3.1.2

微生物的培養(yǎng)技術及應用二

微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)篩選菌株的思路：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、

pH等

)

,

同

時抑制或阻止其他微生物的生長。選擇培養(yǎng)基：

是指允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。KH?PO?

1.4gNa?HPO?

2.1gMgSO?·7H?O

0.2g葡萄糖

10.0g尿素

1.0g瓊脂15.0g將上述物質溶解后，用蒸餾水

定容到1000mL。纖維素粉

5gNaNO?

1gNa?HPO?·7H?O

1.2g

KH?PO?

0.9gMgSO?·7H?O

0.5gKCl

0.5g酵母膏

0.5g

水解酪素

0.5g將上述物質溶解后，用蒸餾水定容到1000

mL。圖2-6

美國黃石國家公園的一個熱泉選擇培養(yǎng)基：是指允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。例如，在培養(yǎng)基中加入

抗生素

可用于選擇培養(yǎng)真菌；在培養(yǎng)基中加入高濃度的鹽水，可用于選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌；不加氮源的無氮培養(yǎng)基可用于選

擇培養(yǎng)

固氮

生物；不加碳源的培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)

自養(yǎng)

生物；以尿素為唯

—氮源的培養(yǎng)基可用于選擇培養(yǎng)

尿素分解菌

;以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基可

用于選擇培養(yǎng)_

纖維素分解菌。選擇培養(yǎng)基常用方法：

稀釋涂布平板①當樣品的稀釋度

足夠高時，

培養(yǎng)基表面生長的

一個菌落

來源于稀釋培養(yǎng)液中的

一個活菌

;②通過統(tǒng)計平板上的

菌落數(shù)

來推測樣品中大約含有的活菌數(shù)。微生物的數(shù)量測定1mL

1mL1mL1mL102

103

10?10?

1061019mL

無菌水10g

土

樣

90mL無菌水384042微生物的數(shù)量測定樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)流程示意圖0.lmL思考1、

1g土的體積約為1_ml,10g土加入到90ml無菌水，相當于

稀釋了10倍

。思考2、假如104稀釋度下涂布的3個平板的菌落數(shù)分別為42、40和3

8

,

則

1ml

稀釋液中的菌株數(shù)為400,

104稀釋度的試管中的菌株數(shù)為

4*103,102稀釋度的試管中的菌株數(shù)為

4*10?,101稀釋度的錐形瓶中的菌株數(shù)為4*10?。101稀釋度的試管中的菌株來自于10g

土，所以

1g

土中的菌株數(shù)為4*106102

103

10?0.1mL105

1069mL

無菌水4×10710g

土樣10190mL無菌水4×1031mL4×10?1mL樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)流程示意圖3840424×10?

應4×10?0.1mL4×10?4×1034×1051mL

1mL

1mL1mL1mL4×10?102

103

10?

105

1064×1071019mL無菌水90mL無菌水384042(2)計算公式：1

g

土中的菌株數(shù)=(C÷V)×MC:

代表

某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V:

代表_

涂布平板時所用

的稀釋液體積M:

稀釋倍數(shù)

樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)流程示意圖10g

土樣0.1mL0.1mL1g土(或1ml原始菌液)中的菌株數(shù)=(C÷V)×MC:代表

某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V:代表

涂布平板時所用的稀釋液體積

M:

稀釋倍數(shù)

注意事項：①為了保證結果準確，每個稀釋度，

一般設置3

個平板，選擇菌落數(shù)在30-300

的平板進行

計數(shù)，并取平均值

。②統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目

低

。原因是當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察

到的只是

1

個菌落。因此，統(tǒng)計結果一般用菌落數(shù)而不是用_

活菌數(shù)

來表示。③設置對照：主要目的是排除實驗中非測試

因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。微生物的數(shù)量測定微生物的數(shù)量測定統(tǒng)計微生物數(shù)量還可以用顯微鏡直接計數(shù)法血細胞計數(shù)板(厚、深)細菌計數(shù)板(薄、淺)的面積為1mm2

加蓋玻片后的菌液的深度為

0.1mm

。因此，每個大方格的容積為

0.1mm3大方格又分為兩種規(guī)格。規(guī)

格I:1

個大方格=16個中方格×25個小方格；規(guī)格Ⅱ:1個大方格=25個中方格×16個小方格。1

毫

升

=

1cm3=1000mm3一個大方格的容積：0.1mm3=

10-4

毫升血細胞計數(shù)板由一塊厚玻璃片特制而成，其中央有計數(shù)室。計數(shù)室分為9個大方格，每個大方格1個大方格A

的面積1mm2共16個中方格，400個小方格希利格式(16×25型)1個大方格A

的面積1mm2共25個中方格，400個小方格湯麥式(25×16型)規(guī)

格I

規(guī)

格II0.25mm1mm規(guī)格I

規(guī)格II如果使用規(guī)格l的血細胞計數(shù)板，先統(tǒng)計位于角落的4個中方格中的總菌數(shù)，求得每個中方格的

平均菌數(shù)再乘以16,就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1mL

菌液中的總菌數(shù)。如果使用規(guī)格II的血細胞計數(shù)板，先統(tǒng)計位于

中間和四角

的5個中方格中的總菌數(shù)，求得每個中方格的

平均菌數(shù)

再乘以

25

,就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1mL菌液中的總

菌

數(shù)

。1個大方格A

的面積1mm2共16個中方格，400個小方格希利格式(16×25型)1個大方格A的面積1mm2共25個中方格，400個小方格湯麥式(25×16型)1mm1mm0.25mm25

10000

B換算為1ml

稀釋液中的菌數(shù)若使用規(guī)格II的血細胞計數(shù)板，5個中方格中總菌數(shù)為A,

菌液稀釋倍數(shù)為B,

則換算為1ml

稀釋前的培養(yǎng)液中的菌落數(shù)換算為1個大方格的菌數(shù)每個中方格的平均菌數(shù)1mL培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量

(A/5)稀釋涂布平板法培養(yǎng)基培養(yǎng)基上的_菌落數(shù)計數(shù)的都是活菌操作復雜，有一定誤差1ml

原液含菌株數(shù)=平均菌落數(shù)/涂布平板所用稀釋液體積

(ml)x

稀釋倍數(shù)顯微鏡直接計數(shù)法顯微鏡、

細菌計數(shù)板菌株本身計數(shù)方便、操作簡單死菌活菌都計算在內1ml原液含菌株數(shù)=每小格平均菌株數(shù)x400

X

10

X

(1000)

x

稀釋倍數(shù)主要用具計數(shù)依據(jù)優(yōu)點缺點計算公式換算為一個大方格(0.1mm3)稀釋液中的菌株數(shù)換算為1ml

稀釋液中的菌株數(shù)換算1mm3稀釋液中的菌株數(shù)換算為1ml

原液中的菌株數(shù)尿素[CO(NH?),]是現(xiàn)代農業(yè)生產中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細菌分解成NH?和CO?

,再轉化為

NO?

、NH?

等被植物吸收。而這些細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成

脲酶

土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)CO(NH?)2

+H?O

脲酶

2NH?+CO,樣品稀釋測定土壤中細菌的數(shù)量，一般需要1×10?、1×105和1×106倍稀釋進行

平板培養(yǎng)。第一次做實驗適當放寬，

以保證能選取菌落

數(shù)為30～300之間

的平板。土壤取樣細菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中

生長，絕大多數(shù)分布

在距地表3～8cm的

土壤層。因此，取樣時，一般要鏟去表層

土

。觀察相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物

會表現(xiàn)出穩(wěn)定的

菌落特征。觀察

你分離得到的菌

落，記錄菌落特

征

(如形狀、大

小和顏色等)。培養(yǎng)·30～37C培養(yǎng)1～2d,

每隔

24h菌落計數(shù)

一次，選擇菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果。接種·

涂布平板的方

法進行接種。·

設置對照。土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱。同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最多，種類最全；細菌適宜在pH接近_中性且潮濕

的土壤中生長，絕大多數(shù)分布在距離地面3-8cm

的土壤層。制備以尿素為_

唯一氮源

的選擇培養(yǎng)基，并倒平板。稀釋原因：樣品的稀釋程度直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。稀釋標準：選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，保證獲得的菌落數(shù)在30-300之間，便于

計

數(shù)

。②測定土壤中_

放線菌

的數(shù)量，

一般稀釋103、10?和10?倍。③測定土壤中真菌的數(shù)量，

一般稀釋

102、103和10?

倍。由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103-10?。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準備8土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋涂布平板稀釋倍數(shù)：(根據(jù)微生物種類不同而有區(qū)別)1

0?、

1

0

5

和

1

0

6①

測

定

土

壤中

細

菌的

數(shù)

量

，

一

般

選

用

倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)。由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103-10?。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。培養(yǎng)：不同種類微生物，需要不同的培養(yǎng)

時間

和培養(yǎng)_

溫

度觀察：每隔24h

統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，最后選取

菌落數(shù)目穩(wěn)定

時的記錄作為結果。這樣可以防止因

培養(yǎng)時間不足

而遺漏菌落數(shù)。當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，取同一稀釋度下的3個平板進行計數(shù)，求出_平均值

并根據(jù)所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。涂布平板培養(yǎng)觀察計數(shù)操作提示：1、無菌操作：①取土樣的用具在使用前都需要滅菌。②應在

酒精燈的火焰

旁稱取土壤，并在火焰附近將

稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。③在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在酒精燈火焰旁操

作

。2、做好標記：本實驗使用的平板和試管比較多。為避免混淆，最好使用前就做好

標

記

Q①培養(yǎng)皿的標記：注明

稀釋度

、

培養(yǎng)基種類以及平板上培養(yǎng)樣品的_培

養(yǎng)日期

等。②試管的標記：將已經(jīng)進行過稀釋操作的試管，按稀釋度遞增的順