引言南方紅豆杉又名美麗紅豆杉，屬紅豆杉科紅豆杉屬，常綠喬木，我國(guó)獨(dú)有樹(shù)種，零散分布于華南、華中、華東和西南地區(qū)，多數(shù)生長(zhǎng)在海拔1200米以下地方[1]，是第四紀(jì)冰川運(yùn)動(dòng)殘留下來(lái)的古老植物，被稱為“植物界活化石”[2]。在經(jīng)濟(jì)、園林和藥用方面均有較高的價(jià)值，其木材結(jié)實(shí)耐用，曬干后很少開(kāi)裂，可用作于建筑、家具、耕具、文具等方面[3]。在其樹(shù)皮提取的紫杉醇具有獨(dú)特的抗癌機(jī)理，使得南方紅豆杉具有更高的開(kāi)發(fā)價(jià)值[4]。因其種子的生物學(xué)特性：種子產(chǎn)量少、自然萌發(fā)率低及種群的遺傳特性，南方紅豆杉自然繁殖率很低[5]。隨著癌癥發(fā)病率增高，對(duì)紫杉醇的需求量日益劇增，我國(guó)野生紅豆杉資源遭受到了嚴(yán)重的破壞，部分區(qū)域野生紅豆杉已經(jīng)瀕臨滅絕，南方紅豆杉現(xiàn)已被列入“國(guó)家級(jí)瀕危保護(hù)植物”[6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者致力于南方紅豆杉的生態(tài)學(xué)、分子學(xué)等研究。目前有關(guān)南方紅豆杉的研究主要集中在南方紅豆杉的人工繁殖、紫杉醇的化學(xué)提取合成、微生物、基因工程和種子休眠機(jī)制等方面[7-10]。而轉(zhuǎn)錄組分析方面主要集中在已公布的南方紅豆杉根莖葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[11]，南方紅豆杉種子解除休眠和萌發(fā)過(guò)程中的基因差異相關(guān)報(bào)道甚少。因此利用植物生物信息學(xué)技術(shù)研究南方紅豆杉的種胚萌發(fā)時(shí)的基因差異具有極為重要的意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。文章利用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)南方紅豆杉種胚進(jìn)行測(cè)序，分析討論南方紅豆杉種胚解除休眠和萌發(fā)過(guò)程中基因表達(dá)差異。1.1離體胚培養(yǎng)研究綜述離體胚培養(yǎng)是一種廣泛應(yīng)用于植物育種的技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)可克服雜種胚敗育、遠(yuǎn)緣雜交不親和性的問(wèn)題[12]。尚富德[13]通過(guò)對(duì)野生棉和栽培棉種間雜交胚珠離體培養(yǎng)研究結(jié)果表明，雜交胚在發(fā)育后期因?yàn)榕吆团呷?、胚和母體組織發(fā)育的不協(xié)調(diào)會(huì)導(dǎo)致形成畸形胚或者死胚，在球形胚時(shí)期進(jìn)行離體培養(yǎng)，改變了這種不協(xié)調(diào)關(guān)系，因此會(huì)產(chǎn)生較多的雜種胚。張智英[14]對(duì)核桃進(jìn)行雜交胚的離體培養(yǎng)也得到相同結(jié)論。離體胚培養(yǎng)技術(shù)也能有效克服種子休眠問(wèn)題，達(dá)到快速育苗的目的。趙沛基[15]對(duì)云南紅豆杉進(jìn)行離體胚培養(yǎng)，不僅改善了云南紅豆杉種子需經(jīng)兩年休眠期才能萌發(fā)的問(wèn)題，還有效的縮短了成苗時(shí)間。1.2轉(zhuǎn)錄組研究綜述轉(zhuǎn)錄組分析是研究植物表型的最通常的方法，可以在較短的時(shí)間里了解細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用。董昂等[16]對(duì)山核桃種子生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程轉(zhuǎn)錄組的初步分析，在山核桃種子生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了21個(gè)涉及脂類合成的途徑，571個(gè)相關(guān)基因。林萍等[17]對(duì)普通油茶種子4個(gè)發(fā)育時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，確定21789條有編碼蛋白功能的unigene。李雨霖等[18]對(duì)亞麻芥不同發(fā)育時(shí)期的種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)亞麻薺種子發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)差異和功能注釋進(jìn)行分析。張琳[19]對(duì)擬南芥種子發(fā)育過(guò)程轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序數(shù)據(jù)的分析構(gòu)建擬南芥種子成熟關(guān)鍵基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。張彥[20]對(duì)江南卷柏抱子發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析并與擬南芥種子成熟發(fā)育中轉(zhuǎn)錄組特征進(jìn)行比較，篩選得到654個(gè)在種子成熟發(fā)育時(shí)期特異上調(diào)表達(dá)的基因，850個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因。陶濤[21]對(duì)萌發(fā)期澳洲棉與亞洲棉種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其差異表達(dá)分析。而對(duì)于南方紅豆杉，相應(yīng)的研究較少，Hao等[22]首次采用IlluminaHiseq2000(Illumina,SanDiego,CA,USA)測(cè)序和生物信息學(xué)方法，對(duì)紅豆杉已知和新的小RNA進(jìn)行了鑒定、鑒定和描述，確定了一些高度保守和已知的非保守微RNA的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。李炎林[11,23]以現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝和分析，并以此為基礎(chǔ)對(duì)紅豆杉的進(jìn)行大規(guī)模的SSR分子標(biāo)記挖掘，成功構(gòu)建紅豆杉屬植物的Unigenes數(shù)據(jù)庫(kù)。1.3南方紅豆杉研究進(jìn)展自然條件下，南方紅豆杉種子需要經(jīng)過(guò)兩冬一夏才能萌發(fā)[7]。近年來(lái)，諸多學(xué)者致力于研究南方紅豆杉種子萌發(fā)時(shí)的一些生理變化以尋求提高種子萌發(fā)率的方法。史忠禮等[24]通過(guò)對(duì)南方紅豆杉種子體眠的研究，得出結(jié)論：南方紅豆杉種皮堅(jiān)硬透性差，以及胚需要生理后熟，屬于綜合型體眠。而譚一凡[25]通過(guò)對(duì)南方紅豆衫種子后熟生理的研究表明，在南方紅豆杉種子形態(tài)成熟時(shí)，最初不能萌發(fā)的根本原因是種胚發(fā)育不完全。而種皮的透性不良與種內(nèi)抑制物的存在，是種胚后熟過(guò)程緩慢的主要因素，而經(jīng)過(guò)層積處理后，可以提高種子的發(fā)芽率和成苗率。朱念德[26]通過(guò)對(duì)南方紅豆杉種胚的發(fā)育狀況、外種皮結(jié)構(gòu)以及種子各部分抑制物質(zhì)相對(duì)活性的研究認(rèn)為，種子形態(tài)成熟時(shí)，種胚基本成熟，離體培養(yǎng)可以生長(zhǎng)成苗。胚乳存在的抑制物質(zhì)和外種皮的不透氣性可能是影響南方紅豆杉種子萌發(fā)的因素，但ABA不是萌發(fā)的抑制因素。黃儒珠等[27]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，脫除外被蠟質(zhì)層的南方紅豆杉種子，經(jīng)低-暖-低變溫層積結(jié)合植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及微量元素處理，120d休眠解除。而且變溫層積處理后，種子胚的發(fā)育漸進(jìn)完善，種子內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸和可溶性糖含量均明顯提高，因此認(rèn)為脂肪等貯藏物質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化和利用可能是南方紅豆杉種子體萌解除的關(guān)鍵。這與吉前華等[28]所做結(jié)論類似。張艷杰等[4]對(duì)南方紅豆杉種子各部分甲醇浸提液進(jìn)行了生物測(cè)定，并通過(guò)GC-MS聯(lián)用儀鑒定。得出結(jié)論：南方紅豆杉種子中種皮、內(nèi)種皮和胚乳的浸提液對(duì)白菜種子發(fā)芽率和幼苗的高生長(zhǎng)、根生長(zhǎng)均有抑制作用，且抑制作用隨浸提液濃度的增大而增強(qiáng)。同時(shí)，從南方紅豆杉種子的胚乳和中種皮、內(nèi)種皮中鑒定出多種有機(jī)化合物，并確定了它們的種類和相對(duì)含量，其中包括已報(bào)道的正庚酸、壬酸、乙酸等發(fā)芽抑制物質(zhì)。表明南方紅豆杉種子的中種皮、內(nèi)種皮和胚乳中均含有抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的物質(zhì)。年慧慧[29]將所提取種子浸提液作用于油菜種子，得到同樣的趨勢(shì)規(guī)律。李曉琳等[10]根據(jù)前人所做研究得出南方紅豆杉種子生理休眠的主要原因是萌發(fā)抑制物的存在，而種子成熟時(shí)種胚是否發(fā)育完全以及種皮透性對(duì)種子的萌發(fā)是否有影響仍存在很大爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步研究。1.3.1南方紅豆杉種胚離體培養(yǎng)研究現(xiàn)狀為了滿足紫杉醇大量需求，對(duì)紅豆杉屬植物的大規(guī)模快速繁殖進(jìn)行了大量的探索，包括扦插、胚培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等。而越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明，離體胚培養(yǎng)有潛力成為快速、大量繁殖南方紅豆杉的最有效的方法之一。梅興國(guó)[30]對(duì)紅豆杉離體胚培養(yǎng)快速育苗的實(shí)驗(yàn)研究表明，離體胚培養(yǎng)技術(shù)打破南方紅豆杉種子休眠機(jī)制，使休眠期較長(zhǎng)的紅豆杉種子在短期內(nèi)迅速成苗，且萌發(fā)率較高。目前，學(xué)者通過(guò)研究培養(yǎng)基和條件來(lái)進(jìn)一步提高種子萌發(fā)率。曾余力[31]的實(shí)驗(yàn)表明南方紅豆杉最優(yōu)滅菌處理為2.5%的NaClO真空滅菌l0min，其污染率僅為6%，而出苗率可高達(dá)86%?；九囵B(yǎng)基對(duì)南方紅豆杉離體胚生長(zhǎng)影響較大，WPM培養(yǎng)基是南方紅豆杉胚培養(yǎng)的最佳基本培養(yǎng)基。其中在南方紅豆杉離體種胚培養(yǎng)中，不加細(xì)胞分裂素時(shí)試管苗生長(zhǎng)最好，添加細(xì)胞分裂素可分化產(chǎn)生不定芽，在同樣培養(yǎng)基中，南方紅豆杉萌動(dòng)種胚較未萌動(dòng)的種胚更易誘導(dǎo)不定芽的分化。臧新等[32]將南方紅豆杉種子低溫處理一個(gè)月，再用流水沖洗之后，利用B5培養(yǎng)基對(duì)南方紅豆杉離體胚進(jìn)行25℃散光培養(yǎng)，南方紅豆杉種胚的萌發(fā)率和成苗率分別可達(dá)66.7%和50%。Tafreshi等[33]對(duì)紅豆杉也進(jìn)行了胚培養(yǎng)試驗(yàn)，采用1/2培養(yǎng)基+0.8g/LPVP或5g/L活性炭+3%蔗糖+5.8g/L瓊脂，pH為5.7±0.05，在種子用流水沖洗7d后進(jìn)行胚培養(yǎng)，14d后可獲得100%萌發(fā)率；而沒(méi)有經(jīng)過(guò)流水沖洗的種子，胚培養(yǎng)的萌發(fā)率為85%；將萌發(fā)后的幼苗移至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)，可獲得90%的成苗率。1.3.2南方紅豆杉分子研究進(jìn)展紅豆杉的研究主要集中于快速繁殖、紫杉醇提取等方面，其分子學(xué)的研究卻相對(duì)滯后[34]。分子標(biāo)記方面，武星彤[35]利用RFLP-PCR技術(shù)，從植物葉綠體通用引物數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到了48個(gè)適合南方紅豆杉的標(biāo)記位點(diǎn)，有兩個(gè)具有特殊用途的位點(diǎn)，線粒體SSR位點(diǎn)(Taxus-mtB01)可用于檢測(cè)不同地域(群體)南方紅豆杉種子的來(lái)源和擴(kuò)散路徑；核基因組插入一缺失位點(diǎn)(Taxus-indel)可作為DNA條形碼，對(duì)大部分紅豆杉屬的物種進(jìn)行有效鑒別。鄭超[36]采用RAPD標(biāo)記研究了4種紅豆杉屬植物的68個(gè)單株的遺傳多樣性,并采用UPGMA方法分析68個(gè)單株的遺傳關(guān)系，結(jié)果表明南方紅豆杉和須彌紅豆杉遺傳距離最近。Hao[37]使用數(shù)字基因表達(dá)系統(tǒng)研究了三種紅豆杉組織的轉(zhuǎn)錄組差異并鑒定了大量與組織特異性功能和紫杉烷生物合成途徑相關(guān)的基因。其中紫杉烷生物合成基因在根中的表達(dá)明顯高于在葉和莖中的表達(dá)，而代謝組學(xué)分析同樣也揭示了紫杉烷生產(chǎn)途徑在根中具有高活性。Lun等[38]從南方紅豆杉中新提取了一種命名為taxiwallinine的紫杉烷二萜類化合物并篩選用于對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的細(xì)胞毒性作用，他們認(rèn)為這種新的紫杉烷二萜類化合物可能是一個(gè)潛在的抗腫瘤產(chǎn)品。1.3研究目的及意義本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)南方紅豆杉離體胚培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，找到南方紅豆杉種胚解除休眠和萌發(fā)過(guò)程中基因表達(dá)差異，此研究結(jié)果拓寬了南方紅豆杉的分子遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，為更深層次地研究南方紅豆杉種子萌發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。2材料與方法2.1離體胚的獲取將南方紅豆杉種子置于蒸餾水中浸泡，使種仁吸脹，種子浸泡48h后去除種殼。種仁以75%酒精消毒2min，2.5%NaClO溶液消毒10min之后用無(wú)菌水沖洗4次，在無(wú)菌濾紙上剝離種胚接種于B5培養(yǎng)基（蔗糖20g/L，瓊脂8g/L，活性炭3g/L，PH=5.8）上，以上操作于超凈工作臺(tái)進(jìn)行。將種胚置于25℃恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)7d（B）、14d（C）、21d（D），沒(méi)有進(jìn)行培養(yǎng)的胚作為對(duì)照，0d（A）。測(cè)量不同時(shí)期的離體胚的長(zhǎng)度與重量，并對(duì)胚超顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。2.2RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)每個(gè)時(shí)期樣品做3個(gè)重復(fù)，從組織樣品中提取總RNA，四個(gè)時(shí)期共12個(gè)RNA樣品。對(duì)提取的RNA樣品用Nanodrop2000進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，RNA完整性用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RIN值利用Agilent2100進(jìn)行測(cè)定。2.3測(cè)序數(shù)據(jù)分析（1）原始數(shù)據(jù)的處理先將Illumina測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)通過(guò)BaseCalling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，得到最原始的測(cè)序數(shù)據(jù)。將原始數(shù)據(jù)中的測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量讀段、N率較高序列及長(zhǎng)度過(guò)短序列進(jìn)行過(guò)濾，得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(cleandata)以保證后續(xù)分析的順利進(jìn)行。（2）序列的組裝獲得RNA-seq高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)后用Trinity軟件對(duì)所有cleandata進(jìn)行從頭組裝，需要將所有測(cè)序讀段通過(guò)從頭組裝生成重疊群(contig)和單一序列(singleton)。（3）Unigene的功能注釋、Go分類和Pathway富集性分析將拼接所得所有核苷酸序列，使用BlastX分別與NR、String、Swissprot、KEGG、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得相應(yīng)的注釋信息。3結(jié)果與分析3.1RNA質(zhì)量檢測(cè)每個(gè)時(shí)期3個(gè)樣品共12個(gè)樣品，對(duì)12個(gè)樣品提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。12個(gè)樣品RNA條帶清晰，無(wú)色素、蛋白、糖類等雜質(zhì)污染，28/23S亮度大于18/16S。樣品RNA的OD260/280均大于1.8，OD260/230均大于1.5，RIN值均大于8.0，RNA濃度及總量滿足兩次建庫(kù)需求，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果4個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)12個(gè)樣品測(cè)序共得到原始讀長(zhǎng)667915734個(gè)，清潔讀長(zhǎng)（Cleanreads）653544514個(gè)，后者占97.85%。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率低，質(zhì)量可信，可用于后續(xù)分析。組裝后共獲得轉(zhuǎn)錄本213274條，Unigene為每個(gè)基因中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本；從所有轉(zhuǎn)錄本中共獲得78154個(gè)不同長(zhǎng)度的Unigene，占總轉(zhuǎn)錄本數(shù)的36.64%，N50為1894bp（表1）。表1組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table1Statisticaltableofassemblyresults3.3基因功能注釋結(jié)果將所得的Unigenes對(duì)比到5大功能數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別注釋到各數(shù)據(jù)庫(kù)的個(gè)數(shù)及占總Unigenes比例為：NR:29650（37.94%）、Swissprot:20853（26.68%）、String：8495（10.87%）、KEGG:9794（12.53%）、Pfam:17550（22.46%）最終有3327個(gè)Unigenes同時(shí)標(biāo)注到5大數(shù)據(jù)庫(kù)中，占Unigenes總數(shù)的4.26%（圖1）。圖1Unigene注釋信息Venn圖Fig.1VennAnnotationinformationofunigenes3.3.1GO功能注釋結(jié)果利用GO(GeneOntology)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因按照其參與的生物過(guò)程BP(BiologicalProcess)、分子功能MF(MolecularFunction)及細(xì)胞組分CC(CellularComponent)三個(gè)方面進(jìn)行分類注釋。14201個(gè)unigenes注釋到56個(gè)GO通路中，其中Unigenes注釋數(shù)目最多的是生物過(guò)程（圖2）。由圖可見(jiàn)，注釋到生物過(guò)程的基因中，最多的是代謝過(guò)程(metabolicprocess)8539條、細(xì)胞途徑(cellularprocess)7244條、單一的生物過(guò)程(single-organismprocess)5588條、對(duì)刺激的反應(yīng)(responsetostimulus)1830條、生物過(guò)程調(diào)節(jié)(biologicalregulation)1583條，代謝過(guò)程中關(guān)于有機(jī)物代謝過(guò)程、初級(jí)代謝過(guò)程與細(xì)胞代謝過(guò)程的基因最多；注釋到細(xì)胞組分的基因中，最多的是細(xì)胞(cell)4881條、細(xì)胞原件(cellpart)4881條和細(xì)胞器(organelle)3638條；注釋分子功能的基因中，最多的是催化活性(catalyticactivity)7508條、結(jié)合(binding)7252條和轉(zhuǎn)運(yùn)子活性(transporteractivity)2954條。圖2GO功能注釋結(jié)果Fig.2GOFunctionalAnnotationResult3.3.2KEGGPathway功能注釋結(jié)果將基因根據(jù)參與的KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)代謝通路分為5個(gè)分支：代謝(A，Metabolism)，遺傳信息處理(B，GeneticInformationProcessing)，環(huán)境信息處理(C，EnvironmentalInformationProcessing)，細(xì)胞過(guò)程(D，CellularProcesses)，有機(jī)系統(tǒng)(E，OrganismalSystems)。從圖3中可以看出Unigenes分到最多的是代謝，占總基因數(shù)的66.92%；其次是與遺傳信息處理有關(guān)的通路，占基因總數(shù)的20.25%，在南方紅豆杉種胚萌發(fā)過(guò)程中基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和能量消耗及其重要。圖3KEGGPathway功能注釋結(jié)果Fig.3KEGGPathwayFunctionalAnnotationResults3.4差異表達(dá)基因分析3.4.1差異表達(dá)基因數(shù)量變化南方紅豆杉種胚在萌發(fā)各階段基因調(diào)控有很大的差別，對(duì)不同階段的基因表達(dá)情況進(jìn)行比較，上調(diào)和下調(diào)的Unigenes數(shù)目變化較大，萌發(fā)期間，B期與A期比較(AvsB)上調(diào)基因9358個(gè)，下調(diào)基因11411，C期與B期比較(BvsC)上調(diào)基因4282圖4差異表達(dá)基因比較圖Fig.4Mapofdifferentiallyexpressedunigenes個(gè)，下調(diào)基因1774個(gè)，D期與C期比較(CvsD)上調(diào)基因1333個(gè)，下調(diào)基因287（圖4），種胚萌發(fā)前期基因表達(dá)變化較大，而反觀萌發(fā)后期，A期與C期(AvsC)、A期與D期比較(AvsD)基因表達(dá)變化都較小。3.4.2差異表達(dá)基因GO分析將差異基因進(jìn)行GO功能注釋分析，差異基因集中最多的前18個(gè)通路，屬于生物過(guò)程的最多，分子功能的最少。其中生物過(guò)程集中的較多的依次是代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、單一有機(jī)體過(guò)程、對(duì)刺激的反應(yīng)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、生物調(diào)劑、定位、生物調(diào)節(jié)、定位的建立以及生物過(guò)程調(diào)控；細(xì)胞組分中基因差異較大的是細(xì)胞與細(xì)胞器；分子功能中催化活性差異和結(jié)合通路基因差異較大（圖5）。在南方紅豆杉種子萌發(fā)過(guò)程中，基因表達(dá)差異較大的18個(gè)通路中的上調(diào)基因高于下調(diào)基因，比較不同時(shí)期的差異基因可知，南方紅豆杉種胚萌發(fā)時(shí)前期的差異基因多于后期的差異基因，萌發(fā)前期代謝過(guò)程活躍。圖5差異表達(dá)基因GO分類統(tǒng)計(jì)Fig.5GOclassificationstatisticsofDEGs4結(jié)論利用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)培養(yǎng)0d、7d、14d、21d的南方紅豆杉種胚進(jìn)行測(cè)序，分析討論南方紅豆杉種胚解除休眠和萌發(fā)過(guò)程中基因表達(dá)差異。通過(guò)測(cè)序，共得到78154個(gè)Unigenes，N50為1894bp。NR注釋結(jié)果顯示，與南方紅豆杉基因最相似的是北美云杉(Piceasitchensis)。GO、COG、KEGGPathway功能注釋結(jié)果顯示，注釋到最多Unigenes的是代謝過(guò)程。5討論種子在萌發(fā)過(guò)程中不同階段基因表達(dá)存在較大差異，這些基因主要與DNA合成、激素代謝等過(guò)程相關(guān)，種胚在種子萌發(fā)過(guò)程中主要是發(fā)生細(xì)胞分裂過(guò)程，而且萌發(fā)前期比后期活躍。種子休眠解除后萌發(fā)前，必須完成一系列生理過(guò)程，包括種子內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（包括淀粉、蛋白和脂類等）的供給，它們?cè)诿傅淖饔孟驴杀环N胚利用[39]。在種子萌發(fā)前期，與細(xì)胞壁代謝有關(guān)的基因表達(dá)較高，在種子萌發(fā)中期，參與氨基酸合成、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和酸合成的基因顯著增加，并在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)出與光合代謝相關(guān)的基因，萌發(fā)后期光合作用光合作用相關(guān)基因的表達(dá)變化顯著，總之，種子萌發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝調(diào)控涉及到不同代謝組織水平上的多種反應(yīng)和復(fù)雜的調(diào)控[40]。隨著對(duì)南方紅豆杉的深入研究，目前關(guān)于種子休眠機(jī)制的研究己進(jìn)入分子水平階段，種子休眠狀態(tài)的解除與種子基因差異表達(dá)變化緊密關(guān)聯(lián)。此次試驗(yàn)初步分析了種胚萌發(fā)過(guò)程中的基因表達(dá)差異，為后續(xù)更深層次研究南方紅豆杉種子解除休眠和萌發(fā)的分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)賀善安.中國(guó)珍稀植物[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2001.梁瑞龍,熊曉慶.從遠(yuǎn)古走來(lái)的紅豆杉[J].廣西林業(yè),2019(01):38-39.中國(guó)科學(xué)院植物研究所編輯委員會(huì).中國(guó)植物志第七卷[M].北京:科學(xué)出版社，1978.張艷杰,高捍東,魯順保.南方紅豆杉種子中發(fā)芽抑制物的研究[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,(04):51-56.茹文明.瀕危植物南方紅豆杉生態(tài)學(xué)研究[D].山西大學(xué),2006.陳易展,劉蔚漪,張玉薇,等.南方紅豆杉瀕?，F(xiàn)狀分析與保護(hù)對(duì)策[J].林業(yè)勘察設(shè)計(jì),2018,38(03):66-69.王愛(ài)明.南方紅豆杉育苗及大苗繁育管理技術(shù)[J].中國(guó)園藝文摘,2018,34(04):175-176.陳雪英,梁敬鈺.人工栽培的南方紅豆杉化學(xué)成分(Ⅰ)[J].中國(guó)天然藥物,2006(01):52-57.王啟業(yè),王義強(qiáng),凡利.南方紅豆杉生物技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(04):8-12.李曉琳,展曉日.紅豆杉種子休眠機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2018,32(04):78-81.李炎林,楊星星,張家銀,等.南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組SSR挖掘及分子標(biāo)記的研究[J].園藝學(xué)報(bào),2014,41(04):735-745.范玉清,任國(guó)華.國(guó)內(nèi)植物組織培養(yǎng)進(jìn)展概況[J].晉東南師范專科學(xué)校學(xué)報(bào),2002(02):23-24+91.尚富德,胡紹安,李揚(yáng)漢,等.野生棉與栽培棉種間雜交胚珠離體培養(yǎng)的胚胎發(fā)育研究[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào),1991(03):269-275.張智英,張旺林.核桃雜交胚的離體培養(yǎng)研究[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,2015(08):153-154.趙沛基,沈月毛,彭麗萍,等.云南紅豆杉離體胚的培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,2003(04):327-329.董昂,趙國(guó)淼,胡歡歡,等.山核桃(Caryacathayensis)種子生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程轉(zhuǎn)錄組的初步分析[J].分子植物育種,2018,16(12):3844-3854.林萍,曹永慶,姚小華,等.普通油茶種子4個(gè)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析[J].分子植物育種,2011,9(04):498-505.李雨霖.亞麻芥不同發(fā)育時(shí)期種子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.張琳.擬南芥種子發(fā)育過(guò)程轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序數(shù)據(jù)的分析[D].福建農(nóng)林大學(xué),2011.張彥.江南卷柏孢子發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析及其與擬南芥種子成熟發(fā)育轉(zhuǎn)錄組特征的比較[D].復(fù)旦大學(xué),2012.陶濤.澳洲棉與亞洲棉種子萌發(fā)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其差異表達(dá)分析[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.Da‐ChengHao,LingYang,Pei‐GenXiao,etal.IdentificationofTaxusmicroRNAsandtheirtargetswithhigh‐throughputsequencinganddegradomeanalysis[J].PhysiologiaPlantarum,2012,146(4).李炎林.紅豆杉紫杉烷代謝突變體篩選和連鎖圖譜構(gòu)建[D].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.史忠禮,周菊華,王子卿.南方紅豆杉種子休眠的研究[J].浙江林業(yè)科技,1991(05):1-6.譚一凡.南方紅豆杉種子后熟生理的研究[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào),1991(02):200-206+213.朱念德,劉蔚秋,伍建軍,等.影響南方紅豆杉種子萌發(fā)因素的研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1999(02):76-80.黃儒珠,郭祥泉,方興添,等.變溫層積處理對(duì)南方紅豆杉種子生理生化特性的影響[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006(02):95-98.吉前華,郭雁君,李少瓊,等.不同處理對(duì)南方紅豆杉種子萌發(fā)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(31):9858-9860.年慧慧,張春椿,李效賢,等.不同處理方法南方紅豆杉種子浸提液內(nèi)源抑制物活性研究初探[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,36(09):1021-1024+1028.梅興國(guó),溫川蓉,劉凌,等.紅豆杉離體胚培養(yǎng)快速育苗研究[J].華中理工大學(xué)學(xué)報(bào),1998(05):6-8.曾余力.南方紅豆杉試管繁殖體系建立及老樹(shù)復(fù)幼研究[D].浙江農(nóng)林大學(xué),2010.臧新,呂曉輝,楊冬之,等.2種紅豆杉的離體胚培養(yǎng)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2006(02):107-109+112.TafreshiSAH,ShariatiM,MofidMR,etal.RapidgerminationanddevelopmentofTaxusbaccataL.byinvitroembryocultureandhydroponicsgrowthofseedlings.InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant,2011,47(5):561-568王啟業(yè),王義強(qiáng),凡利.南方紅豆杉生物技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(04):8-12.武星彤,文亞峰.南方紅豆杉分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2017,35(02):228-232.鄭超,別慶鈴,夏冰,等.4種紅豆杉屬植物遺傳多樣性和遺傳關(guān)系的RAPD分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2013,22(03):58-62.HaoDaCheng,GeGuang