真菌性皮膚病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)演講人01真菌性皮膚病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)真菌性皮膚病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)作為一名長(zhǎng)期從事臨床真菌學(xué)檢驗(yàn)與診斷的工作者，我深刻體會(huì)到真菌性皮膚病實(shí)驗(yàn)室診斷在臨床決策中的核心價(jià)值。真菌性皮膚病是由致病性真菌侵犯皮膚、毛發(fā)、甲板等組織引起的感染性疾病，其種類繁多、臨床表現(xiàn)復(fù)雜，從淺部的手足癬、體股癬到深部的著色真菌病、孢子絲菌病，甚至危及生命的系統(tǒng)性真菌感染，均依賴實(shí)驗(yàn)室檢查明確病原學(xué)診斷。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)已從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢查發(fā)展為集培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等多技術(shù)聯(lián)動(dòng)的綜合診斷體系。本文將結(jié)合臨床實(shí)踐，系統(tǒng)闡述真菌性皮膚病實(shí)驗(yàn)室診斷的技術(shù)原理、操作規(guī)范、結(jié)果判讀及臨床應(yīng)用，旨在為同行提供一套嚴(yán)謹(jǐn)、全面、可操作的診斷思路。02真菌性皮膚病實(shí)驗(yàn)室診斷的概述與臨床意義真菌性皮膚病的流行病學(xué)與病原學(xué)特征真菌性皮膚病是全球范圍內(nèi)常見的感染性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，淺部真菌病感染率高達(dá)20%-25%，其中皮膚癬菌（如紅色毛癬菌、須癬毛癬菌）是最主要的致病菌，占淺部感染的80%以上；深部真菌病雖相對(duì)少見，但病死率可達(dá)30%-50%，以念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬為主。值得注意的是，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑及生物制劑的廣泛應(yīng)用，機(jī)會(huì)性真菌感染（如馬爾尼菲籃菌、光滑念珠菌）的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室診斷的及時(shí)性和準(zhǔn)確性提出了更高要求。實(shí)驗(yàn)室診斷的核心價(jià)值真菌性皮膚病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，如體股癬與濕疹、接觸性皮炎等易混淆，甲癬與銀屑病甲、甲營(yíng)養(yǎng)不良等難以區(qū)分，僅憑臨床經(jīng)驗(yàn)誤診率可達(dá)30%-40%。實(shí)驗(yàn)室診斷通過直接鏡檢找到菌絲/孢子、培養(yǎng)分離出病原菌或檢測(cè)真菌特異性成分，可明確感染類型、鑒定菌種并指導(dǎo)抗真菌藥物選擇，是臨床確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”。例如，通過培養(yǎng)鑒定出紅色毛癬菌對(duì)特比萘芬敏感，而斷發(fā)毛癬菌對(duì)特比萘芬天然耐藥，這一結(jié)果直接影響治療方案的選擇；對(duì)于深部真菌病，早期通過G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)等免疫學(xué)檢測(cè)陽性，可搶先啟動(dòng)抗真菌治療，顯著改善患者預(yù)后。實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的演進(jìn)方向傳統(tǒng)真菌診斷技術(shù)（如直接鏡檢、培養(yǎng)）雖操作簡(jiǎn)單、成本低廉，但存在敏感度低、耗時(shí)長(zhǎng)等局限。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)（如PCR、測(cè)序）、質(zhì)譜技術(shù)（如MALDI-TOFMS）及人工智能輔助判讀系統(tǒng)的應(yīng)用，顯著提升了診斷的效率和準(zhǔn)確性。當(dāng)前，真菌性皮膚病的實(shí)驗(yàn)室診斷已進(jìn)入“多技術(shù)聯(lián)合、快速精準(zhǔn)”的新階段，但仍需強(qiáng)調(diào)“形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)、培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)、新技術(shù)為補(bǔ)充”的綜合診斷原則，避免單一技術(shù)的局限性。03標(biāo)本采集與處理：實(shí)驗(yàn)室診斷的“第一關(guān)口”標(biāo)本采集與處理：實(shí)驗(yàn)室診斷的“第一關(guān)口”標(biāo)本的質(zhì)量直接決定實(shí)驗(yàn)室診斷的準(zhǔn)確性，不規(guī)范的采集、運(yùn)輸或處理可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，誤導(dǎo)臨床決策。因此，規(guī)范的標(biāo)本采集與處理是真菌性皮膚病實(shí)驗(yàn)室診斷的首要環(huán)節(jié)。不同類型標(biāo)本的采集方法皮損標(biāo)本（1）鱗屑、痂皮：對(duì)于丘疹、水皰、鱗屑性皮損，用無菌手術(shù)刀或刮匙輕輕刮取皮損邊緣的活動(dòng)性鱗屑或痂皮，避免取陳舊性或角化過厚的組織（如足跟部的厚鱗屑，真菌量少且不易檢出）。例如，采集足癬鱗屑時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)刮取趾間浸漬發(fā)白的皮損處，而非足底干燥的角質(zhì)層。（2）水皰皰液：用無菌注射器抽取皰液（若皰液較少，可刺破皰壁后用棉簽蘸取），皰液中真菌含量較高，是直接鏡檢和培養(yǎng)的理想標(biāo)本。（3）潰瘍、糜爛面：用無菌棉拭子輕輕擦拭潰瘍基部的分泌物或滲出液，避免接觸表面的膿性痂皮；若潰瘍較深，可用無菌剪刀剪取少量邊緣組織，置于無菌容器中送檢。不同類型標(biāo)本的采集方法毛發(fā)標(biāo)本（1）病發(fā)：用鑷子拔取病發(fā)（非剪斷），應(yīng)取接近頭皮或毛囊處的毛發(fā)（真菌多侵犯毛根部位），若為黑癬，可見毛發(fā)折斷處有菌鞘包裹；黃癬則取黃癬痂下的病發(fā)。拔取的毛發(fā)應(yīng)分別裝入無菌紙袋，避免交叉污染。不同類型標(biāo)本的采集方法甲板標(biāo)本（1）甲屑：先用酒精棉片消毒病甲，再用無菌手術(shù)刀或銼刀研磨病甲游離緣（甲板表面）或甲床（甲板下），取細(xì)碎甲屑送檢。甲癬患者甲板下的真菌量顯著高于表面，因此應(yīng)重點(diǎn)刮取甲板與甲床交界處的甲屑。不同類型標(biāo)本的采集方法組織標(biāo)本（1）皮膚組織：對(duì)于深部真菌?。ㄈ缰婢　㈡咦咏z菌?。┗蛞伤葡到y(tǒng)性真菌感染，需行皮膚活檢，取皮損全層組織（包括表皮、真皮及皮下脂肪），置于無菌容器中，部分組織用于病理檢查（HE染色或PAS染色），部分用于培養(yǎng)。標(biāo)本的保存與運(yùn)輸1.立即送檢：標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送檢（≤2小時(shí)），避免長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致真菌死亡或污染。若無法及時(shí)送檢，鱗屑、甲屑等可置于無菌干燥容器中，4℃保存（≤24小時(shí)）；皰液、組織標(biāo)本需冷藏（2-8℃），但不宜冷凍（冷凍可破壞真菌結(jié)構(gòu)，影響培養(yǎng)結(jié)果）。2.防止污染：標(biāo)本采集過程中需嚴(yán)格無菌操作，避免正常皮膚菌群（如表皮葡萄球菌、棒狀桿菌）污染；不同部位標(biāo)本應(yīng)分裝標(biāo)記，注明采集部位、臨床診斷及采集時(shí)間。標(biāo)本的預(yù)處理1.鱗屑、甲屑的預(yù)處理：將標(biāo)本置于無菌平皿中，加入10%KOH溶液1-2滴，浸泡5-10分鐘，使角質(zhì)蛋白溶解，便于鏡下觀察菌絲/孢子。若標(biāo)本油脂較多（如頭皮脂溢部位），可先用二甲苯脫脂，再用KOH處理。2.組織標(biāo)本的預(yù)處理：活檢組織先用無菌生理鹽水沖洗血污，剪成1-2mm3小碎塊，一部分用于勻漿后接種培養(yǎng)基，一部分用于病理切片。04直接鏡檢：快速篩查的“第一道防線”直接鏡檢：快速篩查的“第一道防線”直接鏡檢是真菌性皮膚病實(shí)驗(yàn)室診斷的首選方法，操作簡(jiǎn)單、快速（15-30分鐘出結(jié)果），成本低廉，適用于臨床初步篩查。其原理是通過化學(xué)或物理方法破壞標(biāo)本中的非真菌成分（如角質(zhì)蛋白、細(xì)胞碎片），使真菌結(jié)構(gòu)（菌絲、孢子、芽管等）清晰可見，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征初步判斷真菌類型。常用染色方法及原理KOH濕片法（1）原理：KOH（氫氧化鉀）可溶解標(biāo)本中的角質(zhì)蛋白和細(xì)胞質(zhì)，使真菌的細(xì)胞壁（主要成分為幾丁質(zhì)和葡聚糖）相對(duì)突出，在顯微鏡下呈現(xiàn)透明或半透明的菌絲、孢子形態(tài)。（2）操作步驟：取少量鱗屑、甲屑或皰液置于載玻片上，滴加10%-20%KOH溶液1滴，蓋上蓋玻片，用火焰或酒精燈微加熱（避免沸騰），待標(biāo)本透明后輕壓蓋玻片（去除氣泡），在高倍鏡（×400）或油鏡（×1000）下觀察。（3）結(jié)果判讀：-皮膚癬菌：可見分支、分隔的菌絲，有時(shí)可見小分生孢子（圓形、卵圓形）或大分生孢子（棒狀、紡錘形，壁薄有隔），如紅色毛癬菌的菌絲呈長(zhǎng)鏈狀，小分生孢子呈葡萄串樣分布。常用染色方法及原理KOH濕片法-念珠菌：可見芽生孢子和假菌絲，芽生孢子呈圓形或卵圓形（2-5μm），出芽形成假菌絲（無隔、分支狀），如白念珠菌的假菌絲末端常呈圓形“鵝口瘡”樣。01-隱球菌：在腦脊液或組織中可見莢膜包裹的圓形孢子（直徑4-10μm），墨汁染色后莢膜呈透光暈（“暈輪征”），但皮膚隱球菌感染較少見，多見于系統(tǒng)性感染。02（4）注意事項(xiàng)：KOH濃度過高（>20%）可能導(dǎo)致真菌結(jié)構(gòu)變形；加熱過度會(huì)使標(biāo)本干燥，影響觀察；若標(biāo)本量少，可加入0.1%墨水或臺(tái)盼藍(lán)染色，增強(qiáng)真菌與背景的對(duì)比度。03常用染色方法及原理革蘭染色1（1）原理：真菌細(xì)胞壁含肽聚糖，可被革蘭染色著色（多為陽性），但著色性較弱，需延長(zhǎng)染色時(shí)間。2（2）操作步驟：標(biāo)本涂片干燥固定后，結(jié)晶紫染1分鐘，碘液媒染1分鐘，95%乙醇脫色30秒，沙黃復(fù)染1分鐘，水洗后鏡檢。3（3）結(jié)果判讀：皮膚癬菌菌絲呈革蘭陽性（紫色），念珠菌芽生孢子呈革蘭陽性（紫色），假菌絲呈陽性或弱陽性；細(xì)菌（如污染菌）可被染色，有助于區(qū)分真菌與細(xì)菌感染。4（4）臨床應(yīng)用：適用于含菌量較多的標(biāo)本（如膿皰液、組織液），但對(duì)淺部鱗屑標(biāo)本的敏感度低于KOH濕片法。常用染色方法及原理PAS染色（過碘酸雪夫染色）（1）原理：真菌細(xì)胞壁中的多糖類物質(zhì)經(jīng)高碘酸氧化后，與無色品紅結(jié)合，呈現(xiàn)紫紅色，背景呈藍(lán)色（蘇木素復(fù)染），對(duì)比度高，可清晰顯示真菌的細(xì)微結(jié)構(gòu)。1（2）操作步驟：組織切片或涂片經(jīng)固定后，高碘酸氧化5分鐘，Schiff試劑染15分鐘，蘇木素復(fù)染1分鐘，脫水透明后封片。2（3）結(jié)果判讀：菌絲、孢子呈紫紅色，背景呈藍(lán)色，可清晰觀察到菌絲的隔膜、孢子的芽管等結(jié)構(gòu)，敏感度和特異度均高于KOH濕片法和革蘭染色。3（4）臨床應(yīng)用：是深部真菌病組織病理診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，適用于疑為皮膚癬菌肉芽腫、孢子絲菌病等深部感染的組織標(biāo)本。4常用染色方法及原理墨汁染色（1）原理：印度墨水中的碳顆粒不被真菌莢膜吸收，在黑色背景下，莢膜呈現(xiàn)透光暈，可清晰顯示隱球菌的莢膜結(jié)構(gòu)。（3）結(jié)果判讀：隱球菌呈圓形或卵圓形，直徑4-10μm，周圍有一圈寬大的透光莢膜（比孢子大1-3倍），菌體內(nèi)部可見反光顆粒。（2）操作步驟：腦脊液或組織液涂片，加1滴印度墨水，混勻后蓋上蓋玻片，輕壓后鏡檢。（4）臨床應(yīng)用：主要用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染的診斷，對(duì)皮膚隱球菌感染的診斷價(jià)值有限。直接鏡檢的優(yōu)缺點(diǎn)及臨床應(yīng)用1.優(yōu)點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、成本低，無需特殊設(shè)備（普通光學(xué)顯微鏡即可），適合基層醫(yī)院和臨床初步篩查。2.缺點(diǎn)：敏感度較低（40%-60%），對(duì)于菌量少（如早期感染、治療后）或形態(tài)不典型的真菌（如酵母樣真菌），易出現(xiàn)假陰性；無法鑒定菌種，僅能初步判斷真菌類型（如皮膚癬菌、念珠菌）。3.臨床應(yīng)用：所有疑似真菌性皮膚病患者均應(yīng)進(jìn)行直接鏡檢，作為初步篩查手段；對(duì)于陽性結(jié)果，可結(jié)合臨床表現(xiàn)初步診斷；對(duì)于陰性結(jié)果，需進(jìn)一步行培養(yǎng)或分子生物學(xué)檢查。05培養(yǎng)鑒定：病原學(xué)確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)鑒定：病原學(xué)確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”真菌培養(yǎng)是真菌性皮膚病實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，不僅能明確是否存在真菌感染，還能通過菌落特征、顯微鏡下形態(tài)鑒定菌種，為抗真菌藥物選擇提供依據(jù)。與直接鏡檢相比，培養(yǎng)的敏感度更高（70%-90%），且可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，但耗時(shí)較長(zhǎng)（一般需1-4周）。常用培養(yǎng)基及選擇1.沙保弱培養(yǎng)基（Sabourauddextroseagar,SDA）（1）成分：葡萄糖（40g/L）、蛋白胨（10g/L）、瓊脂（15g/L），pH5.6-6.8，酸性環(huán)境抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，適合大多數(shù)皮膚癬菌、念珠菌的生長(zhǎng)。（2）臨床應(yīng)用：是真菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適用于鱗屑、甲屑、毛發(fā)等淺部標(biāo)本的初代培養(yǎng)。2.馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potatodextroseagar,PDA）（1）成分：馬鈴薯浸出物、葡萄糖、瓊脂，酸性環(huán)境，適合培養(yǎng)皮膚癬菌（如紅色毛癬菌）和暗色絲孢霉（如著色真菌、鏈格孢）。（2）臨床應(yīng)用：常用于觀察真菌的色素產(chǎn)生（如鏈格孢的黑色菌落），輔助菌種鑒定。3.玉米粉吐溫80瓊脂（Cornmealtween80agar）常用培養(yǎng)基及選擇（1）成分：玉米粉、葡萄糖、吐溫80，吐溫80可刺激真菌產(chǎn)生假菌絲和芽生孢子，用于念珠菌的形態(tài)學(xué)鑒定（如白念珠菌的厚膜孢子形成）。在右側(cè)編輯區(qū)輸入內(nèi)容（2）臨床應(yīng)用：是念珠菌菌種鑒定的關(guān)鍵培養(yǎng)基，可用于觀察厚膜孢子、假菌絲等特征。4.氯霉素沙保弱培養(yǎng)基（SDAwithchloramphenicol）（1）成分：在SDA中加入氯霉素（50mg/L），抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，減少標(biāo)本污染。在右側(cè)編輯區(qū)輸入內(nèi)容（2）臨床應(yīng)用：適用于含菌量少、易污染的標(biāo)本（如甲屑、組織液）。5.腦心浸液瓊脂（Brainheartinfusionagar,BHIA）（1）成分：腦心浸出物、葡萄糖、瓊脂，營(yíng)養(yǎng)豐富，適合深部真菌（如念珠菌、曲霉、馬爾尼菲籃菌）的生長(zhǎng)。在右側(cè)編輯區(qū)輸入內(nèi)容（2）臨床應(yīng)用：用于深部真菌病（如念珠菌血癥、曲霉病）的血、組織標(biāo)本培養(yǎng)。在右側(cè)編輯區(qū)輸入內(nèi)容培養(yǎng)條件與操作步驟1.接種方法：將標(biāo)本（鱗屑、甲屑、毛發(fā)等）均勻接種于培養(yǎng)基表面，若為組織標(biāo)本，可將其貼于培養(yǎng)基表面或用接種針刺入培養(yǎng)基中；毛發(fā)標(biāo)本需用無菌鑷子將其埋入培養(yǎng)基內(nèi)（模擬毛囊環(huán)境）。2.培養(yǎng)條件：（1）溫度：大多數(shù)皮膚癬菌（如紅色毛癬菌）在25-28℃生長(zhǎng)最佳，念珠菌（如白念珠菌）在35-37℃生長(zhǎng)最佳，深部真菌（如馬爾尼菲籃菌）在25℃和37℃均可生長(zhǎng)（溫度雙相性）。（2）時(shí)間：淺部真菌一般培養(yǎng)1-2周可見菌落，深部真菌需2-4周；若1周后無生長(zhǎng)，可盲傳一次（轉(zhuǎn)種新鮮培養(yǎng)基），延長(zhǎng)培養(yǎng)至4周仍無生長(zhǎng)可判為陰性。（3）濕度：保持培養(yǎng)基濕潤(rùn)（相對(duì)濕度70%-80%），避免干燥影響真菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件與操作步驟（1）皮膚癬菌：菌落呈絨毛狀、粉末狀或絮狀，顏色多為白色、黃色或棕色（如紅色毛癬菌菌落呈紅色絨毛狀，中心有褶皺）。（3）暗色絲孢霉：菌落呈黑色、褐色或綠色（如著色真菌菌落呈黑色絨毛狀，鏈格孢菌落呈灰色粉末狀）。（2）念珠菌：菌落呈奶油狀、光滑、濕潤(rùn)，顏色為白色或乳白色（如白念珠菌菌落表面有“酵母樣”外觀，可形成“假菌絲暈”）。3.菌落觀察：每日觀察菌落生長(zhǎng)情況，記錄菌落大小、顏色、形態(tài)、質(zhì)地及表面特征：菌種鑒定方法顯微鏡下形態(tài)觀察（1）制片方法：取菌落少量，用乳酸酚棉藍(lán)染色液（乳酸、酚、甘油、棉藍(lán)）染色，蓋上蓋玻片，輕壓后鏡檢。（2）結(jié)構(gòu)觀察：-皮膚癬菌：可見大分生孢子（棒狀、紡錘形，壁薄有隔，如須癬毛癬菌的大分生孢子呈鉛筆狀）、小分生孢子（圓形、卵圓形，如紅色毛癬菌的小分生孢子呈葡萄串樣）、菌絲（分支、分隔）。-念珠菌：可見芽生孢子（圓形、卵圓形）、假菌絲（無隔、分支狀）、厚膜孢子（圓形、壁厚，白念珠菌在玉米粉吐溫80培養(yǎng)基上可形成厚膜孢子）。-曲霉：可見分生孢子頭（放射狀，如黃曲霉的分生孢子頭呈球形）、分生孢子梗（光滑、壁厚）、小梗（雙層，如煙曲霉的雙層小梗）。菌種鑒定方法生化反應(yīng)鑒定（1）糖發(fā)酵試驗(yàn)：觀察真菌分解糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，如念珠菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，隱球菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸。（2）同化碳源試驗(yàn)：觀察真菌利用不同碳源（如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖）生長(zhǎng)的能力，用于念珠菌菌種鑒定（如白念珠菌可同化葡萄糖、麥芽糖，不同化乳糖）。（3）尿素酶試驗(yàn)：念珠菌中的熱帶念珠菌、克柔念珠菌可產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)氨，使培養(yǎng)基變紅（陽性）。菌種鑒定方法商業(yè)鑒定系統(tǒng)1（1）API20CAUX：用于念珠菌菌種鑒定，通過同化20種碳源的反應(yīng)模式，結(jié)合編碼手冊(cè)鑒定菌種。2（2）Vitek2YST卡：全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，通過比色法檢測(cè)真菌的同化碳源反應(yīng)，可鑒定30余種酵母菌（如念珠菌、隱球菌）。3（3）MicroScanWalkAway：可鑒定酵母菌和絲狀真菌，采用熒光底物法檢測(cè)酶活性，結(jié)果準(zhǔn)確率高。培養(yǎng)鑒定的優(yōu)缺點(diǎn)及臨床應(yīng)用211.優(yōu)點(diǎn)：敏感度高、可鑒定菌種、可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，是病原學(xué)確診的金標(biāo)準(zhǔn)。3.臨床應(yīng)用：適用于直接鏡檢陰性但高度懷疑真菌感染的患者、深部真菌病、需藥敏試驗(yàn)的患者；對(duì)于菌種鑒定困難或罕見真菌，可結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)確認(rèn)。2.缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)（1-4周）、易受污染（細(xì)菌、霉菌）、部分真菌（如馬爾尼菲籃菌）培養(yǎng)條件苛刻。306分子生物學(xué)技術(shù)：高敏特異的“精準(zhǔn)診斷工具”分子生物學(xué)技術(shù)：高敏特異的“精準(zhǔn)診斷工具”分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測(cè)真菌的特異性基因（如rRNA基因、ITS區(qū)、β-1,3-D-葡聚糖基因），實(shí)現(xiàn)快速、敏感、特異的診斷，尤其適用于深部真菌病、疑難病例及常規(guī)方法陰性的患者。近年來，隨著PCR技術(shù)的普及和測(cè)序成本的下降，分子生物學(xué)已成為真菌性皮膚病實(shí)驗(yàn)室診斷的重要補(bǔ)充。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）1.原理：以真菌特異性DNA序列為模板，通過引物擴(kuò)增、TaqDNA聚合酶延伸，將目標(biāo)DNA片段放大10^6-10^9倍，通過電泳或熒光檢測(cè)判斷是否存在真菌感染。2.常用靶基因：（1）ITS區(qū)（InternalTranscribedSpacer）：包括ITS1、5.8SrRNA、ITS2，是真菌種間差異最顯著的區(qū)域，是菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)靶基因”。（2）28SrRNA基因（D1/D2區(qū)）：種間保守性較高，適用于屬或種水平的鑒定。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）（3）β-1,3-D-葡聚糖基因（FKS1）：編碼β-1,3-D-葡聚糖合成酶，是念珠菌、曲霉等真菌的特異性基因，可用于檢測(cè)念珠菌感染。3.操作步驟：（1）DNA提取：用真菌DNA提取試劑盒（如CTAB法、commercialkit）從標(biāo)本（鱗屑、組織、血液）中提取DNA。（2）引物設(shè)計(jì)：針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，如ITS區(qū)的通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。（3）PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系包括DNA模板、引物、dNTPs、Taq酶、緩沖液，循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10分鐘。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）（4）產(chǎn)物檢測(cè)：取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察條帶大小（ITS區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物約500-600bp）。4.臨床應(yīng)用：適用于深部真菌病（如念珠菌血癥、曲霉病）的早期診斷，敏感度可達(dá)90%以上，比培養(yǎng)提前2-3天；對(duì)于常規(guī)方法陰性的疑難病例（如著色真菌病），可提高陽性率。實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-timePCR）1.原理：在PCR反應(yīng)中加入熒光探針（如TaqMan探針）或熒光染料（如SYBRGreen），通過熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增進(jìn)程，可對(duì)模板進(jìn)行定量（病毒載量）。2.技術(shù)優(yōu)勢(shì)：（1）快速：可在2小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，比傳統(tǒng)PCR快5-6倍。（2）敏感度高：檢測(cè)下限可達(dá)1-10拷貝/μL，適用于菌量少的標(biāo)本（如血液、腦脊液）。（3）定量檢測(cè)：可反映真菌載量變化，用于治療效果監(jiān)測(cè)（如念珠菌血癥患者治療后真菌載量下降提示治療有效）。實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-timePCR）3.臨床應(yīng)用：適用于系統(tǒng)性真菌病的早期診斷和療效監(jiān)測(cè)，如曲霉GM試驗(yàn)陽性患者，可通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)BALF中的曲霉DNA，明確感染部位；念珠菌血癥患者可定量檢測(cè)血液中的念珠菌DNA，指導(dǎo)抗真菌藥物調(diào)整。多重PCR（MultiplexPCR）1.原理：在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶基因，可一次性檢測(cè)多種真菌。2.臨床應(yīng)用：適用于混合感染或需快速鑒別常見真菌的情況，如同時(shí)檢測(cè)皮膚癬菌（紅色毛癬菌、須癬毛癬菌）、念珠菌（白念珠菌、光滑念珠菌）、馬拉色菌（糠秕馬拉色菌、球形馬拉色菌）的特異性基因，提高診斷效率。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）1.原理：利用鏈置換DNA聚合酶和特異性引物（F3、B3、FIP、BIP），在60-65℃等溫條件下擴(kuò)增DNA，產(chǎn)生大量莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，通過SYBRGreen染色判斷結(jié)果（陽性呈綠色，陰性呈橙色）。2.技術(shù)優(yōu)勢(shì)：無需PCR儀，操作簡(jiǎn)單（可在水浴鍋中進(jìn)行），結(jié)果判讀直觀，適合基層醫(yī)院和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。3.臨床應(yīng)用：適用于手足癬、體股癬等淺部真菌病的快速診斷，敏感度與PCR相當(dāng)（85%-90%），但無法鑒定菌種?；驕y(cè)序（Sanger測(cè)序）1.原理：對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過與GenBank中的已知序列比對(duì)，鑒定菌種。2.操作步驟：（1）PCR擴(kuò)增：用ITS區(qū)或28SrRNA基因引物擴(kuò)增標(biāo)本DNA。（2）純化產(chǎn)物：用PCR產(chǎn)物純化試劑盒去除雜質(zhì)。（3）測(cè)序反應(yīng)：采用Sanger測(cè)序法（雙脫氧鏈終止法）進(jìn)行測(cè)序。（4）序列比對(duì)：將測(cè)序結(jié)果提交至BLAST數(shù)據(jù)庫（），與已知真菌序列比對(duì)，鑒定菌種（相似度≥97%可認(rèn)為是同一菌種）。3.臨床應(yīng)用：是疑難真菌菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，適用于罕見真菌（如馬爾尼菲籃菌、裴氏著色真菌）的鑒定；對(duì)于培養(yǎng)陰性的深部真菌病，可通過測(cè)序明確診斷。宏基因組二代測(cè)序（mNGS）1.原理：直接提取標(biāo)本中的總DNA，用隨機(jī)引物進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過生物信息學(xué)分析（去除宿主和細(xì)菌序列），鑒定真菌種類并分析其耐藥基因。2.技術(shù)優(yōu)勢(shì)：（1）無偏倚：不依賴培養(yǎng)或特異性引物，可檢測(cè)所有真菌（包括未知真菌）。（2）全面：可同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌、病毒、真菌等多種病原體，適用于混合感染或免疫抑制患者的復(fù)雜感染。3.臨床應(yīng)用：適用于常規(guī)方法陰性的深部真菌?。ㄈ珉[球菌腦膜炎、曲霉肺病）的診斷，或疑似系統(tǒng)性真菌感染的患者；但成本較高（單次檢測(cè)約2000-3000元），且存在假陽性（如環(huán)境真菌污染）問題，需結(jié)合臨床結(jié)果判讀。分子生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及臨床應(yīng)用1.優(yōu)點(diǎn)：快速（2小時(shí)-2天）、敏感度高（90%-100%）、特異性強(qiáng)，可鑒定罕見菌種，適用于深部真菌病和疑難病例。2.缺點(diǎn)：成本較高（如mNGS需數(shù)千元）、需專業(yè)設(shè)備和人員、易出現(xiàn)假陽性（污染）或假陰性（抑制物），且無法區(qū)分活菌與死菌（治療后真菌DNA仍可存在）。3.臨床應(yīng)用：作為傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充，適用于：①深部真菌病的早期診斷；②常規(guī)方法陰性的疑難病例；③需快速鑒定菌種的情況（如耐藥菌株）；④免疫抑制患者的復(fù)雜感染。32107免疫學(xué)技術(shù)：輔助診斷的“補(bǔ)充手段”免疫學(xué)技術(shù)：輔助診斷的“補(bǔ)充手段”免疫學(xué)技術(shù)通過檢測(cè)患者血清或標(biāo)本中的真菌抗體、抗原或免疫復(fù)合物，輔助診斷真菌性皮膚病，尤其適用于深部真菌病和系統(tǒng)性真菌感染。其優(yōu)點(diǎn)是快速（1-2小時(shí)）、無需培養(yǎng)，但敏感度和特異度受感染階段、宿主免疫狀態(tài)等因素影響。真菌抗體檢測(cè)1.原理：用真菌抗原包被反應(yīng)板，加入患者血清，若血清中存在特異性抗體，則與抗原結(jié)合，再用酶標(biāo)二抗（如抗人IgG抗體）和底物顯色，通過吸光度值判斷抗體水平。2.常用檢測(cè)項(xiàng)目：（1）念珠菌抗體：檢測(cè)抗念珠菌IgG抗體，用于慢性皮膚黏膜念珠菌病（CMC）的診斷，陽性率約60%-70%。（2）曲霉抗體：檢測(cè)抗曲霉IgG抗體，用于變應(yīng)性支氣管肺曲霉?。ˋBPA）的診斷，陽性率約80%。（3）孢子絲菌抗體：檢測(cè)申克孢子絲菌抗體，用于孢子絲菌病的診斷，陽性率約90%（但皮膚型孢子絲菌病抗體陽性率較低）。真菌抗體檢測(cè)3.臨床應(yīng)用：適用于慢性或復(fù)發(fā)性真菌感染（如CMC、孢子絲菌?。贵w產(chǎn)生需1-2周，不適合早期診斷；免疫抑制患者（如艾滋病、化療）抗體產(chǎn)生低下，易出現(xiàn)假陰性。真菌抗原檢測(cè)1.β-1,3-D-葡聚糖試驗(yàn)（G試驗(yàn)）（1）原理：β-1,3-D-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的成分（除接合菌和隱球菌外），可激活鱟試劑中的G因子，顯色反應(yīng)的吸光度值與葡聚糖含量成正比。（2）操作步驟：取血清或腦脊液，用鱟試劑盒檢測(cè)，結(jié)果以pg/mL表示（cut-off值一般為10-20pg/mL）。（3）臨床應(yīng)用：適用于念珠菌、曲霉、鐮刀菌等真菌感染的早期診斷，敏感度約80%-90%，但接合菌（如毛霉）和隱球菌（細(xì)胞壁無β-1,3-D-葡聚糖）呈陰性；假陽性可見于輸注白蛋白、丙種球蛋白、血液透析等情況。真菌抗原檢測(cè)半乳甘露聚糖試驗(yàn)（GM試驗(yàn)）（1）原理：半乳甘露聚糖是曲霉細(xì)胞壁的特異性抗原，用單克隆抗體（如EB-A2）包被反應(yīng)板，檢測(cè)標(biāo)本中的GM抗原，結(jié)果以指數(shù)值（GI）表示（cut-off值一般為≥1.5為陽性）。（2）臨床應(yīng)用：適用于侵襲性曲霉?。↖A）的診斷，敏感度約70%-80%（BALF敏感度高于血清），特異度約90%；假陽性可見于使用哌拉西林他唑巴坦（含青霉噻唑酸）的患者。真菌抗原檢測(cè)隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)（1）原理：用乳膠顆粒或膠體金標(biāo)記的抗隱球菌莢膜多糖抗體，檢測(cè)血清或腦脊液中的隱球菌抗原，結(jié)果以滴度表示（cut-off值一般為≥1:8為陽性）。（2）臨床應(yīng)用：適用于隱球菌病（尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染）的診斷，敏感度約95%-100%（腦脊液高于血清），滴度高低與病情嚴(yán)重程度相關(guān)（滴度≥1:512提示預(yù)后不良）。真菌抗原檢測(cè)念珠菌抗原檢測(cè)（1）原理：檢測(cè)念珠菌細(xì)胞壁中的甘露蛋白（mannan）或烯醇化酶（enolase），用ELISA法或乳膠凝集法檢測(cè)。（2）臨床應(yīng)用：適用于侵襲性念珠菌?。↖C）的診斷，敏感度約60%-70%（聯(lián)合抗體檢測(cè)可提高至80%），但假陽性可見于輸注免疫球蛋白或細(xì)菌感染（如大腸桿菌）。免疫學(xué)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及臨床應(yīng)用11.優(yōu)點(diǎn)：快速（1-2小時(shí)）、無需培養(yǎng)、適合早期診斷，適用于深部真菌病和系統(tǒng)性感染。22.缺點(diǎn)：敏感度和特異度受多種因素影響（如感染階段、免疫狀態(tài)、交叉反應(yīng)），無法鑒定菌種，且部分檢測(cè)（如G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)）需排除假陽性/假陰性。33.臨床應(yīng)用：作為傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充，適用于：①深部真菌病的早期篩查；②免疫抑制患者的療效監(jiān)測(cè)（如GM試驗(yàn)滴度下降提示治療有效）；③常規(guī)方法陰性的疑似患者。08真菌性皮膚病實(shí)驗(yàn)室診斷的流程優(yōu)化與質(zhì)量控制真菌性皮膚病實(shí)驗(yàn)室診斷的流程優(yōu)化與質(zhì)量控制真菌性皮膚病的實(shí)驗(yàn)室診斷需遵循“規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、個(gè)體化”原則，通過流程優(yōu)化和質(zhì)量控制，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。診斷流程的優(yōu)化（1）第一步：免疫學(xué)檢測(cè)（G試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、隱球菌抗原檢測(cè)），快速篩查（1-2小時(shí)）。2.深部真菌?。ㄈ缒钪榫Y、曲霉病、隱球菌病）：1.淺部真菌?。ㄈ缡肿惆_、體股癬、甲癬）：（1）第一步：直接鏡檢（KOH濕片法），快速篩查（15-30分鐘）。（2）第二步：若鏡檢陽性，結(jié)合臨床表現(xiàn)初步診斷；若陰性，行真菌培養(yǎng)（沙保弱培養(yǎng)基，25-28℃培養(yǎng)1-2周），鑒定菌種。（3）第三步：對(duì)于常規(guī)方法陰性的疑難病例（如甲癬），可考慮分子生物學(xué)檢測(cè)（PCR+測(cè)序）。診斷流程的優(yōu)化（2）第二步：若免疫學(xué)陽性，行血培養(yǎng)或組織培養(yǎng)（腦心浸液瓊脂，35-37℃培養(yǎng)2-4周），鑒定菌種并做藥敏試驗(yàn)。（3）第三步：對(duì)于培養(yǎng)陰性的患者，行分子生物學(xué)檢測(cè)（實(shí)時(shí)熒光PCR、宏基因組測(cè)序）。質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)11.標(biāo)本質(zhì)量控制：規(guī)范采集（避免污染、取活動(dòng)性皮損）、及時(shí)送檢（≤2小時(shí)）、正確保存（4℃冷藏，避免冷凍）。22.試劑質(zhì)量控制：使用有效期內(nèi)試劑（KOH、培養(yǎng)基、染色液等），定期進(jìn)行陽性對(duì)照（如用紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株驗(yàn)證培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照（用無菌生理鹽水驗(yàn)證無污染）。33.儀器質(zhì)量控制：