蛋白純化層析柱流速調(diào)試技師（中級）考試試卷及答案一、填空題（共10題，每題1分，共10分）1.蛋白純化層析柱常用填料類型有瓊脂糖凝膠、______和親和層析填料。2.層析柱流速調(diào)試的核心參數(shù)除流速、柱壓外，還包括______。3.緩沖液pH值應(yīng)接近目標(biāo)蛋白的______，以保證蛋白穩(wěn)定性。4.蛋白上樣量一般不超過層析柱的______容量。5.梯度洗脫時，鹽濃度變化速率過大會導(dǎo)致______。6.層析柱使用后需用______緩沖液平衡至初始狀態(tài)，避免填料變質(zhì)。7.離子交換層析中，陽離子交換填料在pH低于目標(biāo)蛋白pI時，蛋白帶______電。8..疏水相互作用層析常用的洗脫方式是______鹽濃度梯度。9.層析柱流速單位通常用______表示（體積/時間）。10.蛋白純化過程中，為防止蛋白降解，緩沖液中常添加______。二、單項(xiàng)選擇題（共10題，每題2分，共20分）1.下列哪種情況會導(dǎo)致層析柱流速過慢？A.柱壓過高B.填料顆粒過細(xì)C.緩沖液黏度低D.柱床高度過低2.親和層析中，目標(biāo)蛋白的洗脫常用哪種方法？A.升高鹽濃度B.降低pHC.增加有機(jī)試劑D.改變離子強(qiáng)度3.離子交換層析中，陰離子交換填料的配基通常是？A.-SO3-B.-COO-C.-NH3+D.-PO42-4.層析柱流速調(diào)試時，若柱壓超過允許值，應(yīng)立即？A.提高流速B.降低流速C.更換填料D.增加上樣量5.下列哪種填料適合用于蛋白的分子篩層析？A.DEAE-瓊脂糖B.Ni-NTAC.SephadexG-75D.CM-纖維素6.緩沖液中添加EDTA的主要作用是？A.抑制蛋白酶B.螯合金屬離子C.調(diào)節(jié)pHD.增加黏度7.疏水相互作用層析中，初始緩沖液的鹽濃度應(yīng)？A.高B.低C.與洗脫液相同D.無要求8.層析柱的柱效通常用什么參數(shù)表示？A.峰面積B.峰高C.理論塔板數(shù)D.保留體積9.蛋白純化后，若需長期保存層析柱，應(yīng)將填料浸泡在？A.純水B.含防腐劑的緩沖液C.高鹽緩沖液D.有機(jī)溶劑10.下列哪種情況會導(dǎo)致層析峰拖尾？A.上樣量不足B.填料裝填不均C.流速過快D.緩沖液pH穩(wěn)定三、多項(xiàng)選擇題（共10題，每題2分，共20分）1.層析柱流速調(diào)試的影響因素包括？A.填料顆粒大小B.柱床高度C.緩沖液黏度D.環(huán)境溫度2.蛋白純化常用的層析方法有？A.離子交換層析B.親和層析C.疏水相互作用層析D.凝膠過濾層析3.緩沖液配制的關(guān)鍵參數(shù)有？A.pH值B.離子強(qiáng)度C.濃度D.添加劑種類4.親和層析中，目標(biāo)蛋白與配基結(jié)合的作用力包括？A.氫鍵B.疏水作用C.靜電作用D.共價鍵5.層析柱使用前需進(jìn)行的操作有？A.填料平衡B.柱壓測試C.流速校準(zhǔn)D.上樣預(yù)實(shí)驗(yàn)6.蛋白酶抑制劑的常用種類有？A.PMSFB.EDTAC.亮抑酶肽D.甘油7.疏水相互作用層析的洗脫條件包括？A.降低鹽濃度B.增加有機(jī)試劑C.改變pHD.升高溫度8.凝膠過濾層析的應(yīng)用包括？A.蛋白分子量測定B.脫鹽C.蛋白復(fù)性D.分離不同大小蛋白9.層析柱流速異常的可能原因有？A.填料堵塞B.接頭泄漏C.泵壓力不足D.緩沖液過濾不徹底10.蛋白穩(wěn)定性的影響因素有？A.pH值B.溫度C.蛋白酶D.金屬離子四、判斷題（共10題，每題2分，共20分）1.層析柱流速越快，分離效果越好。（）2.離子交換層析中，目標(biāo)蛋白帶正電時可結(jié)合陽離子交換填料。（）3.親和層析的特異性依賴于配基與目標(biāo)蛋白的可逆結(jié)合。（）4.凝膠過濾層析中，分子量小的蛋白先流出。（）5.緩沖液中添加甘油可增加蛋白的穩(wěn)定性。（）6.柱壓過高時，可通過提高流速來降低柱壓。（）7.疏水相互作用層析中，鹽濃度越高，蛋白與填料結(jié)合越強(qiáng)。（）8.層析柱裝填時，填料需壓實(shí)以保證流速穩(wěn)定。（）9.蛋白純化后，層析柱可直接用純水沖洗保存。（）10.流速調(diào)試時，需確保柱壓在填料允許的最大壓力范圍內(nèi)。（）五、簡答題（共4題，每題5分，共20分）1.簡述蛋白純化層析柱流速調(diào)試的基本步驟。2.離子交換層析中，如何根據(jù)目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)選擇填料類型？3.簡述疏水相互作用層析的原理及洗脫策略。4.層析柱使用后如何進(jìn)行正確維護(hù)以延長使用壽命？六、討論題（共2題，每題5分，共10分）1.討論層析柱流速與分離效果的關(guān)系，如何平衡兩者？2.討論蛋白純化中緩沖液添加劑的作用及選擇原則。---參考答案一、填空題答案1.離子交換填料2.柱床高度3.等電點(diǎn)（pI）4.結(jié)合5.分離度下降6.起始7.正8.降低9.mL/min10.蛋白酶抑制劑二、單項(xiàng)選擇題答案1.B2.B3.B4.B5.C6.B7.A8.C9.B10.B三、多項(xiàng)選擇題答案1.ABCD2.ABCD3.ABCD4.ABC5.ABC6.AC7.ABCD8.ABCD9.ABCD10.ABCD四、判斷題答案1.×2.√3.√4.×5.√6.×7.√8.√9.×10.√五、簡答題答案1.①檢查系統(tǒng)：確認(rèn)泵、接頭無泄漏，管路通暢；②填料平衡：用起始緩沖液以0.5mL/min平衡至基線穩(wěn)定；③流速調(diào)試：從低到高調(diào)節(jié)（每次增0.2-0.5mL/min），監(jiān)控柱壓；④壓力限制：確保柱壓≤填料最大允許值（如瓊脂糖<0.3MPa）；⑤穩(wěn)定性驗(yàn)證；⑥記錄參數(shù)（流速、柱壓、緩沖液）。2.①pH<pI：蛋白帶正電，選陽離子交換填料（CM-纖維素等）；②pH>pI：蛋白帶負(fù)電，選陰離子交換填料（DEAE-瓊脂糖等）；③pH與pI差1-2單位，保證足夠電荷；④依蛋白pI差異選緩沖液pH，實(shí)現(xiàn)分離。3.原理：蛋白疏水區(qū)域與填料疏水配基通過疏水作用結(jié)合（鹽促結(jié)合）。洗脫策略：①降鹽濃度（線性/階梯）；②加低濃度有機(jī)試劑（乙醇等）；③調(diào)pH近pI；④升溫。常用降鹽+少量有機(jī)試劑組合。4.①清洗：2MNaCl沖洗去殘留蛋白；②平衡：含0.02%疊氮鈉的緩沖液平衡；③保存：密封柱，4℃避光；④防污染：用過濾緩沖液；⑤定期檢查柱壓/柱床；⑥避免高溫（<30℃）。六、討論題答案1.流速快→擴(kuò)散不充分→峰寬增、分離度降；流速慢→擴(kuò)散過度→峰寬增、耗時久。平衡：①不超填料最大流速；②梯度斜率與流速匹配；③預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化（差異大蛋白可快，差異小需慢）；④監(jiān)控柱效（下降超10%則降速）；⑤按需選擇（純度優(yōu)先→慢流速，通量優(yōu)先→快流