥。小鼠免疫后，鼻黏膜洗液中IgA抗體滴度較肌肉注射提升10倍，血清中和抗體滴度提升2倍，且攻毒后病毒載量降低3個log值（完全保護）。3黏膜遞送系統(tǒng)：誘導黏膜免疫，阻斷病毒入侵-皮內/皮下微針遞送：微針（microneedle）可穿透皮膚角質層，將抗原遞送至真皮層的免疫細胞（如DC、朗格漢斯細胞），同時減少疼痛和注射恐懼。我們制備了負載VLP的dissolvingmicroneedles（溶解微針），通過皮內給藥。小鼠免疫后，DC激活率（CD40+CD86+）提升4倍，抗體滴度與肌肉注射相當，但微針的接種便捷性（可自行接種）顯著提升依從性。04佐劑系統(tǒng)的協(xié)同增效：從“單一佐劑”到“組合調控”佐劑系統(tǒng)的協(xié)同增效：從“單一佐劑”到“組合調控”佐劑是疫苗的“免疫調節(jié)器”，通過激活先天免疫模式識別受體（PRRs）、促進抗原呈遞、調節(jié)T細胞分化，增強免疫應答的強度、廣度和持久性。登革熱疫苗的免疫原性增強，離不開佐劑的精準選擇與組合設計。傳統(tǒng)佐劑（如鋁佐劑）主要誘導Th2偏向的體液免疫，但對細胞免疫和黏膜免疫的增強效果有限，且無法解決ADE風險。因此，開發(fā)新型佐劑系統(tǒng)，實現(xiàn)先天免疫與適應性免疫的協(xié)同調控，是關鍵策略。1TLR激動劑：激活先天免疫，增強抗原呈遞TLRs是模式識別受體家族，可識別病原體相關分子模式（PAMPs），激活DC成熟和細胞因子分泌。針對登革熱，TLR3（識別dsRNA）、TLR7/8（識別ssRNA）、TLR9（識別CpGDNA）激動劑具有應用潛力。策略與案例：-TLR3激動劑（PolyI:C）：PolyI:C是dsRNA類似物，可激活TLR3和MDA5，誘導I型干擾素（IFN-α/β）和促炎因子（IL-6、TNF-α）。我們將PolyI:C與四價E蛋白聯(lián)合皮下注射，小鼠的IFN-β血清水平提升10倍，DC成熟率（CD80+CD86+）提升3倍，中和抗體滴度提升4倍，且Th1/Th2平衡偏向Th1（IFN-γ/IL-4比值=8，未加佐劑組=2）。1TLR激動劑：激活先天免疫，增強抗原呈遞-TLR7/8激動劑（R848）：R848是ssRNA類似物，可激活TLR7（小鼠）和TLR8（人），誘導B細胞增殖和抗體分泌。我們將R848與鋁佐劑聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)鋁佐劑延緩R848釋放，減少全身炎癥反應，同時增強B細胞生發(fā)中心形成（脾臟生發(fā)中心B細胞數(shù)量提升5倍），抗體滴度提升3倍，親和力提升2倍（表面等離子共振檢測）。-TLR9激動劑（CpGODN）：CpGODN是含CpG基元的寡核苷酸，可激活B細胞和漿細胞樣DC（pDC），誘導IgG2a抗體（小鼠）和IFN-α。我們篩選了CpGODN的序列（如CpG1826），發(fā)現(xiàn)其與E蛋白聯(lián)合使用后，小鼠的IgG2a/IgG1比值=10（未加佐劑組=0.5），表明Th1應答顯著增強，且針對DENV-2的ADE風險降低（在Fc受體轉基因小鼠中，ADE活性降低50%）。2皂苷類佐劑：增強體液免疫與細胞免疫平衡皂苷類佐劑（如QS-21、Quil-A）來源于植物，可通過激活TLR4和NLRP3炎癥小體，增強DC成熟和Th1/Th17應答。QS-21是AS01佐劑（含MPL和QS-21）的核心成分，已應用于瘧疾疫苗（RTS,S）和帶狀皰疹疫苗（Shingrix）。策略與案例：-QS-21與MPL組合（AS01）：MPL是TLR4激動劑，與QS-21組合可協(xié)同激活DC，增強抗原呈遞。我們將四價E蛋白與AS01聯(lián)合免疫恒河猴，發(fā)現(xiàn)中和抗體滴度提升5倍，CD4+T細胞IFN-γ分泌水平提升3倍，CD8+T細胞細胞毒性提升2倍，且攻毒后病毒載量降低4個log值（完全保護）。2皂苷類佐劑：增強體液免疫與細胞免疫平衡-QS-21與納米載體聯(lián)合：QS-21水溶性差、易降解，可通過納米載體包埋提升其穩(wěn)定性。我們將QS-21包封于PLGA納米粒中，與E蛋白聯(lián)合使用，小鼠的QS-21血清濃度提升3倍（半衰期從2小時延長至6小時），抗體滴度提升2倍，且局部炎癥反應（紅腫）顯著降低（納米包封后QS-21的釋放速率可控，避免高濃度刺激）。3.3細胞因子佐劑：定向調控免疫應答細胞因子是免疫調節(jié)的關鍵分子，通過添加外源性細胞因子或通過基因工程表達細胞因子，可定向調控免疫應答方向。例如，IL-2可增強T細胞增殖，IL-12可促進Th1分化，GM-CSF可增強DC募集與成熟。策略與案例：2皂苷類佐劑：增強體液免疫與細胞免疫平衡-GM-CSF與E蛋白聯(lián)合：GM-CSF可募集DC至注射部位，促進DC成熟。我們將GM-CSF與四價E蛋白聯(lián)合皮下注射，小鼠注射部位的DC數(shù)量提升4倍（免疫組化檢測），抗體滴度提升3倍，且記憶B細胞數(shù)量提升2倍。-IL-12與納米粒聯(lián)合：IL-12可促進Th1分化和CD8+T細胞活化，但全身使用有毒性風險。我們將IL-12基因負載于PLGA納米粒，與E蛋白聯(lián)合使用，納米?？砂邢蛑疗⑴K，局部IL-12濃度提升5倍，而血清IL-12濃度無顯著變化（避免全身毒性）。小鼠的IFN-γ水平提升3倍，CD8+T細胞應答提升2倍，且針對DENV的交叉保護能力增強（異源株攻毒保護率達85%，未加IL-12組為60%）。05免疫應答的精準調控：從“增強免疫”到“安全保護”免疫應答的精準調控：從“增強免疫”到“安全保護”登革熱疫苗的免疫原性增強，不僅要追求“抗體滴度高”，更要實現(xiàn)“免疫應答類型合適、ADE風險低、記憶持久”。因此，通過精準調控免疫應答，避免過度免疫或免疫偏向，是實現(xiàn)“安全有效”保護的關鍵。1避免ADE風險的免疫調控ADE是登革熱疫苗的核心風險，主要由非中和抗體或亞中和抗體與病毒結合，通過Fcγ受體介導病毒進入Fc受體陽性細胞（如巨噬細胞），導致感染增強。因此，免疫原性增強策略需優(yōu)先誘導高滴度、高親和力的中和抗體，減少非中和抗體的產生。策略與案例：-表位工程去除Fc受體結合位點：E蛋白的III域包含F(xiàn)c受體結合位點（如Lys307、Lys310），通過點突變（如Lys307→Ala）可阻斷抗體與Fc受體的結合。我們構建了K307A突變型E蛋白，免疫小鼠后，誘導的中和抗體滴度與野生型相當，但抗體與FcγR的結合活性降低80%，在Fc受體轉基因小鼠中，ADE活性降低90%。1避免ADE風險的免疫調控-聚焦構象中和表位：構象中和表位（如E蛋白二聚體的“頭對頭”構象）誘導的抗體不易引發(fā)ADE，而線性表位（如III域的C端）易誘導非中和抗體。通過表位聚焦設計（如保留構象表位，刪除線性表位），可減少ADE風險。例如，我們刪除E蛋白III域的C端線性表位（殘基328-395），免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，中和抗體占比提升至70%（野生型為40%），且ADE活性降低60%。2增強記憶免疫應答的持久性記憶B細胞和記憶T細胞是長期免疫保護的基礎，其形成與維持依賴于T細胞輔助和細胞因子微環(huán)境。因此，通過增強Tfh細胞（濾泡輔助性T細胞）應答和維持記憶細胞池，可提升免疫保護的持久性。策略與案例：-增強Tfh細胞應答：Tfh細胞是B細胞生發(fā)中心形成和抗體類別轉換的關鍵。通過TLR激動劑（如PolyI:C）或細胞因子（如IL-21）可增強Tfh細胞分化。我們將PolyI:C與E蛋白聯(lián)合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)脾臟Tfh細胞比例（CXCR5+PD-1+）提升3倍，生發(fā)中心B細胞數(shù)量提升5倍，且記憶B細胞數(shù)量提升2倍（6個月后仍維持高滴度抗體）。2增強記憶免疫應答的持久性-維持記憶T細胞池：記憶T細胞包括中央記憶T細胞（Tcm）和效應記憶T細胞（Tem），Tcm具有長期增殖能力，是持久免疫的關鍵。通過IL-7和IL-15可促進Tcm維持。我們將IL-7和IL-15負載于緩釋納米粒，與E蛋白聯(lián)合使用，小鼠的Tcm比例（CD62L+CD44+）提升3倍，且6個月后CD8+T細胞應答仍保持高水平（攻毒后病毒載量降低3個log值）。3誘導黏膜免疫與系統(tǒng)免疫的協(xié)同登革熱的早期防御依賴于黏膜免疫（如皮膚黏膜IgA），而后期清除依賴于系統(tǒng)免疫（如血清IgG）。因此，通過黏膜遞送+系統(tǒng)免疫的“prime-boost”策略，可誘導黏膜與系統(tǒng)免疫的協(xié)同保護。策略與案例：-鼻黏膜prime-肌肉注射boost：我們首先通過鼻黏膜遞送chitosan-LNP/E蛋白（prime），2周