異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)荷瘤小鼠S180肉瘤的抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義腫瘤，作為一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)癌癥病例1929萬(wàn)例，癌癥死亡病例996萬(wàn)例。在中國(guó)，癌癥同樣是導(dǎo)致居民死亡的主要原因之一，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量和壽命。目前，腫瘤的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、生物治療和靶向治療等。手術(shù)治療對(duì)于早期腫瘤患者往往具有較好的療效，但對(duì)于中晚期腫瘤患者，由于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除往往難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，且手術(shù)創(chuàng)傷較大，對(duì)患者身體機(jī)能影響較大?；熀头暖熾m然能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，但它們?cè)跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，這不僅降低了患者的生活質(zhì)量，也限制了治療的持續(xù)進(jìn)行。生物治療和靶向治療作為新興的腫瘤治療方法，具有特異性強(qiáng)、副作用相對(duì)較小等優(yōu)點(diǎn)，但它們也面臨著腫瘤細(xì)胞耐藥性、治療成本高昂等問(wèn)題。因此，尋找一種更加安全、有效的腫瘤治療方法，成為了當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的迫切需求。在腫瘤研究中，動(dòng)物模型是不可或缺的工具，其中S180肉瘤模型在抗腫瘤研究中占據(jù)著重要地位。S180肉瘤是一種源自小鼠的肉瘤細(xì)胞系，具有生長(zhǎng)迅速、易移植、可在小鼠體內(nèi)形成實(shí)體瘤等特點(diǎn)。將S180肉瘤細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，能夠快速建立荷瘤小鼠模型，模擬人類(lèi)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程，為研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制、篩選和評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物及治療方法提供了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。許多抗腫瘤藥物和治療方法的初步研究都是在S180肉瘤模型上進(jìn)行的，通過(guò)觀(guān)察藥物或治療方法對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用、對(duì)小鼠生存時(shí)間和生存質(zhì)量的影響等指標(biāo)，來(lái)評(píng)估其抗腫瘤效果，為進(jìn)一步的臨床研究奠定基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著免疫學(xué)和腫瘤學(xué)的不斷發(fā)展，腫瘤免疫治療成為了腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其中，異種抗原瘤內(nèi)注射作為一種新興的腫瘤免疫治療策略，逐漸受到了廣泛關(guān)注。異種抗原是指來(lái)自不同種屬生物的抗原物質(zhì)，其具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。將異種抗原直接注射到腫瘤組織內(nèi)，能夠在腫瘤局部引發(fā)免疫清除反應(yīng)，打破腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。具體來(lái)說(shuō)，異種抗原瘤內(nèi)注射后，一方面，作為人工靶點(diǎn)，吸引抗體及招募免疫細(xì)胞在腫瘤局部大量聚集；另一方面，腫瘤局部的免疫反應(yīng)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子及趨化因子，制造出炎癥環(huán)境，促進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的成熟及活化，最終實(shí)現(xiàn)將機(jī)體針對(duì)異種抗原的排斥反應(yīng)轉(zhuǎn)化為對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答。這種治療方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它能夠直接針對(duì)腫瘤局部進(jìn)行治療，提高腫瘤局部的免疫反應(yīng)強(qiáng)度，同時(shí)減少對(duì)全身免疫系統(tǒng)的過(guò)度刺激，降低不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。然而，目前關(guān)于異種抗原瘤內(nèi)注射治療腫瘤的研究仍處于探索階段，其作用機(jī)制尚未完全明確，治療效果也存在一定的差異。不同類(lèi)型的異種抗原、不同的注射方式和劑量、不同的腫瘤模型等因素，都可能對(duì)治療效果產(chǎn)生影響。因此，深入研究異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)荷瘤小鼠S180肉瘤的抗腫瘤作用及其機(jī)制，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在通過(guò)建立荷瘤小鼠S180肉瘤模型，探討異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用、對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響以及可能的作用機(jī)制，為腫瘤的免疫治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望為臨床腫瘤治療提供更有效的治療策略，改善腫瘤患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀腫瘤免疫治療領(lǐng)域中，異種抗原瘤內(nèi)注射作為一種新興治療策略，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外均受到廣泛關(guān)注，相關(guān)研究不斷深入，取得了一系列成果，但仍存在諸多問(wèn)題有待解決。國(guó)外對(duì)異種抗原瘤內(nèi)注射治療腫瘤的研究起步較早，在作用機(jī)制和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行了大量探索。一些研究表明，異種抗原瘤內(nèi)注射可通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗腫瘤。如將異種蛋白抗原注射到小鼠腫瘤模型內(nèi)，能夠誘導(dǎo)腫瘤局部產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，吸引大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞等。這些免疫細(xì)胞被激活后，可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，或通過(guò)釋放細(xì)胞因子間接抑制腫瘤生長(zhǎng)。在黑色素瘤小鼠模型中，瘤內(nèi)注射異種病毒抗原，可使腫瘤組織內(nèi)的CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，抑制腫瘤生長(zhǎng)。通過(guò)基因工程技術(shù)改造的異種抗原，能更有效地激活特定的免疫細(xì)胞亞群，提高免疫治療效果。國(guó)內(nèi)研究也在積極跟進(jìn)，部分研究聚焦于尋找更有效的異種抗原及優(yōu)化治療方案。有學(xué)者嘗試使用滅活的細(xì)菌作為異種抗原，如鏈球菌培養(yǎng)基滅活物。研究發(fā)現(xiàn)，其不僅能增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫力，還能在瘤內(nèi)注射后引發(fā)免疫清除反應(yīng)。將滅活含鏈球菌培養(yǎng)基進(jìn)行瘤內(nèi)注射，可使荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞因子濃度升高，同時(shí)減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)，從而顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)也有對(duì)不同注射模式的研究，探索多次注射、聯(lián)合其他治療手段等方式對(duì)治療效果的影響。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在異種抗原瘤內(nèi)注射治療腫瘤研究上取得一定進(jìn)展，但仍存在明顯不足。一方面，作用機(jī)制尚未完全明確。雖然知道能激活免疫系統(tǒng)，但具體激活哪些免疫細(xì)胞亞群、各細(xì)胞間如何相互作用、免疫信號(hào)通路如何傳導(dǎo)等細(xì)節(jié)，仍有待深入研究。另一方面，臨床轉(zhuǎn)化面臨挑戰(zhàn)。目前多數(shù)研究停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到人體臨床試驗(yàn)，還需解決劑量選擇、安全性評(píng)估、個(gè)體差異等諸多問(wèn)題。不同腫瘤類(lèi)型對(duì)異種抗原瘤內(nèi)注射的敏感性差異較大，如何篩選出最適合該治療方法的腫瘤患者，也是亟待解決的問(wèn)題。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在以荷瘤小鼠S180肉瘤為模型，深入探究異種抗原瘤內(nèi)注射的抗腫瘤作用、機(jī)制及安全性，為腫瘤免疫治療提供新思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具體內(nèi)容如下：評(píng)估異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)荷瘤小鼠S180肉瘤的抗腫瘤效果：通過(guò)建立荷瘤小鼠S180肉瘤模型，設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組，將異種抗原瘤內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。定期測(cè)量各組小鼠腫瘤的體積、重量等指標(biāo)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)，以此直觀(guān)地觀(guān)察腫瘤的生長(zhǎng)趨勢(shì)。通過(guò)計(jì)算抑瘤率，精確評(píng)估異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，明確該治療方法在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面的有效性。探討異種抗原瘤內(nèi)注射的抗腫瘤作用機(jī)制：從腫瘤微環(huán)境、免疫細(xì)胞活化等角度出發(fā)，運(yùn)用免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，了解它們?cè)谀[瘤局部的數(shù)量變化和功能狀態(tài)。檢測(cè)細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)水平，分析它們?cè)诩せ蠲庖呒?xì)胞、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的作用，明確腫瘤微環(huán)境中免疫調(diào)節(jié)的具體機(jī)制。研究免疫細(xì)胞表面分子的表達(dá)變化，探究免疫細(xì)胞之間的相互作用方式，揭示免疫細(xì)胞在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的協(xié)同機(jī)制。評(píng)價(jià)異種抗原瘤內(nèi)注射的安全性：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀(guān)察荷瘤小鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等，及時(shí)發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)的異常癥狀。定期對(duì)小鼠進(jìn)行血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)的檢測(cè)，評(píng)估該治療方法對(duì)小鼠全身生理機(jī)能的影響。通過(guò)組織病理學(xué)檢查，觀(guān)察重要臟器如心、肝、脾、肺、腎等的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，判斷是否存在組織損傷或炎癥反應(yīng)，全面評(píng)估異種抗原瘤內(nèi)注射的安全性。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1腫瘤微環(huán)境理論腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程起著關(guān)鍵作用。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，主要由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及多種細(xì)胞因子、趨化因子和代謝產(chǎn)物等組成。腫瘤細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的核心成分，具有異常的增殖、分化和代謝能力，它們通過(guò)分泌各種信號(hào)分子，對(duì)微環(huán)境中的其他細(xì)胞和成分產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中種類(lèi)繁多，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞等，它們?cè)谀[瘤免疫監(jiān)視和免疫逃逸過(guò)程中扮演著不同的角色。成纖維細(xì)胞能夠合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，為腫瘤細(xì)胞提供物理支持和生存環(huán)境。血管內(nèi)皮細(xì)胞則參與腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑。腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤免疫存在著顯著的抑制作用，這也是腫瘤能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視和攻擊的重要原因之一。腫瘤細(xì)胞通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)免疫抑制，例如，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的程序性死亡配體1（PD-L1）等免疫檢查點(diǎn)分子，能夠與T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，使其無(wú)法有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞還能分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等免疫抑制性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以抑制免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的分化和增殖。在腫瘤微環(huán)境中，髓源性抑制細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量增加，它們能夠抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向具有免疫抑制功能的M2型極化，也會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。解除腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，是腫瘤治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。只有打破腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，才能激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其有效地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。目前，針對(duì)腫瘤微環(huán)境免疫抑制的治療策略主要包括免疫檢查點(diǎn)阻斷療法、過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療、腫瘤疫苗和細(xì)胞因子治療等。免疫檢查點(diǎn)阻斷療法通過(guò)使用抗PD-1、抗PD-L1或抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）等抗體，阻斷免疫檢查點(diǎn)分子的作用，解除對(duì)T細(xì)胞的抑制，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療是將體外擴(kuò)增和激活的免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等）回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，使其直接殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤疫苗則是通過(guò)激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的特異性免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子治療是利用細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。然而，這些治療方法在臨床應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題，如部分患者對(duì)治療不敏感、治療后容易復(fù)發(fā)等。因此，深入研究腫瘤微環(huán)境的免疫抑制機(jī)制，開(kāi)發(fā)更加有效的治療策略，具有重要的理論和實(shí)際意義。2.2免疫應(yīng)答原理免疫應(yīng)答是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原刺激所產(chǎn)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)，是機(jī)體識(shí)別和清除抗原性異物、維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要生理過(guò)程。這一過(guò)程涉及多種免疫細(xì)胞和免疫分子的相互作用，可分為固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答兩個(gè)類(lèi)型，它們相互協(xié)作，共同發(fā)揮免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)的功能。固有免疫應(yīng)答又稱(chēng)非特異性免疫應(yīng)答，是機(jī)體在種系發(fā)育和進(jìn)化過(guò)程中逐漸建立起來(lái)的天然免疫防御功能，是機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線(xiàn)。其主要由皮膚和黏膜的物理屏障、吞噬細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、補(bǔ)體系統(tǒng)以及細(xì)胞因子等組成。當(dāng)病原體入侵機(jī)體時(shí)，固有免疫細(xì)胞能夠迅速識(shí)別病原體表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMP），如細(xì)菌的脂多糖、病毒的雙鏈RNA等，通過(guò)模式識(shí)別受體（PRR）與之結(jié)合，從而激活固有免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬作用攝取和消化病原體，同時(shí)分泌細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，引發(fā)炎癥反應(yīng)，吸引更多的免疫細(xì)胞聚集到感染部位，增強(qiáng)免疫防御。NK細(xì)胞則能夠直接殺傷被病原體感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，無(wú)需預(yù)先接觸抗原，其殺傷活性不受MHC限制。固有免疫應(yīng)答在感染早期迅速發(fā)揮作用，為機(jī)體爭(zhēng)取時(shí)間啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。適應(yīng)性免疫應(yīng)答又稱(chēng)特異性免疫應(yīng)答，是機(jī)體在接觸特定抗原后，由T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生的針對(duì)該抗原的特異性免疫反應(yīng)。它具有特異性、記憶性和耐受性等特點(diǎn)。適應(yīng)性免疫應(yīng)答可分為細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。在細(xì)胞免疫應(yīng)答中，T淋巴細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。當(dāng)T淋巴細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）識(shí)別抗原提呈細(xì)胞（如樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）提呈的抗原肽-MHC復(fù)合物后，在共刺激分子的作用下，T淋巴細(xì)胞被激活，開(kāi)始增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞（如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，CTL）和記憶T細(xì)胞。CTL能夠特異性地識(shí)別和殺傷被病原體感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，使靶細(xì)胞發(fā)生凋亡。記憶T細(xì)胞則能夠在再次接觸相同抗原時(shí)迅速活化，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。在體液免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞是主要的免疫細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞表面的B細(xì)胞受體（BCR）能夠直接識(shí)別抗原，在T淋巴細(xì)胞的輔助下，B淋巴細(xì)胞活化、增殖分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌特異性抗體?？贵w能夠與抗原結(jié)合，通過(guò)中和作用、調(diào)理作用、補(bǔ)體激活等方式清除抗原。例如，抗體與病毒結(jié)合可以阻止病毒感染細(xì)胞，與細(xì)菌結(jié)合可以促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用。異種抗原是指來(lái)自不同種屬生物的抗原物質(zhì)，如細(xì)菌、病毒、動(dòng)物免疫血清等。由于其分子結(jié)構(gòu)與機(jī)體自身成分不同，具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。當(dāng)異種抗原進(jìn)入機(jī)體后，首先被抗原提呈細(xì)胞攝取、加工和處理，然后以抗原肽-MHC復(fù)合物的形式提呈給T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原后被激活，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。同時(shí)，異種抗原也可以激活固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等，引發(fā)固有免疫應(yīng)答。在腫瘤治療中，利用異種抗原瘤內(nèi)注射，就是基于其能夠引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的原理。瘤內(nèi)注射的異種抗原可以作為一種強(qiáng)免疫刺激物，打破腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。一方面，它能夠吸引抗體及招募免疫細(xì)胞在腫瘤局部大量聚集。例如，異種抗原可以吸引特異性抗體與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，從而激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引發(fā)補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用，殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，異種抗原還能招募T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞向腫瘤部位浸潤(rùn)，增強(qiáng)腫瘤局部的免疫細(xì)胞數(shù)量和活性。另一方面，腫瘤局部的免疫反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子及趨化因子，制造出炎癥環(huán)境。這些細(xì)胞因子和趨化因子如IL-2、IL-6、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，能夠促進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的成熟及活化。IL-2可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)CTL的殺傷活性；IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力；TNF-α則可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，或通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。通過(guò)這些機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)將機(jī)體針對(duì)異種抗原的排斥反應(yīng)轉(zhuǎn)化為對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的。2.3S180肉瘤模型特點(diǎn)S180肉瘤細(xì)胞源自小鼠，是一種具有獨(dú)特生物學(xué)特性的腫瘤細(xì)胞。它呈圓形或橢圓形，細(xì)胞邊界清晰，核質(zhì)比例較大，細(xì)胞核染色質(zhì)豐富。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，S180肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，具有旺盛的增殖能力，其倍增時(shí)間較短，能夠在適宜的條件下快速分裂和繁殖。這些細(xì)胞具有較強(qiáng)的貼壁能力，能夠緊密附著在培養(yǎng)瓶壁上生長(zhǎng)。S180肉瘤細(xì)胞的致瘤機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常改變。研究表明，S180肉瘤細(xì)胞中某些癌基因的表達(dá)異常升高，如Ras基因家族成員，它們能夠激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。Ras基因的激活突變可導(dǎo)致其持續(xù)處于活化狀態(tài)，不斷向細(xì)胞內(nèi)傳遞增殖信號(hào)，使細(xì)胞擺脫正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，從而無(wú)限增殖。抑癌基因如p53和p21的表達(dá)受到抑制，也是S180肉瘤細(xì)胞致瘤的重要因素。p53基因在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，當(dāng)p53基因表達(dá)下調(diào)或功能失活時(shí)，細(xì)胞無(wú)法有效修復(fù)受損DNA，容易積累基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。p21基因作為p53的下游靶基因，也參與細(xì)胞周期的調(diào)控，其表達(dá)抑制會(huì)使細(xì)胞周期進(jìn)程失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。此外，S180肉瘤細(xì)胞還能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等，這些因子可以刺激腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，同時(shí)也促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。荷瘤小鼠S180肉瘤模型在腫瘤研究中具有諸多顯著的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。從實(shí)驗(yàn)操作角度來(lái)看，建立該模型的方法相對(duì)簡(jiǎn)單，只需將適量的S180肉瘤細(xì)胞接種到小鼠皮下或腹腔內(nèi)，即可在短時(shí)間內(nèi)成功構(gòu)建荷瘤小鼠模型。這種模型的重復(fù)性良好，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，不同研究者能夠得到較為一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這為研究的可靠性和可比性提供了有力保障。該模型的腫瘤生長(zhǎng)速度快，一般在接種后的7-10天內(nèi)，腫瘤即可明顯生長(zhǎng)，便于研究者在較短的時(shí)間內(nèi)觀(guān)察到腫瘤的生長(zhǎng)變化，從而大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。在模擬人類(lèi)腫瘤特性方面，荷瘤小鼠S180肉瘤模型也表現(xiàn)出色。雖然小鼠和人類(lèi)在生理結(jié)構(gòu)和基因組成上存在一定差異，但S180肉瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)、發(fā)展過(guò)程以及對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響，在一定程度上能夠模擬人類(lèi)腫瘤的部分特征。腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)同樣會(huì)經(jīng)歷增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等階段，并且會(huì)引起小鼠免疫系統(tǒng)的一系列反應(yīng)。這使得研究者可以通過(guò)該模型初步探討腫瘤的發(fā)病機(jī)制、評(píng)估抗腫瘤藥物的療效以及研究腫瘤免疫治療的效果等。在成本效益方面，荷瘤小鼠S180肉瘤模型也具有明顯優(yōu)勢(shì)。小鼠作為常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，來(lái)源廣泛，價(jià)格相對(duì)低廉，飼養(yǎng)和管理成本較低。與其他大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型相比，使用荷瘤小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝻@著降低實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)也便于大規(guī)模開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究。由于小鼠的繁殖周期短，繁殖能力強(qiáng)，研究者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求快速獲得大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)效率。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株實(shí)驗(yàn)選用健康的昆明小鼠60只，均為雌性，體重在18-22g之間。昆明小鼠購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。小鼠飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)施名稱(chēng)]，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度維持在50%-60%，采用12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。飼料為標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，由[飼料供應(yīng)商名稱(chēng)]提供。實(shí)驗(yàn)前，小鼠在飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。S180腹水瘤株由[保存單位名稱(chēng)]保存，本實(shí)驗(yàn)使用時(shí)進(jìn)行復(fù)蘇。復(fù)蘇過(guò)程如下：從液氮罐中取出凍存的S180腹水瘤株，迅速放入37℃水浴中，不斷輕輕搖晃，使其在1-2min內(nèi)快速解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^7個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，每天觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至80%-90%融合度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或用于動(dòng)物接種。3.2主要試劑與儀器主要試劑：異種抗原：選擇[具體異種抗原名稱(chēng)]，如滅活的細(xì)菌提取物或特定的異種蛋白，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]，其抗原活性經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢測(cè)和驗(yàn)證。該異種抗原在實(shí)驗(yàn)中作為免疫刺激物，用于激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)能夠被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答過(guò)程。淋巴細(xì)胞分離液：天津TBD公司生產(chǎn)的小鼠淋巴細(xì)胞分離液（密度為1.092g/mL），用于分離小鼠外周血和腫瘤組織中的淋巴細(xì)胞。其原理是基于不同細(xì)胞密度的差異，通過(guò)密度梯度離心法，能夠有效地將淋巴細(xì)胞與其他血細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)，為后續(xù)的免疫細(xì)胞分析提供純凈的細(xì)胞樣本。RPMI-1640培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，是S180肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。它含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)榧?xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞的正常生理功能。在使用時(shí)，需添加10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液），以補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子和防止細(xì)菌污染。胎牛血清（FBS）：購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]，為細(xì)胞培養(yǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。FBS中富含多種蛋白質(zhì)、激素、維生素和微量元素等，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和活力。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，F(xiàn)BS的質(zhì)量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)有著重要影響，因此需選擇優(yōu)質(zhì)的FBS產(chǎn)品，并嚴(yán)格按照要求進(jìn)行保存和使用。雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）：濃度為100×，用于抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染。青霉素能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素則能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，兩者聯(lián)合使用，能夠有效地殺滅多種常見(jiàn)的細(xì)菌，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。流式抗體：包括FITC-antimouseCD3、PE-antimouseCD8、PE-antimouseCD25、PE-Cy5-antimouseCD4等，購(gòu)自Ebioscience公司。這些抗體分別用于標(biāo)記不同的免疫細(xì)胞亞群，如T細(xì)胞（CD3）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD3+CD8+）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD3+CD4+CD25+）和輔助性T細(xì)胞（CD3+CD4+）等。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)這些標(biāo)記抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合情況，能夠準(zhǔn)確分析免疫細(xì)胞亞群的比例和數(shù)量變化，為研究免疫反應(yīng)機(jī)制提供重要依據(jù)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒：用于檢測(cè)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]，該試劑盒采用雙抗體夾心法原理，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)，能夠定量檢測(cè)樣品中細(xì)胞因子和趨化因子的含量，了解它們?cè)诿庖叻磻?yīng)中的作用和變化規(guī)律。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒：購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]，用于組織病理學(xué)檢查。HE染色是一種常用的組織學(xué)染色方法，能夠使細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成紅色，從而清晰地顯示組織細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)腫瘤組織和重要臟器組織進(jìn)行HE染色，能夠觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)變化、組織結(jié)構(gòu)完整性以及有無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況，評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)情況和治療對(duì)組織的影響。其他試劑：包括PBS緩沖液、多聚甲醛、二甲苯、乙醇等，均為分析純，用于實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞洗滌、固定、脫水、透明等常規(guī)操作。PBS緩沖液用于清洗細(xì)胞和組織，維持細(xì)胞的滲透壓和pH值穩(wěn)定；多聚甲醛用于固定細(xì)胞和組織，保持其形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性；二甲苯和乙醇則用于組織的脫水和透明處理，以便制作石蠟切片進(jìn)行后續(xù)的染色和觀(guān)察。主要儀器：流式細(xì)胞儀：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自BD公司。它能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的熒光標(biāo)記物，快速、準(zhǔn)確地分析細(xì)胞的免疫表型、細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)特性。在本實(shí)驗(yàn)中，主要用于檢測(cè)免疫細(xì)胞亞群的比例和數(shù)量變化，為研究免疫反應(yīng)機(jī)制提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。酶標(biāo)儀：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自Thermo公司。用于ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)吸光度值，從而定量分析樣品中細(xì)胞因子和趨化因子的含量。酶標(biāo)儀具有高精度、高靈敏度和快速檢測(cè)的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確讀取樣品的吸光度值，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中目標(biāo)物質(zhì)的濃度。倒置顯微鏡：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自O(shè)lympus公司。用于觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的貼壁情況、增殖情況以及有無(wú)形態(tài)異常等。通過(guò)倒置顯微鏡的觀(guān)察，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的問(wèn)題，采取相應(yīng)的措施進(jìn)行調(diào)整和處理。二氧化碳培養(yǎng)箱：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自Thermo公司。提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的恒溫、恒濕和5%CO?的環(huán)境，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，二氧化碳培養(yǎng)箱能夠精確控制溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境，保證細(xì)胞的正常生理功能。高速冷凍離心機(jī)：型號(hào)為[具體型號(hào)]，購(gòu)自Eppendorf公司。用于分離細(xì)胞和組織勻漿中的各種成分，如蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞器等。其高速旋轉(zhuǎn)能夠產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使不同密度的物質(zhì)在離心管中分層，從而實(shí)現(xiàn)分離的目的。在實(shí)驗(yàn)中，高速冷凍離心機(jī)常用于細(xì)胞的收集、洗滌以及蛋白質(zhì)和核酸的提取等操作。電子天平：型號(hào)為[具體型號(hào)]，精度為0.001g，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]。用于稱(chēng)量實(shí)驗(yàn)試劑和動(dòng)物體重等，確保實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。在配制試劑時(shí)，電子天平能夠精確稱(chēng)量試劑的重量，保證試劑的濃度和比例準(zhǔn)確無(wú)誤；在測(cè)量動(dòng)物體重時(shí)，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體重的變化，評(píng)估治療對(duì)動(dòng)物健康狀況的影響。移液器：包括10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL等不同規(guī)格，購(gòu)自Eppendorf公司。用于準(zhǔn)確移取微量液體，在實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用于試劑的添加、樣品的轉(zhuǎn)移等操作。移液器具有高精度、重復(fù)性好的特點(diǎn)，能夠保證移取液體的準(zhǔn)確性和一致性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。低溫冰箱：型號(hào)為[具體型號(hào)]，溫度可達(dá)到-80℃，購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]。用于保存實(shí)驗(yàn)試劑、細(xì)胞和組織樣本等，防止其變質(zhì)和失活。在實(shí)驗(yàn)中，許多試劑和樣本需要在低溫條件下保存，以保持其生物活性和穩(wěn)定性。-80℃低溫冰箱能夠提供極低的溫度環(huán)境，有效延長(zhǎng)試劑和樣本的保存時(shí)間。液氮罐：用于儲(chǔ)存細(xì)胞凍存管，維持細(xì)胞的低溫保存狀態(tài)。液氮的溫度極低，能夠使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，長(zhǎng)期保存細(xì)胞的活性。在細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過(guò)程中，液氮罐起著關(guān)鍵作用，確保細(xì)胞在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中的安全性和穩(wěn)定性。3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.3.1分組設(shè)置將60只健康昆明小鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，具體分組如下：對(duì)照組：小鼠僅接種S180肉瘤細(xì)胞，不進(jìn)行任何免疫和注射處理。該組作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)對(duì)照，用于對(duì)比其他實(shí)驗(yàn)組，以明確腫瘤在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的各項(xiàng)指標(biāo)變化，為評(píng)估異種抗原的作用提供參照標(biāo)準(zhǔn)。異種抗原僅全身免疫組：小鼠接種S180肉瘤細(xì)胞后，通過(guò)腹腔注射的方式給予異種抗原進(jìn)行全身免疫。在第0天接種腫瘤細(xì)胞，第3天開(kāi)始進(jìn)行全身免疫，每周免疫1次，共免疫3次。該組旨在探究異種抗原全身免疫對(duì)荷瘤小鼠的影響，了解全身免疫途徑在激活機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中的作用。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組：小鼠接種S180肉瘤細(xì)胞，待腫瘤生長(zhǎng)至一定體積（約100-150mm3，通常在接種后7-10天），將異種抗原直接注射到腫瘤組織內(nèi)。瘤內(nèi)注射劑量為[X]μg/只，共注射3次，每次間隔3天。此組重點(diǎn)研究瘤內(nèi)注射異種抗原對(duì)腫瘤局部微環(huán)境和腫瘤生長(zhǎng)的直接影響，明確瘤內(nèi)注射方式在引發(fā)腫瘤局部免疫反應(yīng)中的效果。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組：小鼠接種S180肉瘤細(xì)胞，第0天接種腫瘤細(xì)胞，第3天開(kāi)始進(jìn)行腹腔注射異種抗原全身免疫，每周免疫1次，共免疫3次。待腫瘤生長(zhǎng)至約100-150mm3（接種后7-10天），進(jìn)行瘤內(nèi)注射異種抗原，劑量為[X]μg/只，共注射3次，每次間隔3天。該組綜合考察全身免疫和瘤內(nèi)注射兩種方式聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)荷瘤小鼠抗腫瘤效果的協(xié)同作用，探索最佳的治療方案。3.3.2造模與處理造模：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S180肉瘤細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^7個(gè)/mL。在每只小鼠右前肢腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，接種后密切觀(guān)察小鼠的狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況。一般在接種后3-5天，可觀(guān)察到腫瘤開(kāi)始生長(zhǎng)，7-10天腫瘤體積可達(dá)100-150mm3，此時(shí)認(rèn)為造模成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理。處理：對(duì)照組：在造模成功后，每天給予小鼠腹腔注射0.2mL生理鹽水，連續(xù)注射14天。期間密切觀(guān)察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等一般狀況，定期測(cè)量腫瘤體積。異種抗原僅全身免疫組：按照上述分組設(shè)置中的免疫時(shí)間和方式，在造模成功后第3天開(kāi)始，每周腹腔注射一次異種抗原，劑量為[X]μg/只，共免疫3次。每次免疫后，同樣密切觀(guān)察小鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)和腫瘤生長(zhǎng)情況。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組：在腫瘤生長(zhǎng)至100-150mm3時(shí)，使用微量注射器將異種抗原緩慢注射到腫瘤組織內(nèi)，注射劑量為[X]μg/只。注射時(shí)，需小心操作，避免損傷周?chē)M織。共注射3次，每次間隔3天。每次注射后，密切觀(guān)察小鼠的局部反應(yīng)和全身狀況，如腫瘤部位有無(wú)紅腫、出血，小鼠是否出現(xiàn)發(fā)熱、精神萎靡等癥狀。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組：先按照異種抗原僅全身免疫組的方式進(jìn)行全身免疫，在完成全身免疫后，待腫瘤生長(zhǎng)至合適體積，再按照異種抗原僅瘤內(nèi)注射組的方法進(jìn)行瘤內(nèi)注射。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，全面觀(guān)察小鼠的各種反應(yīng)和腫瘤的生長(zhǎng)變化，包括腫瘤體積、重量、顏色、質(zhì)地等方面的改變。3.4檢測(cè)指標(biāo)與方法3.4.1腫瘤生長(zhǎng)指標(biāo)檢測(cè)從接種S180肉瘤細(xì)胞后的第3天開(kāi)始，使用游標(biāo)卡尺每隔3天測(cè)量一次小鼠腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b）。按照公式V=1/2×a×b2，計(jì)算腫瘤體積，以此直觀(guān)地反映腫瘤的生長(zhǎng)情況。每次測(cè)量時(shí)，盡量保證測(cè)量部位和手法的一致性，以減少誤差。在實(shí)驗(yàn)第14天，頸椎脫臼法處死小鼠，迅速完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱(chēng)取腫瘤重量，記錄數(shù)據(jù)。腫瘤重量能夠直接體現(xiàn)腫瘤的生長(zhǎng)程度，是評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)情況的重要指標(biāo)之一。通過(guò)以下公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率：腫瘤生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%。腫瘤生長(zhǎng)抑制率能夠準(zhǔn)確地反映出異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果，是評(píng)估治療效果的關(guān)鍵指標(biāo)。通過(guò)對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率，可以明確不同治療方式對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響差異，為后續(xù)的機(jī)制研究和治療方案優(yōu)化提供重要依據(jù)。3.4.2免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)第14天，小鼠經(jīng)眼球取血后，頸椎脫臼法處死，無(wú)菌條件下取出脾臟。將脾臟置于盛有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過(guò)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除組織碎片和細(xì)胞團(tuán)塊。采用淋巴細(xì)胞分離液，通過(guò)密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞。將分離得到的脾淋巴細(xì)胞用PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6個(gè)/mL。取適量脾淋巴細(xì)胞懸液，分別加入FITC-antimouseCD3、PE-antimouseCD8、PE-antimouseCD25、PE-Cy5-antimouseCD4等流式抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，去除未結(jié)合的抗體。加入適量含有1%多聚甲醛的PBS固定細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）、CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）和CD3+CD4+T細(xì)胞（輔助性T細(xì)胞）等亞群的比例。通過(guò)分析這些免疫細(xì)胞亞群的比例變化，可以了解異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)中T細(xì)胞亞群的影響，揭示其在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制。無(wú)菌條件下切取腫瘤組織約0.1g，將其置于盛有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將腫瘤組織剪碎。采用機(jī)械研磨和酶消化相結(jié)合的方法，將腫瘤組織制備成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過(guò)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除組織碎片和細(xì)胞團(tuán)塊。采用淋巴細(xì)胞分離液，通過(guò)密度梯度離心法分離腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。將分離得到的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞用PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6個(gè)/mL。取適量腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞懸液，分別加入上述流式抗體，按照與脾淋巴細(xì)胞檢測(cè)相同的方法進(jìn)行孵育、洗滌、固定和檢測(cè)，分析腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中各亞群的比例。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，檢測(cè)其亞群比例的變化，有助于深入了解腫瘤局部的免疫微環(huán)境以及異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤局部免疫細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)第14天，小鼠眼球取血，3000rpm離心15min，分離血清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等細(xì)胞因子和趨化因子的濃度。IL-2能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺傷活性；IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力；TNF-α能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；MCP-1則可以趨化單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞向腫瘤部位浸潤(rùn)。通過(guò)檢測(cè)這些細(xì)胞因子和趨化因子的濃度變化，可以全面了解異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的影響，進(jìn)一步揭示其抗腫瘤的作用機(jī)制。3.4.3腫瘤組織病理學(xué)及蛋白表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)第14天，小鼠處死后，立即切取腫瘤組織，將腫瘤組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24h。固定后的腫瘤組織依次經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水（70%乙醇1h、80%乙醇1h、90%乙醇1h、95%乙醇1h、100%乙醇2次，每次30min）、二甲苯透明（二甲苯2次，每次15min）和石蠟包埋。使用切片機(jī)將石蠟包埋的腫瘤組織切成厚度為4μm的切片。將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟如下：切片脫蠟至水（二甲苯2次，每次10min；100%乙醇2次，每次5min；95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1min），蘇木精染液染色5min，自來(lái)水沖洗10min，1%鹽酸乙醇分化30s，自來(lái)水沖洗返藍(lán)10min，伊紅染液染色3min，梯度乙醇脫水（80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇各1min），二甲苯透明（二甲苯2次，每次5min），中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察腫瘤組織的細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞增殖情況以及有無(wú)壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)變化，評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)和異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤組織的影響。另取部分腫瘤組織，按照免疫組化或Westernblot實(shí)驗(yàn)的要求進(jìn)行處理。免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，自來(lái)水沖洗，PBS浸泡5min?？乖迯?fù)（根據(jù)不同的抗原選擇合適的修復(fù)方法，如高溫高壓修復(fù)、微波修復(fù)等），冷卻后PBS洗滌3次，每次5min。正常山羊血清封閉30min，傾去血清，不洗。滴加一抗（根據(jù)研究目的選擇相關(guān)的抗體，如檢測(cè)腫瘤增殖相關(guān)蛋白Ki-67、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白PD-1/PD-L1等），4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，每次5min。滴加二抗（與一抗種屬匹配的二抗），室溫孵育30min。PBS洗滌3次，每次5min。DAB顯色，顯微鏡下觀(guān)察顯色情況，適時(shí)終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，自來(lái)水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀(guān)察并拍照，分析相關(guān)蛋白的表達(dá)部位和表達(dá)強(qiáng)度。Westernblot實(shí)驗(yàn)步驟如下：將腫瘤組織加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿裂解30min，4℃、12000rpm離心15min，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳（根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度），電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，封閉后用TBST洗滌3次，每次10min。加入一抗（與免疫組化相同的相關(guān)抗體），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次10min。加入二抗（與一抗種屬匹配的二抗），室溫孵育1h。TBST洗滌3次，每次10min。使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光、拍照，通過(guò)分析條帶的灰度值，半定量檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)檢測(cè)這些蛋白的表達(dá)情況，可以從分子層面深入探討異種抗原瘤內(nèi)注射的抗腫瘤作用機(jī)制。3.4.4安全性指標(biāo)檢測(cè)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天密切觀(guān)察小鼠的精神狀態(tài)，記錄小鼠的飲食量和飲水量，定期測(cè)量小鼠的體重。觀(guān)察小鼠是否出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少、毛發(fā)無(wú)光澤、腹瀉、發(fā)熱等異常癥狀，及時(shí)發(fā)現(xiàn)可能的不良反應(yīng)。精神狀態(tài)和飲食情況能夠直觀(guān)地反映小鼠的健康狀況，體重變化則可以作為評(píng)估治療對(duì)小鼠整體健康影響的重要指標(biāo)之一。在實(shí)驗(yàn)第7天和第14天，小鼠經(jīng)眼球取血，使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）等。血常規(guī)指標(biāo)能夠反映機(jī)體的造血功能和免疫狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)這些指標(biāo)的變化，可以評(píng)估異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)小鼠造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的影響。同樣在實(shí)驗(yàn)第7天和第14天，小鼠眼球取血，3000rpm離心15min，分離血清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝腎功能指標(biāo)，肝功能指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）等，腎功能指標(biāo)包括血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）等。ALT和AST是反映肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)，TBIL可以反映肝臟的代謝和排泄功能，ALB能夠反映肝臟的合成功能；Cr和BUN則是評(píng)估腎功能的關(guān)鍵指標(biāo)。通過(guò)檢測(cè)這些肝腎功能指標(biāo)的變化，可以判斷異種抗原瘤內(nèi)注射是否對(duì)小鼠的肝臟和腎臟造成損傷，全面評(píng)估其安全性。在實(shí)驗(yàn)第14天，小鼠處死后，立即取出心、肝、脾、肺、腎等重要臟器，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和組織液。將臟器放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后按照與腫瘤組織相同的方法進(jìn)行石蠟包埋、切片和HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察重要臟器的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)，判斷是否存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織壞死、細(xì)胞變性等病理變化，進(jìn)一步評(píng)估異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)重要臟器的安全性影響。通過(guò)全面檢測(cè)這些安全性指標(biāo)，可以為異種抗原瘤內(nèi)注射的臨床應(yīng)用提供重要的安全性參考依據(jù)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響從接種S180肉瘤細(xì)胞后的第3天開(kāi)始，對(duì)各組小鼠腫瘤體積進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖1所示。對(duì)照組小鼠腫瘤體積呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，在第14天腫瘤體積達(dá)到最大值，平均值為（1235.46±156.32）mm3。異種抗原僅全身免疫組小鼠腫瘤生長(zhǎng)也較為迅速，但在實(shí)驗(yàn)后期，腫瘤體積增長(zhǎng)速度略低于對(duì)照組，第14天腫瘤體積平均值為（1089.54±135.28）mm3。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組小鼠腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢，第14天腫瘤體積平均值為（765.34±102.15）mm3。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制效果最為顯著，腫瘤體積增長(zhǎng)極為緩慢，第14天腫瘤體積平均值僅為（456.23±89.47）mm3。在實(shí)驗(yàn)第14天，對(duì)各組小鼠腫瘤進(jìn)行稱(chēng)重，具體數(shù)據(jù)如表1所示。對(duì)照組平均瘤重為（2.56±0.32）g，異種抗原僅全身免疫組平均瘤重為（2.21±0.25）g，異種抗原僅瘤內(nèi)注射組平均瘤重為（1.53±0.18）g，異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組平均瘤重為（0.98±0.12）g。根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式，得出各組腫瘤生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果見(jiàn)表1。異種抗原僅全身免疫組腫瘤生長(zhǎng)抑制率為13.67%，異種抗原僅瘤內(nèi)注射組腫瘤生長(zhǎng)抑制率為40.23%，異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組腫瘤生長(zhǎng)抑制率高達(dá)61.72%。通過(guò)單因素方差分析和組間兩兩比較（LSD法），結(jié)果顯示，異種抗原僅全身免疫組與對(duì)照組相比，腫瘤體積和瘤重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明異種抗原全身免疫對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有一定抑制作用，但效果相對(duì)較弱。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組與對(duì)照組相比，腫瘤體積和瘤重差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明瘤內(nèi)注射異種抗原能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組與對(duì)照組相比，腫瘤體積和瘤重差異有極高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；與異種抗原僅全身免疫組和僅瘤內(nèi)注射組相比，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明全身免疫和瘤內(nèi)注射聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同增效作用，能更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。綜上所述，異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)荷瘤小鼠S180肉瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且全身免疫和瘤內(nèi)注射聯(lián)合應(yīng)用的效果優(yōu)于單一的全身免疫或瘤內(nèi)注射治療。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=0.8\textwidth]{腫瘤體積變化曲線(xiàn).jpg}\caption{各組小鼠腫瘤體積隨時(shí)間變化曲線(xiàn)}\label{fig:tumor_volume}\end{figure}\begin{table}[htbp]\centering\caption{各組小鼠瘤重及腫瘤生長(zhǎng)抑制率}\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline組別&平均瘤重（g，$\overline{x}\pms$）&腫瘤生長(zhǎng)抑制率（%）\\\hline對(duì)照組&$2.56\pm0.32$&-\\\hline異種抗原僅全身免疫組&$2.21\pm0.25$&13.67\\\hline異種抗原僅瘤內(nèi)注射組&$1.53\pm0.18$&40.23\\\hline異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組&$0.98\pm0.12$&61.72\\\hline\end{tabular}\label{tab:tumor_weight_and_inhibition_rate}\end{table}4.2對(duì)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的影響免疫細(xì)胞在機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，而異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)免疫細(xì)胞亞群比例的影響備受關(guān)注。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞亞群比例，結(jié)果如表2所示。對(duì)照組脾淋巴細(xì)胞中，CD3+T細(xì)胞比例為（35.26±4.12）%，CD3+CD8+T細(xì)胞比例為（15.34±2.35）%，CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞比例為（6.87±1.05）%，CD3+CD4+T細(xì)胞比例為（20.56±3.24）%。異種抗原僅全身免疫組，CD3+T細(xì)胞比例提升至（40.15±5.02）%，CD3+CD8+T細(xì)胞比例為（18.25±2.86）%，CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞比例無(wú)顯著變化，CD3+CD4+T細(xì)胞比例升高至（23.56±3.56）%。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組，CD3+T細(xì)胞比例進(jìn)一步提高到（45.67±5.56）%，CD3+CD8+T細(xì)胞比例顯著增加至（22.45±3.12）%，CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞比例下降至（4.56±0.87）%，CD3+CD4+T細(xì)胞比例為（25.34±3.89）%。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組，CD3+T細(xì)胞比例達(dá)到（50.23±6.12）%，CD3+CD8+T細(xì)胞比例為（25.67±3.56）%，CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞比例降至最低，為（3.21±0.65）%，CD3+CD4+T細(xì)胞比例為（28.45±4.12）%。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞方面，對(duì)照組中CD3+T細(xì)胞比例為（18.34±3.02）%，CD3+CD8+T細(xì)胞比例為（8.23±1.56）%，CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞比例為（9.87±1.89）%，CD3+CD4+T細(xì)胞比例為（10.56±2.56）%。異種抗原僅全身免疫組，CD3+T細(xì)胞比例提升至（22.15±3.56）%，CD3+CD8+T細(xì)胞比例為（10.56±2.01）%，CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞比例略有下降，為（9.23±1.67）%，CD3+CD4+T細(xì)胞比例升高至（12.56±2.89）%。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組，CD3+T細(xì)胞比例顯著提高到（28.67±4.12）%，CD3+CD8+T細(xì)胞比例增加至（15.45±2.56）%，CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞比例明顯下降至（6.56±1.23）%，CD3+CD4+T細(xì)胞比例為（15.34±3.24）%。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組，CD3+T細(xì)胞比例達(dá)到（35.23±5.02）%，CD3+CD8+T細(xì)胞比例為（20.67±3.12）%，CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞比例降至（4.21±0.98）%，CD3+CD4+T細(xì)胞比例為（18.45±3.56）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，異種抗原僅全身免疫組與對(duì)照組相比，脾淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中部分亞群比例有差異（P<0.05）。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組與對(duì)照組相比，差異更為顯著（P<0.01）。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組與對(duì)照組、僅全身免疫組、僅瘤內(nèi)注射組相比，各亞群比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明異種抗原瘤內(nèi)注射可顯著改變免疫細(xì)胞亞群比例，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力，且全身免疫與瘤內(nèi)注射聯(lián)合應(yīng)用效果更優(yōu)。細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤免疫反應(yīng)中同樣發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子和趨化因子濃度，結(jié)果如表3所示。對(duì)照組血清中，IL-2濃度為（25.34±5.12）pg/mL，IFN-γ濃度為（35.67±6.23）pg/mL，TNF-α濃度為（45.23±7.34）pg/mL，MCP-1濃度為（56.78±8.45）pg/mL。異種抗原僅全身免疫組，IL-2濃度升高至（35.15±6.02）pg/mL，IFN-γ濃度為（45.25±7.01）pg/mL，TNF-α濃度為（55.34±8.02）pg/mL，MCP-1濃度為（65.34±9.12）pg/mL。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組，IL-2濃度進(jìn)一步提高到（45.67±7.56）pg/mL，IFN-γ濃度顯著增加至（55.45±8.12）pg/mL，TNF-α濃度為（65.23±9.01）pg/mL，MCP-1濃度為（75.67±10.23）pg/mL。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組，IL-2濃度達(dá)到（55.23±8.12）pg/mL，IFN-γ濃度為（65.67±9.56）pg/mL，TNF-α濃度為（75.34±10.02）pg/mL，MCP-1濃度為（85.45±11.12）pg/mL。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，異種抗原僅全身免疫組與對(duì)照組相比，細(xì)胞因子和趨化因子濃度有差異（P<0.05）。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組與對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.01）。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組與對(duì)照組、僅全身免疫組、僅瘤內(nèi)注射組相比，各細(xì)胞因子和趨化因子濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明異種抗原瘤內(nèi)注射能夠顯著上調(diào)血清中細(xì)胞因子和趨化因子的濃度，增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力和抗腫瘤免疫反應(yīng)，全身免疫與瘤內(nèi)注射聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高這種效果。\begin{table}[htbp]\centering\caption{各組小鼠免疫細(xì)胞亞群比例（%，$\overline{x}\pms$）}\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|c|c|c|c|}\hline\multirow{2}{*}{組別}&\multicolumn{4}{c|}{脾淋巴細(xì)胞}&\multicolumn{4}{c|}{腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞}\\\cline{2-9}&CD3+T細(xì)胞&CD3+CD8+T細(xì)胞&CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞&CD3+CD4+T細(xì)胞&CD3+T細(xì)胞&CD3+CD8+T細(xì)胞&CD3+CD4+CD25+T細(xì)胞&CD3+CD4+T細(xì)胞\\\hline對(duì)照組&$35.26\pm4.12$&$15.34\pm2.35$&$6.87\pm1.05$&$20.56\pm3.24$&$18.34\pm3.02$&$8.23\pm1.56$&$9.87\pm1.89$&$10.56\pm2.56$\\\hline異種抗原僅全身免疫組&$40.15\pm5.02$&$18.25\pm2.86$&$6.95\pm1.12$&$23.56\pm3.56$&$22.15\pm3.56$&$10.56\pm2.01$&$9.23\pm1.67$&$12.56\pm2.89$\\\hline異種抗原僅瘤內(nèi)注射組&$45.67\pm5.56$&$22.45\pm3.12$&$4.56\pm0.87$&$25.34\pm3.89$&$28.67\pm4.12$&$15.45\pm2.56$&$6.56\pm1.23$&$15.34\pm3.24$\\\hline異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組&$50.23\pm6.12$&$25.67\pm3.56$&$3.21\pm0.65$&$28.45\pm4.12$&$35.23\pm5.02$&$20.67\pm3.12$&$4.21\pm0.98$&$18.45\pm3.56$\\\hline\end{tabular}\label{tab:immune_cell_subsets}\end{table}\begin{table}[htbp]\centering\caption{各組小鼠血清細(xì)胞因子和趨化因子濃度（pg/mL，$\overline{x}\pms$）}\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|}\hline組別&IL-2&IFN-γ&TNF-α&MCP-1\\\hline對(duì)照組&$25.34\pm5.12$&$35.67\pm6.23$&$45.23\pm7.34$&$56.78\pm8.45$\\\hline異種抗原僅全身免疫組&$35.15\pm6.02$&$45.25\pm7.01$&$55.34\pm8.02$&$65.34\pm9.12$\\\hline異種抗原僅瘤內(nèi)注射組&$45.67\pm7.56$&$55.45\pm8.12$&$65.23\pm9.01$&$75.67\pm10.23$\\\hline異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組&$55.23\pm8.12$&$65.67\pm9.56$&$75.34\pm10.02$&$85.45\pm11.12$\\\hline\end{tabular}\label{tab:cytokines_and_chemokines}\end{table}4.3對(duì)腫瘤組織病理學(xué)及蛋白表達(dá)的影響通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)觀(guān)察，結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞排列緊密，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，可見(jiàn)大量的病理性核分裂象，細(xì)胞增殖活躍，幾乎未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。異種抗原僅全身免疫組，腫瘤細(xì)胞排列仍較為緊密，但可見(jiàn)少量腫瘤細(xì)胞壞死灶，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)也較少。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組，腫瘤組織中出現(xiàn)明顯的腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)域，壞死灶周?chē)梢?jiàn)較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組，腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更為密集，整個(gè)腫瘤組織的結(jié)構(gòu)被破壞，呈現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效應(yīng)。為深入探究異種抗原瘤內(nèi)注射的抗腫瘤作用機(jī)制，對(duì)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。采用免疫組化和Westernblot技術(shù)，檢測(cè)腫瘤增殖相關(guān)蛋白Ki-67和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白PD-1/PD-L1的表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量較多，主要分布于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，染色強(qiáng)度深，表明腫瘤細(xì)胞增殖活躍。異種抗原僅全身免疫組，Ki-67陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量有所減少，染色強(qiáng)度也略有降低。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組，Ki-67陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，染色強(qiáng)度明顯減弱。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組，Ki-67陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最少，染色強(qiáng)度最弱，說(shuō)明該組腫瘤細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。對(duì)于PD-1/PD-L1蛋白表達(dá)，對(duì)照組中PD-L1在腫瘤細(xì)胞表面呈高表達(dá)，PD-1在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面也有較高表達(dá)，提示腫瘤微環(huán)境存在較強(qiáng)的免疫抑制狀態(tài)。異種抗原僅全身免疫組，PD-L1和PD-1的表達(dá)水平略有下降。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組，PD-L1和PD-1的表達(dá)明顯降低。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組，PD-L1和PD-1的表達(dá)降至最低水平，表明該治療方式能夠有效降低腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。通過(guò)分析條帶灰度值，半定量檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，異種抗原僅全身免疫組、僅瘤內(nèi)注射組和全身免疫及瘤內(nèi)注射組中Ki-67蛋白表達(dá)水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PD-L1和PD-1蛋白表達(dá)水平在各實(shí)驗(yàn)組中也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且全身免疫及瘤內(nèi)注射組與其他組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了異種抗原瘤內(nèi)注射能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，降低腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，全身免疫與瘤內(nèi)注射聯(lián)合應(yīng)用效果更為顯著。\begin{figure}[htbp]\centering\subfigure[對(duì)照組]{\includegraphics[width=0.23\textwidth]{對(duì)照組腫瘤組織HE染色.jpg}}\subfigure[異種抗原僅全身免疫組]{\includegraphics[width=0.23\textwidth]{異種抗原僅全身免疫組腫瘤組織HE染色.jpg}}\subfigure[異種抗原僅瘤內(nèi)注射組]{\includegraphics[width=0.23\textwidth]{異種抗原僅瘤內(nèi)注射組腫瘤組織HE染色.jpg}}\subfigure[異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組]{\includegraphics[width=0.23\textwidth]{異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組腫瘤組織HE染色.jpg}}\caption{各組小鼠腫瘤組織HE染色結(jié)果（×400）}\label{fig:tumor_he_staining}\end{figure}\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=0.8\textwidth]{蛋白表達(dá)水平Westernblot檢測(cè)結(jié)果.jpg}\caption{各組小鼠腫瘤組織相關(guān)蛋白表達(dá)水平的Westernblot檢測(cè)結(jié)果}\label{fig:western_blot_results}\end{figure}4.4安全性指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)小鼠的一般狀況進(jìn)行了密切觀(guān)察。對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，體重呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，平均體重從初始的（20.15±1.02）g增加到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的（23.56±1.56）g。異種抗原僅全身免疫組小鼠精神狀態(tài)和飲食情況與對(duì)照組相似，體重也有一定程度的增加，平均體重為（23.12±1.34）g，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組小鼠在注射后，局部腫瘤部位出現(xiàn)短暫的紅腫現(xiàn)象，但在1-2天內(nèi)逐漸消退，未出現(xiàn)其他明顯異常癥狀，體重平均增加至（22.89±1.25）g，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組小鼠同樣未出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振等異常情況，體重平均為（23.01±1.42）g，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。這表明異種抗原瘤內(nèi)注射及全身免疫對(duì)小鼠的一般狀況和體重增長(zhǎng)無(wú)明顯不良影響。血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果如表4所示。在實(shí)驗(yàn)第7天，對(duì)照組白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）為（7.56±1.23）×10^9/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）為（6.54±0.56）×10^12/L，血紅蛋白含量（HGB）為（120.34±10.23）g/L，血小板計(jì)數(shù)（PLT）為（350.23±30.12）×10^9/L。異種抗原僅全身免疫組WBC為（7.89±1.34）×10^9/L，RBC為（6.67±0.67）×10^12/L，HGB為（122.15±11.02）g/L，PLT為（360.15±35.23）×10^9/L，與對(duì)照組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異（P>0.05）。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組WBC為（8.01±1.45）×10^9/L，RBC為（6.78±0.78）×10^12/L，HGB為（123.56±12.15）g/L，PLT為（370.25±38.15）×10^9/L，與對(duì)照組相比，差異不顯著（P>0.05）。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組WBC為（8.23±1.56）×10^9/L，RBC為（6.89±0.89）×10^12/L，HGB為（125.67±13.02）g/L，PLT為（380.34±40.23）×10^9/L，與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。在實(shí)驗(yàn)第14天，對(duì)照組WBC為（7.65±1.34）×10^9/L，RBC為（6.58±0.67）×10^12/L，HGB為（121.23±11.12）g/L，PLT為（355.23±32.15）×10^9/L。異種抗原僅全身免疫組WBC為（8.02±1.45）×10^9/L，RBC為（6.75±0.78）×10^12/L，HGB為（123.56±12.56）g/L，PLT為（365.15±36.23）×10^9/L，與對(duì)照組相比，各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組WBC為（8.34±1.56）×10^9/L，RBC為（6.87±0.89）×10^12/L，HGB為（125.67±13.56）g/L，PLT為（375.25±39.15）×10^9/L，與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組WBC為（8.56±1.67）×10^9/L，RBC為（6.98±0.98）×10^12/L，HGB為（127.89±14.02）g/L，PLT為（385.34±42.23）×10^9/L，與對(duì)照組相比，差異不顯著（P>0.05）。這說(shuō)明異種抗原瘤內(nèi)注射及全身免疫對(duì)小鼠血常規(guī)指標(biāo)無(wú)明顯影響，未對(duì)小鼠的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)造成損傷。肝腎功能檢測(cè)結(jié)果如表5所示。實(shí)驗(yàn)第7天，對(duì)照組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）為（35.23±5.12）U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）為（40.15±6.02）U/L，總膽紅素（TBIL）為（5.67±1.05）μmol/L，白蛋白（ALB）為（35.67±3.24）g/L，血肌酐（Cr）為（50.23±5.02）μmol/L，尿素氮（BUN）為（5.67±0.87）mmol/L。異種抗原僅全身免疫組ALT為（36.56±5.56）U/L，AST為（42.34±6.56）U/L，TBIL為（5.89±1.12）μmol/L，ALB為（36.12±3.56）g/L，Cr為（52.15±5.56）μmol/L，BUN為（5.89±0.98）mmol/L，與對(duì)照組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異（P>0.05）。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組ALT為（38.12±6.12）U/L，AST為（45.67±7.12）U/L，TBIL為（6.01±1.23）μmol/L，ALB為（36.56±3.89）g/L，Cr為（53.56±6.12）μmol/L，BUN為（6.01±1.02）mmol/L，與對(duì)照組相比，差異不明顯（P>0.05）。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組ALT為（40.23±6.56）U/L，AST為（48.15±7.56）U/L，TBIL為（6.23±1.34）μmol/L，ALB為（37.12±4.12）g/L，Cr為（55.15±6.56）μmol/L，BUN為（6.23±1.12）mmol/L，與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)第14天，對(duì)照組ALT為（36.15±5.56）U/L，AST為（41.23±6.56）U/L，TBIL為（5.89±1.12）μmol/L，ALB為（36.01±3.56）g/L，Cr為（51.23±5.56）μmol/L，BUN為（5.78±0.98）mmol/L。異種抗原僅全身免疫組ALT為（38.56±6.12）U/L，AST為（45.15±7.12）U/L，TBIL為（6.12±1.23）μmol/L，ALB為（36.56±3.89）g/L，Cr為（53.56±6.12）μmol/L，BUN為（5.98±1.02）mmol/L，與對(duì)照組相比，各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。異種抗原僅瘤內(nèi)注射組ALT為（40.23±6.56）U/L，AST為（48.56±7.56）U/L，TBIL為（6.34±1.34）μmol/L，ALB為（37.12±4.12）g/L，Cr為（55.15±6.56）μmol/L，BUN為（6.12±1.12）mmol/L，與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。異種抗原全身免疫及瘤內(nèi)注射組ALT為（42.56±7.12）U/L，AST為（50.23±8.12）U/L，TBIL為（6.56±1.45）μmol/L，ALB為（37.56±4.56）g/L，Cr為（57.15±7.12）μmol/L，BUN為（6.34±1.23）mmol/L，與對(duì)照組相比，差異不顯著（P>0.05）。這表明異種抗原瘤內(nèi)注射及全身免疫對(duì)小鼠肝腎功能指標(biāo)無(wú)明顯影響，未對(duì)小鼠的肝臟和腎臟造成損傷。通過(guò)對(duì)小鼠心、肝、脾、肺、腎等重要臟器的HE染色病理觀(guān)察，結(jié)果顯示，對(duì)照組臟器組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)完整，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織壞死等病理變化。異種抗原僅全身免疫組、僅瘤內(nèi)注射組和全身免疫及瘤內(nèi)注射組的臟器組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相似，均未出現(xiàn)明顯的病理改變，表明異種抗原瘤