實驗二原核生物基因組DNA的制備

一、實驗?zāi)康恼莆諒募?xì)菌中提取基因組DNA的基本原理熟悉利用試劑盒提取細(xì)菌DNA的技術(shù)流程提取卡介苗BCG基因組DNA二、實驗原理①裂解細(xì)胞②除去蛋白質(zhì)③析出DNACTAB(cetyltriethylammoniumbromide，十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，它能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在高鹽溶液(0.7mol/lNaCl)中可溶并且穩(wěn)定存在。此時的高鹽溶液中除含有CTAB-核酸復(fù)合物外，還含有大量的多糖和蛋白。核酸提純(1)用氯仿先對此高鹽溶液進(jìn)行抽提，大量蛋白和多糖等被從溶液中抽提沉淀出來，而核酸仍留在溶液中；接著可用乙醇或異丙醇將核酸從溶液中沉淀出來，然后用水或TE緩沖液等將核酸溶解。(2)降低溶液中鹽的濃度(0.3mol/lNaCl)，CTAB與核酸的復(fù)合物就會因溶解度降低而沉淀出來，而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中；通過離心將CTAB-核酸沉淀下來，然后溶解于高鹽溶液中。三、實驗材料卡介苗BCG細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）DP302水浴鍋、離心機(jī)、移液器試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)提取細(xì)菌基因組DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為特有新型材料，可高效、專一吸附DNA，最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫構(gòu)建等實驗。四、注意事項實驗中所有的廢棄物均要高壓滅菌。五、實驗步驟（1）取細(xì)菌培養(yǎng)液1-5ml，10,000rpm，1min，盡量吸凈上清。（2）沉淀中加入180μl溶菌酶溶液（20mg/ml），37℃，60min。（3）加入20μl蛋白酶K溶液，混勻。（4）加入220μl緩沖液GB，振蕩15s，70℃，10min，溶液變澄清。瞬時離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。（5）加入220μl無水乙醇，充分振蕩15s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，瞬時離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。（6）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm，30s，棄廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。（7）向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD，12,000rpm，30s，棄廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。（8）向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm，30s，棄廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。（9）重復(fù)步驟⑧。（10）將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm，2min，棄廢液。將吸附柱CB3室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。（11）吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12,000rpm，2min，將溶液收集到離心管中。（為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12,000rpm，2min）五、結(jié)果檢測紫外吸收法檢測所提取基因組DNA的濃度與純度；取少量DNA溶液在