當歸芍藥散加味對乳腺增生大鼠乳腺上皮細胞凋亡的影響摘要通過動物實驗觀察當歸芍藥散加味對乳腺增生大鼠乳腺上皮細胞凋亡的影響，探討其治療乳腺增生病的機理。采用雌、孕激素聯(lián)合造模制成大鼠乳腺增生模型，隨機分為正常對照組、模型組、當歸芍藥散加味高、中、低劑量組。TUNEL法檢測計算各組動物乳腺上皮細胞凋亡指數(shù)。各治療組與模型組比較，乳腺上皮細胞凋亡指數(shù)均明顯增加（P<0.01），高劑量組優(yōu)于中、低劑量組（P<0.01，P<0.05）。當歸芍藥散加味可能通過調(diào)理肝脾、化瘀散結(jié)，促進乳腺上皮細胞凋亡達到治療作用。關(guān)鍵詞當歸芍藥散加味；乳腺增生；細胞凋亡一、引言乳腺增生?。╩ammaryglandhyperplasia,MGH）是中青年婦女的常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率占乳腺疾病的首位，且近年來有逐漸上升及年輕化的趨勢。乳腺增生主要表現(xiàn)為乳腺組織導管和乳小葉在結(jié)構(gòu)上的退行性病變及進行性結(jié)締組織的生長，臨床以乳房疼痛和腫塊為主要特征。目前，西醫(yī)對乳腺增生的治療主要采用內(nèi)分泌調(diào)節(jié)藥物，如他莫昔芬等，但長期使用存在諸多副作用，如月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)，甚至增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風險等。因此，尋找安全有效的治療方法成為研究熱點。中醫(yī)認為，乳腺增生病多與情志不暢、肝郁氣滯、脾失健運等因素有關(guān)，治療上注重整體調(diào)理。當歸芍藥散出自《金匱要略》，由當歸、芍藥、川芎、茯苓、白術(shù)、澤瀉組成，具有養(yǎng)血疏肝、健脾利濕的功效。前期研究表明，從肝脾論治乳腺增生病在改善臨床癥狀、縮小腫塊方面有一定療效，且可通過影響乳腺組織上皮細胞增殖和凋亡過程發(fā)揮干預治療作用。本研究在此基礎(chǔ)上，觀察當歸芍藥散加味對乳腺增生大鼠乳腺上皮細胞凋亡的影響，旨在進一步探討其治療乳腺增生病的作用機制，為中醫(yī)藥治療乳腺增生病提供科學依據(jù)。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗動物SPF級SD雌性未孕大鼠60只，體重180-220g，購自[動物供應(yīng)商名稱]。動物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進行實驗。2.1.2實驗藥物當歸芍藥散加味方由當歸15g、芍藥15g、川芎8g、茯苓10g、白術(shù)15g、澤瀉10g、浙貝母12g、柴胡8g、香附12g、丹參15g組成，藥材均購自[藥材供應(yīng)商名稱]，經(jīng)[鑒定人及鑒定機構(gòu)]鑒定為正品。藥物常規(guī)煎煮后減壓濃縮至所需濃度（高劑量組含生藥2g/mL、中劑量組含生藥1g/mL、低劑量組含生藥0.5g/mL），4℃冰箱保存?zhèn)溆?。苯甲酸雌二醇注射液（?guī)格：1mL:2mg，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱1]）；黃體酮注射液（規(guī)格：1mL:20mg，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱2]）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（購自[試劑盒供應(yīng)商名稱1]）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（購自[試劑盒供應(yīng)商名稱2]）。2.1.3實驗儀器光學顯微鏡（[顯微鏡品牌及型號]）；離心機（[離心機品牌及型號]）；石蠟切片機（[切片機品牌及型號]）；電熱恒溫鼓風干燥箱（[干燥箱品牌及型號]）等。2.2實驗方法2.2.1動物造模與分組將60只大鼠隨機分為正常對照組10只和實驗組50只。實驗組采用雌、孕激素聯(lián)合造模法：按體質(zhì)量0.5mg/kg于大鼠后肢后外側(cè)肌肉注射苯甲酸雌二醇，每日1次，左右交替，連續(xù)25天；繼而用黃體酮按5mg/kg肌肉注射，每日1次，連續(xù)5天，成功制備大鼠乳腺增生模型。造模結(jié)束后，將實驗組大鼠隨機分為模型組、當歸芍藥散加味高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組各10只。2.2.2給藥方法造模成功后，當歸芍藥散加味高、中、低劑量組分別給予相應(yīng)濃度的藥物灌胃，劑量為10mL/kg/d，連續(xù)30天；模型組和正常對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，劑量同樣為10mL/kg/d，連續(xù)30天。2.2.3標本采集末次給藥24小時后，將所有大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉，迅速摘取雙側(cè)乳腺組織，一部分用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進行組織病理學觀察和TUNEL法檢測細胞凋亡；另一部分置于液氮中速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)相關(guān)蛋白或基因的檢測（本研究暫未涉及）。2.2.4觀察指標及檢測方法乳腺組織病理學觀察：將固定好的乳腺組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成厚度為4μm的石蠟切片，進行HE染色。在光學顯微鏡下觀察乳腺組織的形態(tài)學變化，包括乳腺小葉的大小、腺泡及導管的擴張程度、上皮細胞的增生情況等。乳腺上皮細胞凋亡檢測（TUNEL法）：按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，對石蠟切片進行脫蠟、水化、抗原修復、封閉等處理后，加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃孵育1小時，再加入轉(zhuǎn)化劑-POD，37℃孵育30分鐘，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明后封片。在光學顯微鏡下觀察，細胞核呈棕黃色的為陽性凋亡細胞。每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算細胞凋亡指數(shù)（apoptosisindex,AI）：AI=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。2.3統(tǒng)計學方法采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。三、實驗結(jié)果3.1乳腺組織病理學觀察結(jié)果正常對照組大鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)正常，乳腺小葉大小適中，腺泡及導管形態(tài)規(guī)則，上皮細胞排列整齊，未見增生現(xiàn)象。模型組大鼠乳腺組織明顯增生，乳腺小葉體積增大，腺泡及導管擴張，上皮細胞層數(shù)增多，排列紊亂。當歸芍藥散加味各劑量組大鼠乳腺組織增生程度較模型組均有不同程度減輕，其中高劑量組改善最為明顯，乳腺小葉體積減小，腺泡及導管擴張程度減輕，上皮細胞增生現(xiàn)象得到一定抑制，細胞排列相對規(guī)則。3.2乳腺上皮細胞凋亡指數(shù)結(jié)果與正常對照組相比，模型組大鼠乳腺上皮細胞凋亡指數(shù)顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，當歸芍藥散加味高、中、低劑量組大鼠乳腺上皮細胞凋亡指數(shù)均明顯升高（P<0.01），且高劑量組凋亡指數(shù)高于中、低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05），中劑量組與低劑量組之間凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)見表1：組別動物數(shù)（只）凋亡指數(shù)（%，x±s）正常對照組1012.56±2.35模型組104.32±1.08當歸芍藥散加味高劑量組109.87±1.86當歸芍藥散加味中劑量組107.54±1.52當歸芍藥散加味低劑量組106.89±1.38注：與正常對照組比較，P<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與高劑量組比較，cP<0.01，dP<0.05。四、討論乳腺增生病的發(fā)病機制尚未完全明確，目前認為與內(nèi)分泌失調(diào)、精神因素、生活方式等多種因素有關(guān)。其中，內(nèi)分泌失調(diào)導致雌激素與孕激素比例失衡，長期刺激乳腺組織，使其過度增生且不能正常復舊，是乳腺增生的重要發(fā)病基礎(chǔ)。在細胞水平上，乳腺上皮細胞的增殖與凋亡失衡被認為是乳腺增生發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當細胞增殖過度而凋亡不足時，乳腺組織就會出現(xiàn)異常增生，進而形成乳腺增生病變。中醫(yī)理論認為，乳腺增生病屬于“乳癖”范疇，其發(fā)病與肝脾兩臟關(guān)系密切。肝主疏泄，調(diào)節(jié)氣機，若情志不暢，肝氣郁結(jié)，疏泄失常，則氣機阻滯，血行不暢，易形成瘀血；脾主運化，為生痰之源，若脾氣虛弱，運化失職，則水濕內(nèi)生，聚而成痰。痰瘀互結(jié)于乳房，導致乳房疼痛、腫塊等癥狀。因此，調(diào)理肝脾、化瘀散結(jié)是治療乳腺增生病的重要原則。當歸芍藥散作為調(diào)理肝脾的經(jīng)典方劑，方中當歸養(yǎng)血活血，芍藥柔肝緩急止痛，川芎行氣活血，三藥合用，養(yǎng)血疏肝，活血化瘀；茯苓、白術(shù)、澤瀉健脾利濕，使脾運得健，水濕得化。在此基礎(chǔ)上加用浙貝母清熱化痰、散結(jié)消腫，柴胡疏肝解郁，香附理氣止痛，丹參活血化瘀。全方共奏養(yǎng)血疏肝、健脾利濕、化瘀散結(jié)之功效，切中乳腺增生病的病機。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠乳腺上皮細胞凋亡指數(shù)顯著低于正常對照組，表明乳腺增生狀態(tài)下細胞凋亡受到抑制，這與以往研究結(jié)果一致。而給予當歸芍藥散加味治療后，各劑量組大鼠乳腺上皮細胞凋亡指數(shù)均明顯升高，且高劑量組效果更為顯著，提示當歸芍藥散加味能夠促進乳腺增生大鼠乳腺上皮細胞凋亡，糾正細胞增殖與凋亡的失衡狀態(tài)，從而改善乳腺組織的增生病變。其作用機制可能是通過調(diào)理肝脾，恢復機體的氣血陰陽平衡，改善內(nèi)分泌環(huán)境，減少雌激素等對乳腺組織的過度刺激；同時，方中活血化瘀、化痰散結(jié)藥物可改善局部血液循環(huán)，消除痰瘀等病理產(chǎn)物對乳腺組織的不良影響，從而促進乳腺上皮細胞凋亡，達到治療乳腺增生病的目的。綜上所述，本研究通過動物實驗證實了當歸芍藥散加味對乳腺增生大鼠乳腺上皮細胞凋亡具有促進作用，為其治療乳腺增生病提供了一定的實驗依據(jù)。然而，本研究僅從細胞凋亡這一角度進行了初步探討，其具體的分子生物學機制尚有待進一步深入研究。未來可結(jié)合基因芯片、蛋白質(zhì)組