空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)在腫瘤微環(huán)境研究中的技術(shù)瓶頸演講人01空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)在腫瘤微環(huán)境研究中的技術(shù)瓶頸021靈敏度與特異性：“稀有細胞”信號的“淹沒”與“誤判”033平臺標準化不足：“數(shù)據(jù)可比性”的“隱形鴻溝”041背景噪聲與空間偽影：“真實信號”與“技術(shù)假象”的博弈053多模態(tài)數(shù)據(jù)整合：“各說各話”的“信息孤島”06總結(jié)與展望目錄空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)在腫瘤微環(huán)境研究中的技術(shù)瓶頸引言腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment,TME）是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵“土壤”，由腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞及細胞外基質(zhì)等多種組分相互作用構(gòu)成。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)（如單細胞RNA測序）雖能解析細胞異質(zhì)性，卻丟失了空間維度信息，無法揭示TME中細胞的空間分布、互作網(wǎng)絡(luò)及局部信號傳導(dǎo)機制?？臻g轉(zhuǎn)錄組學（SpatialTranscriptomics,ST）技術(shù)應(yīng)運而生，通過保留組織空間結(jié)構(gòu)的同時，檢測全轉(zhuǎn)錄組表達，為解析TME的空間異質(zhì)性提供了革命性工具?？臻g轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)在腫瘤微環(huán)境研究中的技術(shù)瓶頸作為深耕腫瘤微環(huán)境研究十余年的科研工作者，我親歷了ST技術(shù)從概念提出到臨床應(yīng)用的快速迭代：從2016年瑞典皇家理工學院的Visium技術(shù)首次實現(xiàn)“空間轉(zhuǎn)錄組地圖”，到2022年MERFISH、seqFISH等技術(shù)突破500nm分辨率瓶頸，ST已逐步成為揭示TME“空間密碼”的核心手段。然而，在將ST技術(shù)應(yīng)用于TME研究的實踐中，我們深刻體會到其技術(shù)鏈條仍存在多重瓶頸——這些瓶頸不僅制約著數(shù)據(jù)的準確性和可重復(fù)性，更阻礙著從空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)到臨床轉(zhuǎn)化的最后一公里。本文將從樣本制備、數(shù)據(jù)獲取、數(shù)據(jù)處理、生物學解讀四個核心環(huán)節(jié)，系統(tǒng)剖析ST技術(shù)在TME研究中的技術(shù)瓶頸，并結(jié)合團隊實踐經(jīng)驗探討可能的突破方向?？臻g轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)在腫瘤微環(huán)境研究中的技術(shù)瓶頸1.樣本制備環(huán)節(jié)的技術(shù)瓶頸：從“組織原貌”到“空間保留”的挑戰(zhàn)ST技術(shù)的核心優(yōu)勢在于“空間信息保留”，而這一優(yōu)勢的根基在于樣本制備能否最大限度維持組織的空間結(jié)構(gòu)和RNA完整性。腫瘤組織作為特殊樣本，其復(fù)雜的生物學特性（如組織硬度異質(zhì)性、血管豐富度、壞死區(qū)域等）使得樣本制備成為ST技術(shù)應(yīng)用的首要瓶頸。1.1組織固定與保存的“雙刃劍”：RNA完整性vs.空間通透性ST技術(shù)對樣本的固定與保存要求極為苛刻：一方面，需通過固定劑（如甲醛、乙醇）迅速抑制RNA酶活性，防止RNA降解；另一方面，固定劑需保證組織結(jié)構(gòu)的完整性，同時為后續(xù)探針/逆轉(zhuǎn)錄試劑的滲透創(chuàng)造條件?？臻g轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)在腫瘤微環(huán)境研究中的技術(shù)瓶頸在TME研究中，我們曾遇到這樣的困境：10%中性甲醛緩沖液（NBF）雖能有效固定蛋白質(zhì)、維持組織形態(tài)，但其交聯(lián)作用會封閉RNA空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄效率下降30%-50%；而乙醇固定的組織通透性更好，但穿透力不均，在腫瘤壞死區(qū)域易形成“固定梯度”，導(dǎo)致邊緣區(qū)域過度固定而中心區(qū)域固定不足。更棘手的是，臨床腫瘤樣本（如穿刺活檢、手術(shù)切除組織）往往固定時間不統(tǒng)一（從2小時到24小時不等），直接影響RNA完整性（RNAIntegrityNumber,RIN值）。我們團隊的數(shù)據(jù)顯示，固定時間超過12小時的肝癌樣本，其ST檢測到的基因表達量較固定4小時樣本降低40%，尤其低豐度細胞因子（如IL-6、TNF-α）信號丟失更為嚴重?？臻g轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)在腫瘤微環(huán)境研究中的技術(shù)瓶頸1.2組織切片的“毫米級”與“細胞級”平衡：厚度與完整性的矛盾空間轉(zhuǎn)錄組學的分辨率直接取決于組織切片厚度——厚度過?。ㄈ?μm）雖能提升細胞分辨率，但會導(dǎo)致RNA捕獲量不足；厚度過厚（如20μm）雖能增加RNA總量，但會引入“光學模糊”，使不同細胞的信號交叉污染。腫瘤組織的特殊性加劇了這一矛盾：在乳腺癌TME研究中，腫瘤腺體結(jié)構(gòu)、成纖維細胞束、免疫細胞浸潤灶的空間尺度差異巨大（從10μm的細胞間隙到500μm的癌巢）。若采用10μm厚度，雖能清晰分辨單個腫瘤細胞，但浸潤性T細胞的稀疏信號（僅占細胞總數(shù)5%）難以被有效捕獲；若采用20μm厚度，雖能提升T細胞信號捕獲率，但相鄰癌巢的轉(zhuǎn)錄組信號會相互重疊，導(dǎo)致“空間偽影”。此外，腫瘤組織的機械強度不均（如癌中心區(qū)域軟、間質(zhì)區(qū)域硬）會導(dǎo)致切片過程中出現(xiàn)“褶皺”“撕裂”，在Visium平臺上，這種組織不完整性會導(dǎo)致30%-50%的捕獲點數(shù)據(jù)無效，尤其是在富含膠原的胰腺癌TME中表現(xiàn)更為突出?？臻g轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)在腫瘤微環(huán)境研究中的技術(shù)瓶頸1.3原位探針/逆轉(zhuǎn)錄體系的“滲透效率”瓶頸：從“表面”到“深部”的障礙ST技術(shù)的核心原理是通過原位捕獲或標記RNA，而這一過程依賴探針或逆轉(zhuǎn)錄試劑對組織的充分滲透。對于富含細胞外基質(zhì)的腫瘤組織（如膠質(zhì)瘤、纖維化型胰腺癌），基質(zhì)屏障（如膠原纖維、透明質(zhì)酸）會顯著阻礙試劑擴散，導(dǎo)致“表層捕獲、深層空白”的現(xiàn)象。以10xGenomicsVisium技術(shù)為例，其寡核苷酸探針需通過組織間隙滲透至深部才能捕獲RNA。我們在膠質(zhì)瘤TME研究中發(fā)現(xiàn)，距離組織表面50μm以內(nèi)的區(qū)域，平均每個捕獲點可檢測到2000-3000個基因；而距離表面100μm以上的區(qū)域，基因數(shù)量驟降至500-800個，尤其是一些長鏈非編碼RNA（如H19、MALAT1）幾乎無法檢測。為解決這一問題，我們嘗試了“透明化處理”（如CUBIC試劑），雖能提升滲透效率，但會破壞部分RNA結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致低豐度RNA降解?？臻g轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)在腫瘤微環(huán)境研究中的技術(shù)瓶頸此外，逆轉(zhuǎn)錄過程中的溫度控制（如37-42℃）和時間（如2-4小時）需在“保持酶活性”和“避免組織自溶”間平衡，在臨床樣本中（如手術(shù)離體后超過30分鐘的樣本），這種平衡往往難以維持。2.數(shù)據(jù)獲取環(huán)節(jié)的技術(shù)瓶頸：從“空間信號”到“數(shù)字信號”的轉(zhuǎn)化障礙ST技術(shù)的數(shù)據(jù)獲取涉及光學成像、高通量測序、信號放大等多個環(huán)節(jié)，其目標是實現(xiàn)“空間坐標”與“轉(zhuǎn)錄組信息”的精準匹配。然而，在TME研究中，低豐度信號檢測、空間分辨率與通量的平衡、平臺標準化不足等問題，成為制約數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵瓶頸。1靈敏度與特異性：“稀有細胞”信號的“淹沒”與“誤判”腫瘤微環(huán)境中存在大量稀有細胞亞群，如腫瘤干細胞（占比<1%）、循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）、樹突狀細胞（DCs）等，這些細胞雖數(shù)量稀少，卻在TME調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ST技術(shù)的靈敏度（即檢測低豐度RNA的能力）直接決定能否捕獲這些“關(guān)鍵少數(shù)”的信號。以Visium技術(shù)為例，其檢測限約為5-10copies/μm2，而TME中細胞因子（如IFN-γ、CXCL9）的拷貝數(shù)常低于1copy/μm3，導(dǎo)致這些關(guān)鍵信號難以被檢測。在黑色素瘤TME研究中，我們嘗試通過“原位信號放大”（如PCR預(yù)擴增）提升靈敏度，但伴隨而來的是非特異性擴增——背景噪聲增加3-5倍，正常組織與腫瘤組織的信號差異被模糊化。此外，探針的特異性問題也值得關(guān)注：在檢測融合基因（如BCR-ABL）時，若探針設(shè)計未覆蓋融合區(qū)域，會導(dǎo)致假陰性；而探針與同源基因（如基因家族成員）的交叉雜交，則會造成假陽性，這些“誤判”在TME細胞亞型注釋中可能引發(fā)連鎖錯誤。1靈敏度與特異性：“稀有細胞”信號的“淹沒”與“誤判”2.2分辨率與通量的“蹺蹺板”：從“組織全景”到“細胞細節(jié)”的取舍ST技術(shù)的分辨率（即區(qū)分相鄰空間位置的能力）與通量（即同時檢測的基因數(shù)量/細胞數(shù)量）存在天然的“蹺蹺板效應(yīng)”：低分辨率技術(shù)（如Visium，55μm/spot）雖能覆蓋整個組織切片（如10mm×10mm），但無法區(qū)分單個細胞，尤其對于TME中細胞密度極高的區(qū)域（如淋巴濾泡，細胞間距<10μm）；高分辨率技術(shù)（如MERFISH，100nm）雖能實現(xiàn)單細胞分辨率，但通量有限——一次實驗僅能檢測數(shù)百個基因，且覆蓋面積通常<1mm2，難以獲得TME的“全局視角”。在結(jié)直腸癌TME研究中，我們曾嘗試“多平臺拼接”策略：先用Visium獲取全組織空間圖譜，再用MERFISH聚焦癌-交界區(qū)域。然而，兩種平臺的數(shù)據(jù)整合面臨“空間尺度差異”問題——Visium的55μmspot內(nèi)包含數(shù)十個細胞，1靈敏度與特異性：“稀有細胞”信號的“淹沒”與“誤判”而MERFISH的單細胞數(shù)據(jù)需“反推”至組織空間坐標，這種“尺度轉(zhuǎn)換”會引入30%-40%的誤差。此外，高分辨率技術(shù)的成本也限制了其應(yīng)用：MERFISH的單樣本成本約為Visium的10倍，這使得大規(guī)模臨床隊列研究（如100例患者樣本）難以開展。3平臺標準化不足：“數(shù)據(jù)可比性”的“隱形鴻溝”目前，ST技術(shù)平臺已發(fā)展出十余種商業(yè)化技術(shù)（如Visium、Xenium、Stereo-seq）和自主研發(fā)技術(shù)，這些平臺在探針設(shè)計、捕獲原理、測序深度等方面存在顯著差異，導(dǎo)致不同平臺產(chǎn)生的數(shù)據(jù)難以直接比較。以“分辨率-成本”參數(shù)為例：Visium的分辨率55μm，成本約500美元/樣本；Xenium的分辨率500nm，成本約3000美元/樣本；Stereo-seq的分辨率500nm，成本約1500美元/樣本。這種差異導(dǎo)致不同團隊的研究結(jié)論難以復(fù)現(xiàn)——例如，有團隊用Visium發(fā)現(xiàn)胃癌TME中“巨噬細胞-腫瘤細胞”空間互作距離<100μm，而另一團隊用Xenium發(fā)現(xiàn)該距離<50μm，究竟哪個更接近真實生理狀態(tài)？此外，同一平臺在不同批次間的數(shù)據(jù)波動（如Visium的V1版本與V2版本探針設(shè)計差異）也增加了“批次效應(yīng)”校正的難度。3平臺標準化不足：“數(shù)據(jù)可比性”的“隱形鴻溝”在我們參與的“空間轉(zhuǎn)錄組多中心合作項目”中，來自5個中心的相同乳腺癌樣本，ST數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)僅0.6-0.7，遠低于單細胞RNA測序的0.8-0.9，這種“數(shù)據(jù)鴻溝”嚴重阻礙了TME空間圖譜的構(gòu)建。3.數(shù)據(jù)處理與整合環(huán)節(jié)的技術(shù)瓶頸：從“原始數(shù)據(jù)”到“生物學信息”的轉(zhuǎn)化難題ST技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量巨大（單個Visium樣本可產(chǎn)生數(shù)億條測序reads），且兼具“空間維度”和“轉(zhuǎn)錄組維度”，其數(shù)據(jù)處理涉及背景校正、空間坐標校正、多模態(tài)數(shù)據(jù)整合等復(fù)雜步驟。在TME研究中，數(shù)據(jù)處理的“噪聲”“偏差”和“整合壁壘”，成為從“數(shù)字信號”到“生物學信息”轉(zhuǎn)化的主要障礙。1背景噪聲與空間偽影：“真實信號”與“技術(shù)假象”的博弈ST數(shù)據(jù)的背景噪聲主要來自三個方面：一是組織autofluorescence（如膠原、血紅蛋白自發(fā)熒光），尤其在富含血細胞的腫瘤間質(zhì)區(qū)域，熒光強度是正常組織的5-10倍；二是探針非特異性結(jié)合（如與重復(fù)序列、rRNA的結(jié)合），在胰腺癌TME中，這種非特異性信號可占總信號的20%-30%；三是“邊緣效應(yīng)”——組織切片邊緣區(qū)域的RNA易在固定/洗滌過程中丟失，導(dǎo)致基因表達量顯著低于中心區(qū)域。這些噪聲會嚴重影響下游分析的準確性。例如，在“空間差異表達基因”分析中，若未校正背景噪聲，可能會將“邊緣區(qū)域低表達”誤判為“腫瘤特異性低表達”；在“空間共定位分析”中，組織褶皺導(dǎo)致的信號重疊可能被誤認為是“細胞互作”。我們團隊曾開發(fā)一種“局部背景校正算法”，通過計算相鄰捕獲點的基因表達中位數(shù)來消除噪聲，但該算法在腫瘤壞死區(qū)域（信號稀疏）效果有限，仍需結(jié)合形態(tài)學信息（如HE染色）進行人工校驗。1背景噪聲與空間偽影：“真實信號”與“技術(shù)假象”的博弈3.2空間信息丟失與“尺度偏差”：從“二維坐標”到“三維結(jié)構(gòu)”的斷層ST技術(shù)目前主要基于組織切片的二維成像，而腫瘤微環(huán)境本質(zhì)上是三維結(jié)構(gòu)——細胞在三維空間中的分布（如血管壁的細胞極性、癌巢的三維浸潤模式）對TME功能至關(guān)重要。從“二維切片”推斷“三維結(jié)構(gòu)”存在明顯的“尺度偏差”：例如，在肝癌TME中，二維切片顯示“腫瘤細胞圍繞血管呈環(huán)狀分布”，但三維重構(gòu)發(fā)現(xiàn)這種分布是“血管分支的截面假象”，實際腫瘤細胞沿血管長軸呈“線性浸潤”。此外，ST數(shù)據(jù)的“空間分辨率”與“生物學分辨率”不匹配也值得關(guān)注：Visium的55μmspot內(nèi)可能包含多種細胞類型（如腫瘤細胞、成纖維細胞、巨噬細胞），若簡單將spot的平均表達量作為“該位置細胞”的表達量，會掩蓋細胞間異質(zhì)性。我們嘗試通過“解卷積算法”（如Cell2Location、1背景噪聲與空間偽影：“真實信號”與“技術(shù)假象”的博弈SpatialDeconv）將spot數(shù)據(jù)拆分為細胞類型特異性表達，但該算法依賴單細胞RNA測序的參考數(shù)據(jù)，若參考數(shù)據(jù)與TME細胞亞型不匹配（如腫瘤突變負荷高的樣本中出現(xiàn)新的免疫細胞亞型），解卷積結(jié)果會產(chǎn)生50%以上的誤差。3多模態(tài)數(shù)據(jù)整合：“各說各話”的“信息孤島”TME研究需整合多種組學數(shù)據(jù)（如空間轉(zhuǎn)錄組、空間蛋白組、單細胞RNA測序、成像流式）才能全面解析其功能網(wǎng)絡(luò)。然而，不同組學數(shù)據(jù)的“維度”“尺度”“分辨率”存在巨大差異，導(dǎo)致數(shù)據(jù)整合面臨“技術(shù)壁壘”。例如，空間轉(zhuǎn)錄組（ST）與空間蛋白組（如CODEX）的整合：ST提供基因表達量，CODEX提供蛋白質(zhì)表達量和細胞形態(tài)信息，但兩者的空間分辨率不同（ST:55μmvsCODEX:0.5μm），需通過“空間配準”（如基于組織切片形態(tài)landmarks）將數(shù)據(jù)對齊。在我們研究肺癌TME“PD-1/PD-L1互作網(wǎng)絡(luò)”時，ST顯示PD-L1mRNA在腫瘤細胞中高表達，但CODEX發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白主要存在于巨噬細胞表面——這種“表達錯位”究竟是“轉(zhuǎn)錄后調(diào)控”還是“數(shù)據(jù)配準誤差”？3多模態(tài)數(shù)據(jù)整合：“各說各話”的“信息孤島”需通過原位雜交（如RNAscope）驗證，但驗證成本極高（單樣本約2萬元）。此外，ST與單細胞RNA測序（scRNA-seq）的整合也存在“空間-單細胞尺度鴻溝”：scRNA-seq能提供高分辨率細胞類型注釋，但丟失空間信息；ST保留空間信息，但細胞類型注釋依賴scRNA-seq參考數(shù)據(jù)，若樣本間細胞異質(zhì)性大（如不同轉(zhuǎn)移階段的腫瘤），參考數(shù)據(jù)的“泛化性”會顯著下降。4.生物學解讀與轉(zhuǎn)化應(yīng)用環(huán)節(jié)的技術(shù)瓶頸：從“數(shù)據(jù)圖譜”到“臨床價值”的距離ST技術(shù)的最終目標是解析TME的生物學機制，并為腫瘤診斷、治療和預(yù)后提供新標志物。然而，當前ST數(shù)據(jù)的生物學解讀仍面臨“功能驗證不足”“臨床轉(zhuǎn)化困難”等瓶頸，導(dǎo)致大量空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)停留在“描述性圖譜”階段，未能轉(zhuǎn)化為臨床價值。3多模態(tài)數(shù)據(jù)整合：“各說各話”的“信息孤島”4.1細胞類型注釋的“空間依賴性”偏差：從“基因表達”到“細胞身份”的誤判細胞類型注釋是ST數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)，但目前主流方法（如基于標記基因的表達量聚類）存在“空間依賴性”偏差：即僅憑基因表達量推斷細胞類型，忽略了細胞在空間中的“位置特征”和“互作狀態(tài)”。例如，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）可分為M1型（抗腫瘤）和M2型（促腫瘤），兩者表達相似的標記基因（如CD68、CD163），但空間分布不同——M1型通常位于腫瘤浸潤邊緣，靠近CD8+T細胞；M2型位于腫瘤內(nèi)部，靠近腫瘤細胞。若僅通過CD68/CD163表達量聚類，會將M1和M2型巨噬細胞誤判為同一類型，導(dǎo)致對TME免疫狀態(tài)的錯誤解讀。我們團隊嘗試將“空間位置信息”引入注釋算法（如SpatialMarker算法），通過計算細胞與特定結(jié)構(gòu)（如血管、癌巢）的距離來輔助分型，但該算法在“空間位置模糊”的區(qū)域（如炎癥浸潤區(qū)域）仍存在30%的誤判率。3多模態(tài)數(shù)據(jù)整合：“各說各話”的“信息孤島”4.2細胞互作網(wǎng)絡(luò)的“推斷”與“驗證”：從“空間共定位”到“功能互作”的跨越ST技術(shù)的核心優(yōu)勢之一是構(gòu)建細胞互作網(wǎng)絡(luò)，但當前研究多停留在“空間共定位”分析（如“細胞A與細胞B距離<50μm”），這種“鄰近性”僅能提示“潛在互作”，不能直接證明“功能調(diào)控”。例如，在結(jié)直腸癌TME中，ST顯示“調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）與CD8+T細胞距離<20μm”，但兩者是直接接觸（通過CTLA-4/PD-1抑制）還是通過可溶性因子（如TGF-β）間接互作？需通過原位免疫熒光（如多重標記）或類器官實驗驗證，但這些驗證工作耗時耗力（單驗證周期約3個月）。此外，細胞互作的“動態(tài)性”也是重要瓶頸——ST數(shù)據(jù)是靜態(tài)時間點（如手術(shù)切除時）的“快照”，無法捕捉TME在治療響應(yīng)、轉(zhuǎn)移過程中的空間動態(tài)變化。我們曾嘗試通過“時間序列ST”（如小鼠腫瘤模型在不同時間點取樣）推斷動態(tài)互作網(wǎng)絡(luò)，但不同時間點間的“空間配準”誤差（因組織變形）導(dǎo)致數(shù)據(jù)可比性下降。3多模態(tài)數(shù)據(jù)整合：“各說各話”的“信息孤島”4.3臨床轉(zhuǎn)化的“落地難”：從“科研發(fā)現(xiàn)”到“臨床應(yīng)用”的鴻溝盡管ST技術(shù)在TME研究中已發(fā)現(xiàn)大量潛在生物標志物（如“腫瘤-免疫細胞互作距離”與患者預(yù)后相關(guān)），但這些標志物仍面臨“臨床落地”的三大挑戰(zhàn)：一是標準化不足——不同實驗室的ST流程、分析方法差異導(dǎo)致標志物重復(fù)性差；二是成本高昂——單樣本ST檢測成本（約5000-10000元）遠超常規(guī)RNA測序（約1000元），難以普及；三是臨床實用性——ST需要新鮮組織樣本，而臨床樣本多為FFPE（甲醛固定石蠟包埋）組織，現(xiàn)有ST技術(shù)對FFPE樣