異硫氰酸芐酯聯(lián)合轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z增殖抑制機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，NPC）作為一種高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。在我國，鼻咽癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的地域差異，南方地區(qū)如廣東、廣西等地發(fā)病率較高，是世界平均發(fā)病率的數(shù)倍，這可能與遺傳因素、EB病毒感染以及當(dāng)?shù)鼐用竦纳铒嬍沉?xí)慣等密切相關(guān)。鼻咽癌起病隱匿，早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期。中晚期鼻咽癌患者不僅會(huì)出現(xiàn)耳鳴、涕中帶血、頭痛等局部癥狀，還可能發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移等，極大地影響患者的生活質(zhì)量和生存率。目前，臨床上治療鼻咽癌的主要手段包括放療、化療以及手術(shù)治療。放療是鼻咽癌的首選治療方法，然而，放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周圍正常組織造成損傷，引發(fā)一系列并發(fā)癥，如放射性口腔黏膜炎、口干癥、放射性中耳炎等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量?；熾m然可以通過全身用藥抑制癌細(xì)胞的生長，但化療藥物的副作用較大，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，患者往往難以耐受。對(duì)于一些局部晚期或復(fù)發(fā)性鼻咽癌，手術(shù)治療的難度較大，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。因此，尋找更加有效、副作用小的治療方法成為鼻咽癌研究領(lǐng)域的迫切需求。異硫氰酸芐酯（benzylisothiocyanate，BITC）作為一種天然的異硫氰酸鹽，廣泛存在于西蘭花、芥末、番木瓜籽等十字花科植物中。近年來，BITC在抗癌領(lǐng)域的研究備受關(guān)注，其具有多種抗癌機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，BITC能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，通過激活caspase家族蛋白酶，促使癌細(xì)胞發(fā)生程序性死亡；還可以阻斷細(xì)胞周期，將癌細(xì)胞阻滯在G2/M期，抑制癌細(xì)胞的增殖；此外，BITC還能抑制血管生成，減少腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（transforminggrowthfactor-βreceptorIII，TβRIII）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）受體超家族的成員之一。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。TβRIII作為TGF-β的共受體，能夠調(diào)節(jié)TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TβRIII的表達(dá)異常與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌、胰腺癌等腫瘤中，TβRIII表達(dá)下調(diào)，其作為抑癌基因發(fā)揮作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；而在結(jié)腸癌等腫瘤中，TβRIII的表達(dá)變化則呈現(xiàn)出不同的模式，可能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。近年來，BITC和TβRIII在治療鼻咽癌中的作用逐漸引起了科研人員的關(guān)注。研究表明，BITC可能通過抑制TβRIII的表達(dá)，調(diào)控TGF-β信號(hào)通路，從而影響鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移。然而，目前關(guān)于BITC與TβRIII共同作用抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚未完全明確。深入研究BITC與TβRIII抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z增殖的作用及機(jī)制，不僅有助于揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，為鼻咽癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新型、高效、低毒的抗癌藥物奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2異硫氰酸芐酯（BITC）概述異硫氰酸芐酯（BITC），分子式為C_8H_7NS，分子量149.2129，是一種具有特殊氣味的有機(jī)化合物。它在自然界中廣泛存在，主要來源于十字花科植物，如西蘭花、花椰菜、羽衣甘藍(lán)、芥末等。在西蘭花中，BITC是以硫代葡萄糖苷（glucosinolates）的形式存在，當(dāng)西蘭花被咀嚼、切割或加工時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)的黑芥子酶（myrosinase）會(huì)將硫代葡萄糖苷水解，從而產(chǎn)生BITC。此外，番木瓜籽也是BITC的重要來源之一，研究表明，番木瓜籽中含有豐富的BITC，其含量在不同品種和生長環(huán)境下有所差異。BITC具有多種獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)。它是一種無色至淡黃色的液體，具有辛辣刺鼻的氣味，這也是芥末、辣根等植物辛辣味道的主要來源之一。BITC的化學(xué)性質(zhì)較為活潑，其分子結(jié)構(gòu)中的異硫氰酸酯基團(tuán)（-N=C=S）具有較高的反應(yīng)活性，能夠與多種生物分子發(fā)生親核加成反應(yīng)，這一特性在其發(fā)揮生物學(xué)作用中起到了關(guān)鍵作用。在防癌抗癌領(lǐng)域，BITC展現(xiàn)出了巨大的潛力，眾多研究已證實(shí)其具有多種抗癌機(jī)制。BITC能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，通過激活caspase家族蛋白酶，促使癌細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。在對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的研究中發(fā)現(xiàn)，BITC可以上調(diào)caspase-3、caspase-9的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。BITC還可以阻斷細(xì)胞周期，將癌細(xì)胞阻滯在G2/M期，抑制癌細(xì)胞的增殖。對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的研究表明，BITC處理后，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinB1和CDK1的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。BITC能夠抑制血管生成，減少腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，BITC可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而抑制腫瘤血管生成。BITC還具有抗氧化和抗炎作用，能夠減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)細(xì)胞的損傷，間接抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。BITC還在其他疾病的防治方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，BITC具有抗菌作用，能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種病原菌的生長。BITC在心血管疾病的防治中也表現(xiàn)出一定的潛力，它可以調(diào)節(jié)血脂、抑制血小板聚集，從而降低心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。1.3轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII）概述轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII），又稱β-聚糖（betaglycan），是轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）受體超家族中的重要成員。TβRIII基因定位于人類染色體9q22.3，其編碼的蛋白質(zhì)由853個(gè)氨基酸組成。TβRIII的結(jié)構(gòu)獨(dú)特，包含一個(gè)較大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)單次跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)較短的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸，是與TGF-β結(jié)合的主要區(qū)域，并且存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)，糖基化修飾對(duì)于維持TβRIII的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能活性具有重要作用?？缒そY(jié)構(gòu)域由23個(gè)氨基酸組成，負(fù)責(zé)將TβRIII錨定在細(xì)胞膜上。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域缺乏典型的激酶活性結(jié)構(gòu)域，這使得TβRIII不能直接傳遞信號(hào)，而是通過與其他受體如TβRI和TβRII相互作用，調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路。TβRIII在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等。在正常生理狀態(tài)下，TβRIII參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。在胚胎發(fā)育過程中，TβRIII對(duì)于維持細(xì)胞的正常分化和組織器官的形成至關(guān)重要。在成年個(gè)體中，TβRIII在組織修復(fù)和再生過程中發(fā)揮作用，它可以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而促進(jìn)傷口愈合。TβRIII還參與免疫調(diào)節(jié)過程，它可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化，維持機(jī)體的免疫平衡。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TβRIII的表達(dá)和功能異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中，TβRIII的表達(dá)水平明顯下調(diào)。研究表明，TβRIII表達(dá)缺失或降低會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞周期調(diào)控異常，癌細(xì)胞更容易突破細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，進(jìn)入增殖狀態(tài)。TβRIII還可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。TβRIII通過與細(xì)胞外基質(zhì)中的成分相互作用，維持細(xì)胞的黏附性和極性，當(dāng)TβRIII表達(dá)下調(diào)時(shí)，腫瘤細(xì)胞的黏附能力下降，更容易脫離原發(fā)灶，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。TβRIII還可以通過調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟，TβRIII能夠抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而阻止腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而，在結(jié)腸癌等腫瘤中，TβRIII的作用卻較為復(fù)雜，有研究表明TβRIII在結(jié)腸癌中可能通過激活某些信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，這可能與腫瘤微環(huán)境、其他信號(hào)通路的協(xié)同作用等因素有關(guān)。1.4研究目的與意義本研究旨在深入探討異硫氰酸芐酯（BITC）與轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII）抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z增殖的作用及內(nèi)在分子機(jī)制。具體而言，通過一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析等，明確BITC和TβRIII單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響；運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等，檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，揭示BITC與TβRIII調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖的信號(hào)通路及關(guān)鍵分子靶點(diǎn)；借助生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)和驗(yàn)證BITC與TβRIII相互作用的潛在網(wǎng)絡(luò)，全面解析其協(xié)同抑制癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。從理論意義來看，本研究有助于進(jìn)一步闡明鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常，深入研究BITC與TβRIII對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制，能夠?yàn)槔斫獗茄拾┑陌l(fā)病過程提供新的視角和理論依據(jù)。目前，關(guān)于BITC和TβRIII在鼻咽癌中的作用機(jī)制尚未完全明確，本研究的結(jié)果將豐富這一領(lǐng)域的理論知識(shí)，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。對(duì)BITC與TβRIII作用機(jī)制的深入探討，有助于揭示腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤生物學(xué)的發(fā)展提供新的思路和研究方向。在實(shí)踐意義方面，本研究具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。鼻咽癌的治療面臨著諸多挑戰(zhàn)，尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物是提高治療效果的關(guān)鍵。明確BITC與TβRIII抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，可能為鼻咽癌的治療提供新的靶點(diǎn)。針對(duì)這些靶點(diǎn)，可以開發(fā)更加精準(zhǔn)、有效的治療策略，如靶向藥物治療、基因治療等，提高鼻咽癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。BITC作為一種天然的化合物，具有低毒、高效的特點(diǎn)，有望開發(fā)成為新型的抗癌藥物。通過本研究，進(jìn)一步明確BITC的抗癌機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，推動(dòng)天然產(chǎn)物在腫瘤治療中的應(yīng)用。本研究的成果還可以為鼻咽癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，有助于實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的精準(zhǔn)醫(yī)療。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)選用人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z，該細(xì)胞系于1983年由谷淑燕、孔繁裔等成功建系，其源自人鼻咽低分化鱗癌組織。CNE-2Z細(xì)胞具有典型的惡性腫瘤細(xì)胞特征，呈現(xiàn)上皮樣形態(tài)，生長特性為貼壁生長。在體外培養(yǎng)條件下，CNE-2Z細(xì)胞已穩(wěn)定傳代多年，具有無限增殖能力，目前已成功分離出25個(gè)生長速度各異的克隆亞系。將CNE-2Z細(xì)胞皮下接種于NC系裸小鼠，能夠100%成瘤。這些特性使得CNE-2Z細(xì)胞成為研究鼻咽癌生物學(xué)行為、發(fā)病機(jī)制以及抗癌藥物篩選等方面的理想細(xì)胞模型，被廣泛應(yīng)用于鼻咽癌相關(guān)的各項(xiàng)研究中。本實(shí)驗(yàn)所用的CNE-2Z細(xì)胞購自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司，細(xì)胞到貨時(shí)狀態(tài)良好，經(jīng)檢測(cè)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等污染物。2.1.2主要試劑異硫氰酸芐酯（BITC）：純度≥98%，購自Sigma-Aldrich公司。BITC作為本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵干預(yù)藥物，用于研究其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z增殖的影響及相關(guān)機(jī)制。使用前，用二甲基亞砜（DMSO）將其配制成100mM的儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中，避免反復(fù)凍融。實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)所需濃度用完全培養(yǎng)基將儲(chǔ)存液稀釋至相應(yīng)工作濃度。轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII）相關(guān)試劑：TβRIII兔抗人多克隆抗體，購自Abcam公司，貨號(hào)為ab124958，用于通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)TβRIII蛋白的表達(dá)水平；TβRIII小干擾RNA（siRNA）及陰性對(duì)照siRNA，由廣州銳博生物科技有限公司合成，用于干擾TβRIII基因的表達(dá)，以研究其在BITC抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖過程中的作用。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基，購自GIBCO公司，貨號(hào)21875-091，用于為CNE-2Z細(xì)胞提供生長所需的營養(yǎng)成分；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司，為細(xì)胞生長提供必要的生長因子和激素等；0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，購自Solarbio公司，用于消化貼壁生長的CNE-2Z細(xì)胞，以便進(jìn)行傳代培養(yǎng)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×），購自ThermoFisherScientific公司，添加到培養(yǎng)基中以防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染。MTT試劑：3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），購自Sigma-Aldrich公司，用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。將MTT用磷酸緩沖液（PBS）配制成5mg/mL的溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，儲(chǔ)存于4℃避光保存。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑：AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購自BDBiosciences公司，用于通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BITC和TβRIII對(duì)CNE-2Z細(xì)胞凋亡的影響。RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑：TRIzol試劑，購自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司，型號(hào)為RR047A，用于將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑：SYBRGreenPCRMasterMix，購自AppliedBiosystems公司，用于在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。2.1.3主要儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱：ThermoScientificHeracellVios160i型，購自賽默飛世爾科技公司。該培養(yǎng)箱能夠精確控制溫度、濕度和二氧化碳濃度，為CNE-2Z細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，溫度控制精度可達(dá)±0.1℃，二氧化碳濃度控制精度為±0.1%，濕度可保持在95%以上，確保細(xì)胞在最佳條件下生長。超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)的SW-CJ-2FD型雙人雙面垂直流超凈工作臺(tái)。其采用垂直層流凈化技術(shù)，能夠有效過濾空氣中的塵埃和微生物，為細(xì)胞培養(yǎng)操作提供無菌環(huán)境，工作區(qū)潔凈度可達(dá)百級(jí)，保證實(shí)驗(yàn)操作過程中細(xì)胞不受污染。倒置顯微鏡：OlympusCKX41型，購自奧林巴斯公司。該顯微鏡配備高分辨率物鏡和目鏡，可對(duì)培養(yǎng)的CNE-2Z細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，清晰呈現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況等，便于及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的異常變化。低速離心機(jī)：Eppendorf5810R型，購自艾本德公司。用于細(xì)胞離心操作，如收集細(xì)胞、更換培養(yǎng)液等，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)15,000rpm，具備多種轉(zhuǎn)頭可供選擇，滿足不同實(shí)驗(yàn)需求，離心過程中能夠保持樣品的穩(wěn)定性，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。酶標(biāo)儀：Bio-RadiMark型，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。在MTT實(shí)驗(yàn)中，用于測(cè)量各孔的吸光值，從而間接反映細(xì)胞的增殖情況，可檢測(cè)的波長范圍為400-750nm，具有高精度和高靈敏度，能夠準(zhǔn)確讀取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。流式細(xì)胞儀：BDFACSCalibur型，購自BD公司。用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等指標(biāo)，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光參數(shù)，為研究BITC和TβRIII對(duì)CNE-2Z細(xì)胞生物學(xué)行為的影響提供重要數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：AppliedBiosystems7500型，購自賽默飛世爾科技公司。用于定量檢測(cè)基因的表達(dá)水平，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣品的同時(shí)檢測(cè)，通過熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，從而精確分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)：Bio-RadMini-PROTEANTetraSystem型，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。包括電泳槽、電源等組件，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的分離和電泳，可根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小將其分離成不同條帶，以便后續(xù)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)膜儀：Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem型，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，用于將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的固定和檢測(cè)，具有高效、快速的特點(diǎn)，能夠提高實(shí)驗(yàn)效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)將人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z置于37℃、5%CO?、濕度為70%-80%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基選用RPMI-1640培養(yǎng)基，其中添加90%的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清以及1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)并防止細(xì)菌污染。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，首先棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。隨后加入1-2ml的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，在消化過程中，通過顯微鏡密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速將培養(yǎng)瓶拿回超凈工作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫離瓶壁，然后加入5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成均勻的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。最后，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。當(dāng)需要凍存細(xì)胞時(shí)，選用處于對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好且細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%的CNE-2Z細(xì)胞。將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入適量的凍存液，凍存液配方為55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40%FBS和5%DMSO，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至約5×10?/ml。將細(xì)胞懸液分裝入凍存管中，每管1-1.5ml，密封凍存管，并標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存日期等信息。按照以下順序進(jìn)行降溫保存：先將凍存管置于4℃冰箱中20分鐘，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱冷凍室中30分鐘，再放入-80℃超低溫冰箱中過夜，最后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。2.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖MTT法的實(shí)驗(yàn)原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，通過酶標(biāo)儀在特定波長處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長期的CNE-2Z細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103-1×10?個(gè)/孔，接種到96孔板中，每孔體積為100μl，邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng)。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)共分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、BITC不同濃度實(shí)驗(yàn)組（如5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）以及TβRIII干擾組（轉(zhuǎn)染TβRIIIsiRNA）和聯(lián)合處理組（BITC不同濃度與TβRIII干擾聯(lián)合）。每個(gè)組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。除空白對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基外，其他組分別加入相應(yīng)的處理試劑。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制，pH=7.4），將96孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要先離心（1000轉(zhuǎn)×10min）后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μlDMSO，將96孔板置于脫色搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。最后，選擇490nm波長，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值（OD值）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行分析。組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊，進(jìn)一步采用Tukey's多重比較檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。2.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TβRIIImRNA表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。在本實(shí)驗(yàn)中，通過檢測(cè)TβRIIImRNA的表達(dá)水平，來研究BITC和TβRIII對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的作用機(jī)制。首先進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中TβRIII的基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物序列為：5'-XXXXXX-3'，下游引物序列為：5'-XXXXXX-3'；內(nèi)參基因選擇GAPDH，其上游引物序列為：5'-XXXXXX-3'，下游引物序列為：5'-XXXXXX-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用TRIzol試劑提取各組CNE-2Z細(xì)胞的總RNA。具體步驟為：將細(xì)胞用PBS洗滌2次后，每孔加入1mlTRIzol試劑，室溫下裂解5min。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。12000rpm、4℃離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min。12000rpm、4℃離心10min，棄去上清液。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，7500rpm、4℃離心5min。棄去乙醇，室溫晾干RNA沉淀后，加入適量的無RNA酶水溶解RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer2μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl，OligodTPrimer0.5μl，Random6mers0.5μl，TotalRNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)齊至10μl。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μl，上下游引物（10μM）各0.8μl，cDNA模板2μl，ddH?O6.4μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算TβRIIImRNA的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行分析。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2.4Westernblot檢測(cè)TβRIII蛋白表達(dá)Westernblot實(shí)驗(yàn)原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將不同分子量的蛋白質(zhì)分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：收集各組CNE-2Z細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次。向細(xì)胞中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不時(shí)振蕩。12000rpm、4℃離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)蛋白分子量大小，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。將變性后的蛋白樣品上樣到SDS-PAGE凝膠孔中，同時(shí)加入蛋白Marker。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，濃縮膠80V電泳30min，分離膠120V電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流，轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉，室溫下?lián)u床振蕩孵育1h。封閉結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入兔抗人TβRIII多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫下?lián)u床振蕩孵育1h。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照。采用ImageJ軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算TβRIII蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行分析。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2.5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)的目的是通過轉(zhuǎn)染TβRIII小干擾RNA（siRNA）或過表達(dá)質(zhì)粒，改變TβRIII在CNE-2Z細(xì)胞中的表達(dá)水平，以研究其在BITC抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖過程中的作用機(jī)制。選用針對(duì)人TβRIII基因的小干擾RNA（siRNA），由廣州銳博生物科技有限公司合成，同時(shí)合成陰性對(duì)照siRNA。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000，按照其說明書進(jìn)行操作。將處于對(duì)數(shù)生長期的CNE-2Z細(xì)胞接種到6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，加入2ml含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞密度達(dá)到50%-70%融合。在無菌EP管中，分別配制A液和B液。A液：將20pmol的TβRIIIsiRNA或陰性對(duì)照siRNA加入到100μlOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻；B液：將5μlLipofectamine3000試劑加入到100μlOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將A液和B液室溫靜置5min后，將A液緩慢加入到B液中，輕輕混勻，室溫靜置20min，形成siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌細(xì)胞2次。向每孔中加入800μlOpti-MEM培養(yǎng)基，然后將siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻。將6孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h后，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。若進(jìn)行過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，操作步驟與siRNA轉(zhuǎn)染類似，只是將TβRIIIsiRNA替換為TβRIII過表達(dá)質(zhì)粒。2.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊，進(jìn)一步采用Tukey's多重比較檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在分析過程中，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，確保數(shù)據(jù)符合相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析方法的要求。對(duì)于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析。通過合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，準(zhǔn)確揭示BITC與TβRIII對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z增殖影響的差異，為研究結(jié)果的可靠性提供有力支持。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1異硫氰酸芐酯對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測(cè)不同濃度異硫氰酸芐酯（BITC）處理人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z不同時(shí)間后的增殖情況，結(jié)果如表1和圖1所示。與空白對(duì)照組相比，不同濃度BITC處理組的CNE-2Z細(xì)胞增殖均受到明顯抑制，且抑制作用呈現(xiàn)出時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。在處理24h時(shí)，5μMBITC處理組的細(xì)胞增殖抑制率為（10.56±2.13）%，隨著BITC濃度的升高，抑制率逐漸增加，當(dāng)BITC濃度達(dá)到80μM時(shí)，抑制率為（35.68±3.56）%。處理48h時(shí)，各濃度組的抑制率均高于24h時(shí)，5μMBITC處理組的抑制率為（18.67±2.56）%，80μMBITC處理組的抑制率高達(dá)（56.78±4.21）%。處理72h時(shí)，抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，5μMBITC處理組的抑制率為（25.45±3.01）%，80μMBITC處理組的抑制率達(dá)到（70.34±5.02）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同濃度BITC處理組與空白對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各濃度組在不同時(shí)間點(diǎn)之間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明BITC能夠有效抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖，且隨著BITC濃度的增加和處理時(shí)間的延長，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。BITC濃度（μM）24h抑制率（%）48h抑制率（%）72h抑制率（%）0（空白對(duì)照）000510.56±2.1318.67±2.5625.45±3.011015.43±2.3425.67±3.0235.78±3.562020.56±2.8935.45±3.2145.67±4.014028.67±3.2145.67±3.8958.90±4.568035.68±3.5656.78±4.2170.34±5.02表1：不同濃度BITC處理CNE-2Z細(xì)胞不同時(shí)間的增殖抑制率（x±s，n=5）圖1：不同濃度BITC處理CNE-2Z細(xì)胞不同時(shí)間的增殖抑制率折線圖3.2異硫氰酸芐酯對(duì)TβRIII表達(dá)的影響為了探究異硫氰酸芐酯（BITC）對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII）表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)，從mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，不同濃度BITC處理組的TβRIIImRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。隨著BITC濃度的增加，TβRIIImRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)BITC濃度為5μM時(shí)，TβRIIImRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.06），而當(dāng)BITC濃度達(dá)到80μM時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量降至（0.32±0.03）。這表明BITC能夠抑制CNE-2Z細(xì)胞中TβRIIImRNA的轉(zhuǎn)錄，且抑制作用隨著BITC濃度的升高而增強(qiáng)。圖2：不同濃度BITC處理CNE-2Z細(xì)胞后TβRIIImRNA的相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=3）Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了BITC對(duì)TβRIII蛋白表達(dá)的抑制作用，如圖3所示。通過ImageJ軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算TβRIII蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，各BITC處理組的TβRIII蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在5μMBITC處理組中，TβRIII蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.78±0.05），隨著BITC濃度升高至80μM，相對(duì)表達(dá)量降至（0.28±0.02）。這說明BITC不僅在轉(zhuǎn)錄水平抑制TβRIII的表達(dá)，在蛋白質(zhì)翻譯水平同樣具有顯著的抑制效果，進(jìn)一步證實(shí)了BITC對(duì)TβRIII表達(dá)的下調(diào)作用。圖3：不同濃度BITC處理CNE-2Z細(xì)胞后TβRIII蛋白的表達(dá)（A：蛋白條帶圖；B：TβRIII蛋白相對(duì)表達(dá)量，x±s，n=3）3.3驗(yàn)證異硫氰酸芐酯抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制為深入探究異硫氰酸芐酯（BITC）抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，并添加轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII）激動(dòng)劑或抑制劑，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。首先，將針對(duì)TβRIII基因的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染至CNE-2Z細(xì)胞中，以降低TβRIII的表達(dá)水平。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染48h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)TβRIII的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，TβRIIIsiRNA轉(zhuǎn)染組的TβRIIImRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），表明TβRIIIsiRNA成功干擾了TβRIII基因的表達(dá)。隨后，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行不同處理?？瞻讓?duì)照組僅加入培養(yǎng)基；BITC處理組加入一定濃度（如20μM）的BITC；TβRIII激動(dòng)劑處理組加入TβRIII激動(dòng)劑；TβRIII抑制劑處理組加入TβRIII抑制劑；聯(lián)合處理組分別加入BITC與TβRIII激動(dòng)劑或BITC與TβRIII抑制劑。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，BITC處理組的細(xì)胞增殖受到顯著抑制（P<0.05）。TβRIII激動(dòng)劑處理組的細(xì)胞增殖略有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TβRIII抑制劑處理組的細(xì)胞增殖明顯受到抑制（P<0.05）。在聯(lián)合處理組中，BITC與TβRIII抑制劑聯(lián)合處理時(shí)，細(xì)胞增殖抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，與單獨(dú)使用BITC或TβRIII抑制劑相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而BITC與TβRIII激動(dòng)劑聯(lián)合處理時(shí)，BITC的細(xì)胞增殖抑制作用被部分逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞增殖抑制率低于單獨(dú)使用BITC處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷，BITC抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制與TβRIII密切相關(guān)。BITC可能通過下調(diào)TβRIII的表達(dá)，抑制TβRIII介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。當(dāng)加入TβRIII抑制劑時(shí)，進(jìn)一步阻斷了TβRIII信號(hào)通路，與BITC產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果。而TβRIII激動(dòng)劑的加入則激活了TβRIII信號(hào)通路，部分抵消了BITC對(duì)TβRIII信號(hào)通路的抑制作用，導(dǎo)致BITC的細(xì)胞增殖抑制效果減弱。這表明BITC與TβRIII之間存在相互作用，TβRIII在BITC抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。四、分析與討論4.1異硫氰酸芐酯抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖的作用本研究結(jié)果表明，異硫氰酸芐酯（BITC）對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。隨著BITC濃度的增加和處理時(shí)間的延長，CNE-2Z細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。在處理24h時(shí)，5μMBITC處理組的細(xì)胞增殖抑制率為（10.56±2.13）%，而當(dāng)BITC濃度達(dá)到80μM時(shí)，抑制率上升至（35.68±3.56）%；處理48h時(shí)，5μMBITC處理組的抑制率為（18.67±2.56）%，80μMBITC處理組的抑制率則高達(dá)（56.78±4.21）%；處理72h時(shí)，5μMBITC處理組的抑制率為（25.45±3.01）%，80μMBITC處理組的抑制率更是達(dá)到（70.34±5.02）%。這一結(jié)果與眾多研究中BITC對(duì)其他癌細(xì)胞的抑制作用相似，進(jìn)一步證實(shí)了BITC作為一種天然抗癌化合物的有效性。BITC抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制可能是多方面的。BITC能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，通過激活caspase家族蛋白酶，促使癌細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。研究表明，BITC可以上調(diào)caspase-3、caspase-9的表達(dá)，從而誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，雖然未直接檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，但BITC處理后細(xì)胞增殖受到抑制，可能與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有關(guān)。BITC還可以阻斷細(xì)胞周期，將癌細(xì)胞阻滯在G2/M期，抑制癌細(xì)胞的增殖。在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的研究中發(fā)現(xiàn)，BITC處理后，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinB1和CDK1的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。這一機(jī)制可能在BITC抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖中也發(fā)揮著重要作用。BITC還具有抑制血管生成的作用，減少腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，BITC可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而抑制腫瘤血管生成。雖然本實(shí)驗(yàn)未對(duì)血管生成相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，但BITC抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖可能也與抑制血管生成間接相關(guān)。與其他抗癌藥物相比，BITC具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。許多傳統(tǒng)抗癌藥物在抑制癌細(xì)胞增殖的也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生較大的毒性，導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。順鉑是一種常用的化療藥物，在治療鼻咽癌等多種癌癥時(shí)，會(huì)引起惡心、嘔吐、腎毒性等不良反應(yīng)。而BITC作為一種天然的化合物，來源廣泛，毒性相對(duì)較低。研究表明，在一定劑量范圍內(nèi)，BITC對(duì)正常細(xì)胞的生長影響較小。這使得BITC在癌癥治療中具有更好的安全性和耐受性，為其臨床應(yīng)用提供了潛在的優(yōu)勢(shì)。BITC的抗癌作用具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。與一些單一靶點(diǎn)的抗癌藥物不同，BITC可以通過調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路和生物學(xué)過程來抑制癌細(xì)胞的增殖。如前文所述，BITC可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻斷細(xì)胞周期、抑制血管生成等多種機(jī)制發(fā)揮抗癌作用。這種多靶點(diǎn)的作用方式可能能夠更有效地抑制癌細(xì)胞的生長，同時(shí)降低癌細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。一些抗癌藥物由于作用靶點(diǎn)單一，癌細(xì)胞容易通過基因突變等方式產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。而BITC的多靶點(diǎn)作用機(jī)制可能使其在癌癥治療中具有更好的持久性和療效。4.2異硫氰酸芐酯對(duì)TβRIII表達(dá)的調(diào)控作用本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)異硫氰酸芐酯（BITC）能夠顯著下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII）在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。隨著BITC濃度的增加，TβRIII的表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這一結(jié)果表明，BITC對(duì)TβRIII的表達(dá)具有抑制作用。BITC影響TβRIII表達(dá)的機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。從轉(zhuǎn)錄水平來看，BITC可能通過與TβRIII基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的相互作用，從而抑制TβRIII基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，某些轉(zhuǎn)錄因子如SP1、NF-κB等參與調(diào)控TβRIII基因的轉(zhuǎn)錄。BITC可能通過調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)錄因子的活性，間接影響TβRIII基因的轉(zhuǎn)錄過程。有研究發(fā)現(xiàn)，BITC可以抑制NF-κB的活性，從而下調(diào)其靶基因的表達(dá)。TβRIII基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，因此，BITC可能通過抑制NF-κB與TβRIII基因啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制TβRIII的轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄后水平，BITC可能影響TβRIIImRNA的穩(wěn)定性。mRNA的穩(wěn)定性受到多種因素的調(diào)控，包括RNA結(jié)合蛋白、microRNA等。研究表明，某些microRNA如miR-21、miR-155等可以通過與TβRIIImRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，影響其穩(wěn)定性和翻譯效率。BITC可能通過調(diào)節(jié)這些microRNA的表達(dá)，間接影響TβRIIImRNA的穩(wěn)定性。有研究報(bào)道，BITC可以上調(diào)miR-21的表達(dá)，而miR-21可以靶向TβRIIImRNA，導(dǎo)致其降解增加，從而降低TβRIII的表達(dá)。從翻譯水平分析，BITC可能干擾TβRIII蛋白的合成過程。蛋白質(zhì)的合成涉及多個(gè)步驟，包括核糖體的組裝、mRNA的翻譯起始和延伸等。BITC可能通過影響這些過程中的關(guān)鍵因子，抑制TβRIII蛋白的合成。研究發(fā)現(xiàn)，BITC可以抑制某些蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的活性，如eIF4E、eEF2等。這些因子在蛋白質(zhì)合成的起始和延伸階段發(fā)揮重要作用，因此，BITC可能通過抑制這些因子的活性，干擾TβRIII蛋白的合成。本研究結(jié)果與相關(guān)研究具有一定的一致性。在對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，某些抗癌藥物可以通過下調(diào)TβRIII的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移。這表明TβRIII在腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，而BITC通過抑制TβRIII的表達(dá)，可能在鼻咽癌的治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。4.3異硫氰酸芐酯通過TβRIII抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制異硫氰酸芐酯（BITC）通過轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII）抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制與TGF-β信號(hào)通路密切相關(guān)。TGF-β信號(hào)通路是一條重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。正常情況下，TGF-β配體與TβRII結(jié)合，招募并磷酸化TβRI，形成TGF-β/TβRII/TβRI復(fù)合物。激活的TβRI進(jìn)而磷酸化下游的Smad蛋白，包括Smad2和Smad3。磷酸化的Smad2/3與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。在鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞中，BITC通過下調(diào)TβRIII的表達(dá)，影響TGF-β信號(hào)通路的傳導(dǎo)。TβRIII作為TGF-β的共受體，雖然本身不具有激酶活性，但能夠與TβRII和TβRI相互作用，調(diào)節(jié)TGF-β與受體的結(jié)合親和力以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。當(dāng)BITC降低TβRIII的表達(dá)時(shí)，TGF-β與受體復(fù)合物的形成受到阻礙，導(dǎo)致TGF-β信號(hào)通路的激活受到抑制。這可能使得Smad2/3的磷酸化水平降低，減少了Smad2/3-Smad4復(fù)合物向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響了下游靶基因的表達(dá)，最終抑制了CNE-2Z細(xì)胞的增殖。PI3K/Akt和MAPK等相關(guān)信號(hào)通路與TGF-β信號(hào)通路存在復(fù)雜的相互作用。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖、代謝等過程中起著重要作用。研究表明，TGF-β信號(hào)通路可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路來影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。在某些腫瘤細(xì)胞中，TGF-β激活可以抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞增殖；而在另一些情況下，TGF-β則可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。在BITC通過TβRIII抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的過程中，PI3K/Akt信號(hào)通路可能也參與其中。BITC下調(diào)TβRIII表達(dá)，抑制TGF-β信號(hào)通路，可能間接影響了PI3K/Akt信號(hào)通路的活性。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活A(yù)kt。激活的Akt可以磷酸化下游的多種底物，如GSK-3β、Bad等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和存活。當(dāng)TGF-β信號(hào)通路被抑制時(shí)，可能導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路的活性降低，從而減少了細(xì)胞的增殖信號(hào)，進(jìn)一步抑制了CNE-2Z細(xì)胞的生長。MAPK信號(hào)通路包括ERK、JNK和p38MAPK等多條途徑，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程。TGF-β信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路之間也存在相互調(diào)控關(guān)系。TGF-β可以通過激活Ras、Raf等上游分子，激活MAPK信號(hào)通路；而MAPK信號(hào)通路的激活也可以調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)和活性。在BITC抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制中，MAPK信號(hào)通路可能也發(fā)揮著重要作用。BITC通過抑制TβRIII介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)通路，可能影響了MAPK信號(hào)通路的激活。ERK是MAPK信號(hào)通路中的重要成員，其激活后可以磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)TGF-β信號(hào)通路被抑制時(shí)，可能導(dǎo)致ERK的激活受到抑制，從而減少了細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，抑制了CNE-2Z細(xì)胞的增殖。JNK和p38MAPK在細(xì)胞應(yīng)激和凋亡過程中發(fā)揮重要作用。BITC抑制TβRIII表達(dá)，可能通過激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步抑制CNE-2Z細(xì)胞的生長。綜上所述，異硫氰酸芐酯通過TβRIII抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制涉及TGF-β信號(hào)通路以及PI3K/Akt、MAPK等相關(guān)信號(hào)通路的相互作用。BITC下調(diào)TβRIII表達(dá)，抑制TGF-β信號(hào)通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而影響了其他相關(guān)信號(hào)通路的活性，最終抑制了鼻咽癌細(xì)胞的增殖。這些信號(hào)通路之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系為深入理解鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的治療策略提供了重要的理論基礎(chǔ)。4.4研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景本研究結(jié)果在鼻咽癌臨床治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景，為藥物研發(fā)和治療方案優(yōu)化提供了新的思路和理論依據(jù)。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，異硫氰酸芐酯（BITC）作為一種天然的化合物，具有低毒、高效的特點(diǎn)，有望開發(fā)成為新型的抗癌藥物。目前，臨床上使用的許多抗癌藥物存在副作用大、耐藥性等問題。順鉑是鼻咽癌化療的常用藥物，但長期使用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腎毒性、胃腸道反應(yīng)等副作用，且部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，影響治療效果。而BITC在本研究中表現(xiàn)出對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的顯著抑制作用，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性相對(duì)較低。這為開發(fā)新型的鼻咽癌治療藥物提供了潛在的候選化合物。通過進(jìn)一步的研究，優(yōu)化BITC的劑型和給藥方式，提高其生物利用度和療效，有望將其開發(fā)成為一種安全有效的抗癌藥物?？梢圆捎眉{米技術(shù)將BITC包裹在納米載體中，如納米脂質(zhì)體、納米膠束等，提高其穩(wěn)定性和靶向性，使其能夠更有效地作用于鼻咽癌細(xì)胞。本研究揭示了BITC通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII）的表達(dá)，調(diào)控TGF-β信號(hào)通路，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。這為開發(fā)針對(duì)TβRIII和TGF-β信號(hào)通路的靶向藥物提供了理論基礎(chǔ)?？梢栽O(shè)計(jì)和合成能夠特異性抑制TβRIII表達(dá)或阻斷TGF-β信號(hào)通路的小分子化合物或生物制劑。通過篩選和優(yōu)化，開發(fā)出能夠高效抑制TβRIII表達(dá)的小分子干擾RNA（siRNA）或反義寡核苷酸，將其導(dǎo)入鼻咽癌細(xì)胞中，特異性地降低TβRIII的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。也可以研發(fā)針對(duì)TGF-β信號(hào)通路關(guān)鍵分子的抑制劑，如TβRI激酶抑制劑，阻斷TGF-β信號(hào)的傳導(dǎo)，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。在治療方案優(yōu)化方面，本研究結(jié)果為鼻咽癌的聯(lián)合治療提供了新的策略。目前，鼻咽癌的治療主要采用放療、化療和手術(shù)治療等綜合治療方法，但仍存在治療效果不理想、復(fù)發(fā)率高等問題。將BITC與現(xiàn)有的治療方法相結(jié)合，可能會(huì)提高治療效果，降低復(fù)發(fā)率。在放療過程中，聯(lián)合使用BITC，可能會(huì)增強(qiáng)放療對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)減輕放療對(duì)正常組織的損傷。研究表明，某些天然化合物與放療聯(lián)合使用，可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，提高放療的敏感性。BITC具有抗氧化和抗炎作用，可能能夠減輕放療引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護(hù)正常組織。在化療中加入BITC，可能會(huì)減少化療藥物的用量，降低化療的副作用，同時(shí)增強(qiáng)化療的療效。通過聯(lián)合治療，可以充分發(fā)揮不同治療方法的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)鼻咽癌的精準(zhǔn)治療。本研究還為鼻咽癌的個(gè)性化治療提供了潛在的依據(jù)。不同患者的鼻咽癌組織中TβRIII的表達(dá)水平可能存在差異，這可能會(huì)影響患者對(duì)治療的反應(yīng)。通過檢測(cè)患者腫瘤組織中TβRIII的表達(dá)水平，可以預(yù)測(cè)患者對(duì)BITC或其他針對(duì)TβRIII的治療方法的敏感性，從而為患者制定個(gè)性化的治療方案。對(duì)于TβRIII高表達(dá)的患者，可以優(yōu)先考慮使用能夠抑制TβRIII表達(dá)的治療方法，如BITC或TβRIII靶向藥物；而對(duì)于TβRIII低表達(dá)的患者，則可以選擇其他更適合的治療策略。通過個(gè)性化治療，可以提高治療的針對(duì)性和有效性，改善患者的預(yù)后。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論本研究系統(tǒng)地探討了異硫氰酸芐酯（BITC）與轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ（TβRIII）抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z增殖的作用及機(jī)制，取得了以下主要研究成果：BITC對(duì)CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制作用：通過MTT實(shí)驗(yàn)，明確了BITC能夠顯著抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。隨著BITC濃度的增加和處理時(shí)間的延長，CNE-2Z細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。在處理24h時(shí)，5μMBITC處理組的細(xì)胞增殖抑制率為（10.56±2.13）%，當(dāng)BITC濃度達(dá)到80μM時(shí)，抑制率上升至（35.68±3.56）%；處理48h時(shí)，5μMBITC處理組的抑制率為（18.67±2.56）%，80μMBITC處理組的抑制率則高達(dá)（56.78±4.21）%；處理72h時(shí)，5μMBITC處理組的抑制率為（25.45±3.01）%，80μMBITC處理組的抑制率更是達(dá)到（70.34±5.02）%。這表明BITC在抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖方面具有顯著效果，為其作為潛在的抗癌藥物提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。BITC對(duì)TβRIII表達(dá)的調(diào)控作用：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)，從mRNA和蛋白水平證實(shí)了BITC能夠下調(diào)TβRIII的表達(dá)。隨著BITC濃度的增加，TβRIII的表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。在5μMBITC處理組中，TβRIIImRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.06），蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.78±0.05）；當(dāng)BITC濃度達(dá)到80μM時(shí)，TβRIIImRNA的相對(duì)表達(dá)量降至（0.32±0.03），蛋白相對(duì)表達(dá)量降至（0.28±0.02）。這一結(jié)果揭示了BITC抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖可能與下調(diào)TβRIII的表達(dá)有關(guān)，為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。BITC通過TβRIII抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制：通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和添加TβRIII激動(dòng)劑或抑制劑，深入探究了BITC通過TβRIII抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制。結(jié)果表明，BITC抑制CNE-2Z細(xì)胞生長的機(jī)制與TβRIII密切相關(guān)。BITC可能通過下調(diào)TβRIII的表達(dá)，抑制TβRIII介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。具體來說，BITC下調(diào)TβRIII表達(dá)，抑制了TGF-β信號(hào)通路的傳導(dǎo)，使得Smad2/3的磷酸化水平降低，減少了Smad2/3-Smad4復(fù)合物向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響了下游靶基因的表達(dá)，最終抑制了CNE-2Z細(xì)胞的增殖。PI3K/Akt和MAPK等相關(guān)信號(hào)通路也參與了這一過程。BITC下調(diào)TβRIII表達(dá)，抑制TGF-β信號(hào)通路，可能間接影響了PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，導(dǎo)致細(xì)胞增殖信號(hào)減少；同時(shí)，BITC可能通過激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步抑制CNE-2Z細(xì)胞的生長。5.