微環(huán)DNA介導(dǎo)anti-IGF1R/CD3雙特異抗體表達在肝癌體外免疫治療中的機制與效能探究一、引言1.1研究背景肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)2018年全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肝癌的年發(fā)病率高達85.4萬例，病死率達81萬例，東亞和非洲地區(qū)是肝癌的高發(fā)區(qū)域，尤其是中國、日本和韓國。在中國，肝癌更有著“癌中之王”的惡名，其發(fā)病隱匿，早期診斷困難，大多數(shù)患者確診時已處于中晚期，且常合并基礎(chǔ)肝病，導(dǎo)致腫瘤進展迅速，治療極為棘手，患者預(yù)后普遍不佳。目前，肝癌的常規(guī)治療手段包括手術(shù)切除、放療、化療、介入治療等。手術(shù)切除雖被公認(rèn)為治療肝癌的首選方法，但僅適用于早期肝癌患者，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。對于中晚期肝癌患者，放療和化療的效果往往不盡人意，且會帶來嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，對患者的生活質(zhì)量造成極大影響。介入治療雖能在一定程度上控制腫瘤進展，但也存在治療不徹底等問題。近年來，隨著對腫瘤免疫機制研究的不斷深入，免疫治療作為一種新興的治療方式，為肝癌患者帶來了新的希望。免疫治療主要通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，使其能夠識別和攻擊腫瘤細(xì)胞，從而達到治療腫瘤的目的。其中，免疫檢查點抑制劑如程序性死亡受體-1（PD-1）抑制劑和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）抑制劑等，在肝癌治療中取得了一定的成果。這些藥物可以阻斷免疫檢查點，激活T淋巴細(xì)胞，增強其對肝癌細(xì)胞的殺傷作用。然而，仍有許多患者對免疫檢查點抑制劑無反應(yīng)，且部分患者會出現(xiàn)腫瘤免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。雙特異抗體作為一種新型的腫瘤免疫治療技術(shù)，近年來備受關(guān)注。它能夠橋接腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞之間形成“免疫突觸”，從而高效地介導(dǎo)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。研究表明，雙特異抗體介導(dǎo)的腫瘤特異殺傷效率比單抗強萬倍以上。此外，雙特異性抗體分子量小（僅為單抗的1/3），易于滲入腫瘤組織，有助于提高療效。然而，雙特異性抗體也存在半衰期短的問題，需要連續(xù)給藥，給治療帶來了諸多不便。為了克服雙特異性抗體半衰期短的缺點，本研究計劃利用基因載體實現(xiàn)雙特異抗體的長期穩(wěn)定表達。微環(huán)DNA作為一種新型的基因載體，具有高效表達、低免疫原性等優(yōu)點，有望成為表達雙特異抗體的理想載體。本研究旨在構(gòu)建基于微環(huán)DNA基因載體表達雙特異抗體Anti-IGF1R/CD3，并開發(fā)新型有機-無機基因遞送系統(tǒng)stPEI-CaP/MC.DNA，探討其在抗肝癌體外免疫中的作用，為肝癌的免疫治療提供新的策略和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在構(gòu)建基于微環(huán)DNA基因載體表達雙特異抗體Anti-IGF1R/CD3，并開發(fā)新型有機-無機基因遞送系統(tǒng)stPEI-CaP/MC.DNA，深入探討其在抗肝癌體外免疫中的作用機制，為肝癌的免疫治療提供新的策略和方法。具體而言，本研究將利用微環(huán)DNA高效表達、低免疫原性的特點，實現(xiàn)雙特異抗體Anti-IGF1R/CD3的穩(wěn)定表達，同時開發(fā)新型基因遞送系統(tǒng)，提高微環(huán)DNA的轉(zhuǎn)染效率，增強其在肝癌治療中的效果。本研究具有重要的理論意義和實踐意義。在理論層面，通過深入研究微環(huán)DNA表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的抗肝癌體外免疫機制，有助于揭示肝癌免疫治療的新靶點和新機制，為肝癌免疫治療的理論研究提供新的思路和方法。此外，本研究還將為基因載體和基因遞送系統(tǒng)的研究提供新的實驗依據(jù)，推動相關(guān)領(lǐng)域的理論發(fā)展。在實踐層面，本研究的成果有望為肝癌的臨床治療提供新的策略和方法。當(dāng)前，肝癌的治療面臨諸多挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)治療方法的療效有限，免疫治療雖取得一定進展，但仍存在諸多問題。本研究中基于微環(huán)DNA表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的免疫治療策略，有望克服現(xiàn)有治療方法的不足，提高肝癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。此外，本研究開發(fā)的新型有機-無機基因遞送系統(tǒng)stPEI-CaP/MC.DNA，具有高效轉(zhuǎn)染、低毒性等優(yōu)點，為基因治療藥物的開發(fā)提供了新的技術(shù)平臺，具有廣闊的應(yīng)用前景。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝癌概述肝癌，作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，主要包括肝細(xì)胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）、膽管細(xì)胞癌（IntrahepaticCholangiocarcinoma，ICC）以及轉(zhuǎn)移性肝癌。肝細(xì)胞癌起源于肝細(xì)胞，是肝癌中最為常見的類型，約占肝癌病例的80%-90%。其發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，其中乙肝、丙肝病毒感染是重要的致病因素。在我國，約90%的肝細(xì)胞癌患者存在乙型肝炎病毒感染背景。此外，黃曲霉素、酒精、飲水污染、非酒精性脂肪肝等也與肝細(xì)胞癌的發(fā)病緊密相連。長期進食霉變食物，如被黃曲霉素污染的糧食，會顯著增加患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險。過度飲酒導(dǎo)致的酒精性肝病，也是肝細(xì)胞癌的重要誘因之一。膽管細(xì)胞癌則起源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，其發(fā)病誘因和病因較為復(fù)雜，目前已確定與乙肝、丙肝病毒感染、肝硬化、糖尿病、血吸蟲感染、肝內(nèi)膽管結(jié)石等多種因素有關(guān)。肝硬化患者由于肝臟組織的纖維化和結(jié)構(gòu)破壞，膽管細(xì)胞更容易發(fā)生癌變。糖尿病患者體內(nèi)的高血糖環(huán)境，可能會促進膽管細(xì)胞的異常增殖，從而增加膽管細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險。轉(zhuǎn)移性肝癌并非原發(fā)于肝臟，而是由其他臟器的腫瘤細(xì)胞通過血液、淋巴等途徑轉(zhuǎn)移至肝臟形成的繼發(fā)性肝癌。常見的腫瘤臟器來源包括結(jié)直腸、胰腺、卵巢、乳房等。當(dāng)結(jié)直腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移時，癌細(xì)胞會通過門靜脈系統(tǒng)進入肝臟，在肝臟內(nèi)生長繁殖，形成轉(zhuǎn)移性肝癌。肝癌的發(fā)病機制尚未完全明確，但一般認(rèn)為是一個多步驟、多因素的復(fù)雜過程。正常肝細(xì)胞在受到各種致癌因素的長期作用下，原癌基因被激活，抑癌基因失活，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化和凋亡失衡，進而逐漸發(fā)展為癌細(xì)胞。乙肝病毒感染后，病毒基因可整合到肝細(xì)胞基因組中，引起肝細(xì)胞基因表達的改變，促進癌細(xì)胞的發(fā)生。黃曲霉素等化學(xué)致癌物可直接損傷肝細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致基因突變，引發(fā)細(xì)胞癌變。胰島素樣生長因子-1受體（Insulin-likeGrowthFactor-1Receptor，IGF1R）在肝癌細(xì)胞中高表達，對肝癌的發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵作用。IGF1R屬于受體酪氨酸激酶家族成員，其信號通路復(fù)雜。在配體IGF1刺激下，激活的IGF-1R可由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過磷酸化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)SERCA2第990位酪氨酸（Y990）位點激活SERCA2，引發(fā)鈣平衡紊亂，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而促進肝癌細(xì)胞的增殖。IGF1R還可通過激活下游的PI3K-AKT和MAPK信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞的存活和增殖。臨床研究表明，IGF1R的高表達與肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，高表達IGF1R的肝癌患者腫瘤復(fù)發(fā)率更高，生存期更短。因此，IGF1R成為肝癌治療的重要靶點，針對IGF1R的治療策略具有廣闊的研究前景。2.2雙特異抗體雙特異抗體（BispecificAntibody，BsAb）是一類具有獨特結(jié)構(gòu)和功能的人工抗體分子，能同時特異性結(jié)合兩種不同的抗原或一個抗原上的兩個不同表位。從結(jié)構(gòu)上看，它可以被視為將兩個不同特異性的抗體集成到了一個抗體之上，從而大大拓展了其應(yīng)用范圍。這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了雙特異抗體多種作用機制，使其在腫瘤免疫治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。雙特異抗體的種類豐富多樣，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點，主要可分為含F(xiàn)c區(qū)的雙特異性抗體和不含F(xiàn)c區(qū)的雙特異性抗體。含F(xiàn)c區(qū)的雙特異性抗體通過重鏈配對形成IgG樣結(jié)構(gòu)，抗體的Fc結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）及補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（CDC）等生物學(xué)功能。憑借現(xiàn)有通用抗體平臺技術(shù)，這類抗體易于實現(xiàn)產(chǎn)品的純化。常見的含F(xiàn)c區(qū)的雙特異性抗體包括Triomabs、kihIgG、Cross-Mab、ortho-FabIgG、DVD-Ig、two-in-oneIgG、IgG-scFv、scFv2-Fc等。以Triomabs為例，它是通過將兩種不同的雜交瘤細(xì)胞進行融合，形成三雜交瘤細(xì)胞，進而產(chǎn)生的一種雙特異性抗體。這種抗體的Fc段能夠與免疫細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，增強免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。不含F(xiàn)c區(qū)的雙特異性抗體則具有相對分子質(zhì)量小的特點，能夠在原核細(xì)胞中表達，并且更易穿過組織及腫瘤細(xì)胞到達靶位點。然而，由于其不含抗體Fc區(qū)，無法介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)功能，且半衰期通常較短。目前，此類雙特異性抗體主要有BiTE、DART、TandAbs、bi-Nanobody等。例如，BiTE（BispecificT-cellEngager）是一種雙特異性T細(xì)胞銜接器，由兩個單鏈抗體片段通過一段連接肽連接而成，能夠同時結(jié)合T細(xì)胞表面的CD3分子和腫瘤細(xì)胞表面的抗原，從而激活T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究中涉及的anti-IGF1R/CD3雙特異抗體，屬于效應(yīng)T細(xì)胞重定向類雙抗。其一端能夠特異性地結(jié)合肝癌細(xì)胞表面高表達的IGF1R，另一端則與T細(xì)胞表面的CD3分子緊密結(jié)合。通過這種方式，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體能夠在肝癌細(xì)胞和T細(xì)胞之間架起一座橋梁，拉近細(xì)胞毒性T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的距離。在正常情況下，T細(xì)胞的激活需要雙重信號，而anti-IGF1R/CD3雙特異抗體可以繞過這一復(fù)雜的激活過程，直接引導(dǎo)T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞進行特異性殺傷。這一過程中，T細(xì)胞被激活后，會釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)。穿孔素能夠在肝癌細(xì)胞膜上形成小孔，使顆粒酶得以進入肝癌細(xì)胞內(nèi)。顆粒酶進入細(xì)胞后，會激活一系列的凋亡信號通路，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡。此外，激活的T細(xì)胞還會分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細(xì)胞因子一方面可以直接抑制肝癌細(xì)胞的生長和增殖，另一方面還能夠招募和激活其他免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞等，增強機體對肝癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，共同發(fā)揮抗腫瘤作用。2.3微環(huán)DNA微環(huán)DNA（MinicircleDNA，MCDNA）是一類通過分子生物學(xué)技術(shù)制備的小型環(huán)狀DNA分子，其結(jié)構(gòu)相較于傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA更為精簡。在構(gòu)建過程中，微環(huán)DNA去除了質(zhì)粒DNA中不必要的細(xì)菌骨架序列，僅保留了真核表達元件，如啟動子、目的基因、終止子等。這種獨特的結(jié)構(gòu)使得微環(huán)DNA在基因治療領(lǐng)域展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢。從結(jié)構(gòu)上看，微環(huán)DNA呈閉合環(huán)狀，其大小通常在1-3kb之間，明顯小于傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA（一般為3-10kb）。較小的分子尺寸使其更易于穿透細(xì)胞膜，進入細(xì)胞內(nèi)部，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率。同時，閉合環(huán)狀的結(jié)構(gòu)賦予了微環(huán)DNA更高的穩(wěn)定性，使其在細(xì)胞內(nèi)能夠長時間存在，持續(xù)發(fā)揮作用。在基因治療中，微環(huán)DNA具有多方面的顯著優(yōu)勢。首先，由于去除了細(xì)菌骨架序列，微環(huán)DNA大大降低了免疫原性。傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA中的細(xì)菌序列容易被宿主免疫系統(tǒng)識別為外來物質(zhì)，引發(fā)免疫反應(yīng)，而微環(huán)DNA則有效避免了這一問題，減少了治療過程中的不良反應(yīng)，提高了治療的安全性。其次，微環(huán)DNA能夠?qū)崿F(xiàn)高效的基因表達。精簡的結(jié)構(gòu)使得轉(zhuǎn)錄過程更為順暢，減少了轉(zhuǎn)錄過程中的阻礙，從而能夠更高效地表達目的基因。研究表明，微環(huán)DNA介導(dǎo)的基因表達水平相較于傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA可提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍。此外，微環(huán)DNA在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)存在時間長，能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因的長期穩(wěn)定表達。這一特性對于需要長期治療的疾病，如慢性疾病、遺傳性疾病等，具有重要意義。微環(huán)DNA表達雙特異抗體的原理基于其攜帶的真核表達元件。當(dāng)微環(huán)DNA進入細(xì)胞后，啟動子會啟動轉(zhuǎn)錄過程，將目的基因（即雙特異抗體的編碼基因）轉(zhuǎn)錄為信使核糖核酸（mRNA）。隨后，mRNA在核糖體的作用下進行翻譯，合成雙特異抗體蛋白。由于微環(huán)DNA能夠在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，持續(xù)轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此可以實現(xiàn)雙特異抗體的長期穩(wěn)定表達。在肝癌免疫治療中，微環(huán)DNA表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體具有巨大的應(yīng)用潛力。如前所述，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體能夠特異性地結(jié)合肝癌細(xì)胞表面的IGF1R和T細(xì)胞表面的CD3，激活T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷作用。通過微環(huán)DNA將anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的編碼基因遞送至體內(nèi)，實現(xiàn)雙特異抗體的持續(xù)表達，有望增強對肝癌細(xì)胞的殺傷效果，提高治療成功率。同時，微環(huán)DNA的低免疫原性和高效表達特性，也為其在肝癌免疫治療中的應(yīng)用提供了有力保障。此外，微環(huán)DNA還可以與其他治療手段，如化療、放療、免疫檢查點抑制劑等聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用，進一步提高肝癌的治療效果。例如，與化療藥物聯(lián)合使用時，微環(huán)DNA表達的雙特異抗體可以增強T細(xì)胞對化療耐藥肝癌細(xì)胞的殺傷作用，克服化療耐藥問題；與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用時，可以激活更多的T細(xì)胞，增強機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。三、微環(huán)DNA表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的構(gòu)建與制備3.1構(gòu)建表達載體構(gòu)建基于微環(huán)DNA基因載體表達Anti-IGF1R/CD3雙特異抗體，是本研究的關(guān)鍵步驟，其過程涉及多個精細(xì)且復(fù)雜的技術(shù)環(huán)節(jié)。首先，獲取目的基因。通過基因合成的方法，按照Anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的氨基酸序列，反向推導(dǎo)其對應(yīng)的DNA序列，并進行人工合成。在合成過程中，對密碼子進行優(yōu)化，以提高基因在宿主細(xì)胞中的表達效率。由于不同物種對密碼子的偏好性存在差異，合理優(yōu)化密碼子能夠使目的基因更好地適配宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)，減少翻譯過程中的阻礙，從而顯著提高蛋白質(zhì)的合成效率。例如，將一些在人類細(xì)胞中使用頻率較低的密碼子替換為常用密碼子，可有效提升基因表達水平。同時，確保合成的基因序列準(zhǔn)確無誤，通過多次測序驗證，避免因堿基錯誤導(dǎo)致的抗體結(jié)構(gòu)和功能異常。然后，將目的基因與微環(huán)DNA載體進行連接。在這一過程中，選用合適的限制性內(nèi)切酶對目的基因和微環(huán)DNA載體進行酶切，使其產(chǎn)生互補的粘性末端或平末端。限制性內(nèi)切酶能夠識別特定的DNA序列，并在特定位置進行切割，為目的基因與載體的連接創(chuàng)造條件。比如，選用EcoRI和BamHI等限制性內(nèi)切酶，分別對目的基因和微環(huán)DNA載體進行酶切，酶切后的目的基因和載體片段具有互補的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。隨后，利用DNA連接酶將酶切后的目的基因與微環(huán)DNA載體進行連接，形成重組表達載體。DNA連接酶能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，實現(xiàn)目的基因與載體的共價連接。在連接反應(yīng)中，精確控制反應(yīng)條件，如溫度、時間、酶量等，以提高連接效率。通常，連接反應(yīng)在16℃下進行過夜，以確保目的基因與載體充分連接。為了驗證重組表達載體的正確性，采用多種鑒定方法。進行PCR鑒定，設(shè)計特異性引物，以重組表達載體為模板進行PCR擴增。若擴增出預(yù)期大小的條帶，則初步表明目的基因已成功連接到微環(huán)DNA載體上。接著，進行酶切鑒定，使用與連接時相同的限制性內(nèi)切酶對重組表達載體進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物的大小和條帶分布，進一步驗證目的基因的插入情況。最后，進行測序鑒定，將重組表達載體送至專業(yè)的測序公司進行測序，與原始目的基因序列進行比對，確保目的基因序列準(zhǔn)確無誤，無堿基突變、缺失或插入等異常情況。通過這一系列嚴(yán)格的鑒定步驟，保證重組表達載體的質(zhì)量和可靠性，為后續(xù)的實驗研究奠定堅實基礎(chǔ)。3.2基因遞送系統(tǒng)開發(fā)為了實現(xiàn)微環(huán)DNA的高效遞送，本研究致力于開發(fā)新型有機-無機基因遞送系統(tǒng)stPEI-CaP/MC.DNA。這一系統(tǒng)整合了聚乙烯亞胺（PEI）和磷酸鈣（CaP）的優(yōu)勢，旨在克服傳統(tǒng)基因遞送系統(tǒng)的局限性，為微環(huán)DNA進入細(xì)胞提供更有效的途徑。聚乙烯亞胺（PEI）作為一種陽離子聚合物，在基因遞送領(lǐng)域具有重要地位。它具有豐富的氨基基團，在生理pH條件下能夠質(zhì)子化，從而帶正電荷。這種正電荷特性使其能夠與帶負(fù)電荷的DNA通過靜電相互作用緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。PEI-DNA復(fù)合物可以通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進入細(xì)胞，進而實現(xiàn)基因的遞送。此外，PEI還具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”。當(dāng)PEI-DNA復(fù)合物進入細(xì)胞后，由于內(nèi)涵體中的酸性環(huán)境，PEI分子中的氨基會發(fā)生質(zhì)子化，導(dǎo)致內(nèi)涵體內(nèi)的離子濃度升高。為了維持離子平衡，水分子會大量涌入內(nèi)涵體，使其膨脹并最終破裂，從而將DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，避免了DNA被溶酶體降解的風(fēng)險。然而，PEI也存在一些缺點，如細(xì)胞毒性較高，尤其是高相對分子質(zhì)量的PEI，其毒性更為明顯。高濃度的PEI會破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞的正常生理功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。此外，PEI的體內(nèi)應(yīng)用還受到其免疫原性的限制，可能引發(fā)機體的免疫反應(yīng)，降低基因遞送效率。磷酸鈣（CaP）則是一種無機材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性。CaP可以與DNA形成納米級別的復(fù)合物，這種復(fù)合物能夠被細(xì)胞攝取。CaP的作用機制主要是通過與細(xì)胞膜表面的磷脂分子相互作用，促進復(fù)合物的內(nèi)吞。同時，CaP在細(xì)胞內(nèi)會逐漸降解，釋放出DNA，實現(xiàn)基因的傳遞。與PEI相比，CaP的細(xì)胞毒性較低，對細(xì)胞的正常生理功能影響較小。然而，CaP介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率相對較低，限制了其在基因治療中的廣泛應(yīng)用。為了充分發(fā)揮PEI和CaP的優(yōu)勢，克服它們各自的缺點，本研究對PEI進行了修飾，合成了stPEI。通過特定的化學(xué)修飾方法，在PEI分子上引入了一些功能性基團，如聚乙二醇（PEG）等。PEG修飾可以降低PEI的細(xì)胞毒性和免疫原性，同時增強其水溶性和穩(wěn)定性。PEG的親水性使得stPEI-DNA復(fù)合物在溶液中更加穩(wěn)定，減少了團聚現(xiàn)象的發(fā)生。此外，PEG修飾還可以延長復(fù)合物在體內(nèi)的循環(huán)時間，提高基因遞送效率。將修飾后的stPEI與CaP結(jié)合，構(gòu)建了stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，stPEI首先與微環(huán)DNA結(jié)合，形成帶正電荷的復(fù)合物。然后，CaP在復(fù)合物表面沉積，形成一層無機外殼。這種有機-無機復(fù)合結(jié)構(gòu)既利用了stPEI的高效結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)吞能力，又借助了CaP的低細(xì)胞毒性和生物相容性。CaP外殼可以保護內(nèi)部的stPEI-DNA復(fù)合物免受外界環(huán)境的影響，提高其穩(wěn)定性。同時，CaP的降解特性可以在細(xì)胞內(nèi)緩慢釋放出stPEI-DNA復(fù)合物，實現(xiàn)基因的持續(xù)遞送。對stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)的性能進行了全面表征。利用動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)測量了復(fù)合物的粒徑和電位。結(jié)果顯示，stPEI-CaP/MC.DNA復(fù)合物的粒徑在納米級別，大小均勻，有利于細(xì)胞攝取。其表面電位適中，既能保證與細(xì)胞表面的有效結(jié)合，又能避免過度聚集。通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察了復(fù)合物的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)出規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，CaP外殼均勻包裹在stPEI-DNA復(fù)合物表面。此外，還對復(fù)合物的穩(wěn)定性進行了測試，結(jié)果表明，在不同的生理條件下，stPEI-CaP/MC.DNA復(fù)合物都具有良好的穩(wěn)定性，能夠長時間保持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性。這些特性為stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)在抗肝癌體外免疫研究中的應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。3.3雙特異抗體表達與驗證為了驗證stPEI-CaP/MC.DNA系統(tǒng)能否高效表達anti-IGF1R/CD3抗體，本研究選用了人胚腎細(xì)胞HEK293T進行轉(zhuǎn)染實驗。HEK293T細(xì)胞具有生長迅速、易于轉(zhuǎn)染等優(yōu)點，是基因表達研究中常用的細(xì)胞系。在轉(zhuǎn)染實驗前，對HEK293T細(xì)胞進行了常規(guī)培養(yǎng)。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時進行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將stPEI-CaP/MC.DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。具體操作如下：首先，將適量的stPEI-CaP/MC.DNA復(fù)合物與脂質(zhì)體試劑按照一定比例混合，在室溫下孵育15-30分鐘，使其形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到預(yù)先接種好HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中。在轉(zhuǎn)染后的不同時間點，對細(xì)胞進行收集和處理，以檢測anti-IGF1R/CD3抗體的表達情況。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）對抗體表達進行定性分析。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確保每個樣品的蛋白上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。然后，將膜與anti-IGF1R/CD3抗體的一抗孵育過夜，一抗能夠特異性地識別并結(jié)合anti-IGF1R/CD3抗體。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次5-10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。接著，將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育1-2小時，二抗能夠與一抗結(jié)合，形成抗體-抗原-二抗復(fù)合物。再次用TBST緩沖液洗滌膜后，加入化學(xué)發(fā)光底物，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測條帶。如果在預(yù)期的分子量位置出現(xiàn)明顯的條帶，則表明anti-IGF1R/CD3抗體成功表達。利用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）對抗體表達進行定量分析。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液收集到離心管中，4℃、1000rpm離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片。將96孔酶標(biāo)板用包被緩沖液稀釋的anti-IGF1R/CD3抗體的捕獲抗體包被，4℃過夜。次日，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次3-5分鐘，以去除未結(jié)合的捕獲抗體。然后，用5%脫脂牛奶封閉酶標(biāo)板1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入到酶標(biāo)板中，37℃孵育1-2小時，使上清液中的anti-IGF1R/CD3抗體與捕獲抗體結(jié)合。用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板后，加入HRP標(biāo)記的檢測抗體，37℃孵育1-2小時，檢測抗體能夠與anti-IGF1R/CD3抗體結(jié)合。再次用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板，加入底物溶液，37℃避光孵育15-30分鐘，使底物在HRP的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度值計算出細(xì)胞培養(yǎng)上清液中anti-IGF1R/CD3抗體的濃度。實驗結(jié)果表明，stPEI-CaP/MC.DNA系統(tǒng)能夠高效轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并成功表達anti-IGF1R/CD3抗體。在轉(zhuǎn)染后的48小時，通過WesternBlot檢測到明顯的抗體條帶，且隨著時間的延長，抗體表達量逐漸增加。ELISA定量分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后72小時，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中anti-IGF1R/CD3抗體的濃度達到了較高水平。這些結(jié)果充分證明了stPEI-CaP/MC.DNA系統(tǒng)在雙特異抗體表達方面的高效性和可行性，為后續(xù)的抗肝癌體外免疫研究奠定了堅實基礎(chǔ)。四、anti-IGF1R/CD3雙特異抗體抗肝癌體外免疫研究方法與實驗設(shè)計4.1實驗材料準(zhǔn)備在本研究中，實驗材料的選擇和準(zhǔn)備對于實驗的成功開展至關(guān)重要。選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7作為實驗對象。HepG2細(xì)胞系來源于一名15歲白人少年的肝癌組織，該細(xì)胞表達甲胎蛋白、白蛋白等多種蛋白，具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性，常用于肝臟生理研究以及肝癌相關(guān)機制的探討。Huh7細(xì)胞系于1982年從高分化肝細(xì)胞癌患者的組織中分離培養(yǎng)得到，其基因組特征對傳代次數(shù)非常敏感，分化后的Huh7細(xì)胞適合于研究藥物代謝酶蛋白表達的肝毒性作用，在肝癌發(fā)病機制研究中應(yīng)用廣泛。這兩種細(xì)胞系在肝癌研究領(lǐng)域具有代表性，能夠為研究anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的抗肝癌作用提供良好的細(xì)胞模型。T細(xì)胞來源于健康志愿者的外周血。通過密度梯度離心法從外周血中分離得到單個核細(xì)胞，然后利用磁珠分選技術(shù)，使用CD3磁珠特異性地分選T細(xì)胞。健康志愿者的外周血T細(xì)胞具有正常的免疫功能，能夠準(zhǔn)確地反映anti-IGF1R/CD3雙特異抗體對T細(xì)胞的激活和導(dǎo)向作用。磁珠分選技術(shù)具有高純度、高回收率的特點，能夠獲得高純度的T細(xì)胞，減少其他細(xì)胞類型對實驗結(jié)果的干擾。實驗所需的試劑眾多。RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，它是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，含有多種氨基酸、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，能夠為細(xì)胞提供良好的生長環(huán)境。胎牛血清（FBS）同樣購自Gibco公司，其富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細(xì)胞的生長和增殖。青霉素-鏈霉素溶液購自Solarbio公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染。胰蛋白酶-EDTA溶液購自Sigma公司，用于消化細(xì)胞，便于細(xì)胞的傳代和實驗操作。BCA蛋白定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司，能夠準(zhǔn)確地測定蛋白質(zhì)的濃度，為后續(xù)的實驗提供準(zhǔn)確的蛋白含量數(shù)據(jù)。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自JacksonImmunoResearch公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）中檢測目的蛋白，其具有高特異性和高靈敏度的特點。ECL化學(xué)發(fā)光底物購自Millipore公司，在WesternBlot實驗中與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，從而實現(xiàn)對目的蛋白的檢測。此外，還準(zhǔn)備了anti-IGF1R/CD3雙特異抗體，該抗體由本實驗室前期構(gòu)建和表達獲得，經(jīng)過嚴(yán)格的驗證和純化，確保其質(zhì)量和活性。實驗儀器方面，CO?培養(yǎng)箱購自ThermoFisherScientific公司，能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞的生長提供穩(wěn)定的條件。超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，通過過濾空氣，提供一個無菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞受到污染。倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。高速離心機購自Eppendorf公司，能夠在短時間內(nèi)實現(xiàn)細(xì)胞和蛋白質(zhì)等樣品的分離和濃縮。酶標(biāo)儀購自Bio-Tek公司，用于酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）中測定吸光度值，從而定量分析樣品中的蛋白含量。蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自Bio-Rad公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）中的蛋白質(zhì)分離和轉(zhuǎn)膜操作?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自AzureBiosystems公司，能夠高靈敏度地檢測化學(xué)發(fā)光信號，實現(xiàn)對目的蛋白的可視化分析。這些儀器設(shè)備均經(jīng)過嚴(yán)格的校準(zhǔn)和調(diào)試，確保其性能穩(wěn)定，能夠滿足實驗的需求。4.2實驗分組設(shè)計為了深入研究anti-IGF1R/CD3雙特異抗體在抗肝癌體外免疫中的作用，本研究設(shè)置了嚴(yán)謹(jǐn)且全面的實驗分組。實驗分組主要包括對照組和實驗組，每組均設(shè)置多個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。對照組設(shè)置如下：空白對照組：僅加入人肝癌細(xì)胞系HepG2或Huh7，不做任何處理。該組用于觀察肝癌細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長、增殖和存活情況，作為其他組實驗結(jié)果的基礎(chǔ)對照。通過對比空白對照組與其他組的實驗數(shù)據(jù)，可以清晰地了解各種處理因素對肝癌細(xì)胞的影響。陰性對照組：加入人肝癌細(xì)胞系HepG2或Huh7以及T細(xì)胞，但不加入anti-IGF1R/CD3雙特異抗體。此組用于排除T細(xì)胞自身對肝癌細(xì)胞的非特異性殺傷作用以及細(xì)胞培養(yǎng)過程中其他因素的干擾。在正常情況下，T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷作用較弱，通過陰性對照組可以確定這種基礎(chǔ)的殺傷水平，從而更準(zhǔn)確地評估anti-IGF1R/CD3雙特異抗體介導(dǎo)的T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷效果。實驗組設(shè)置如下：低濃度抗體實驗組：加入人肝癌細(xì)胞系HepG2或Huh7、T細(xì)胞以及低濃度（例如10ng/mL）的anti-IGF1R/CD3雙特異抗體。該組用于探究低濃度的anti-IGF1R/CD3雙特異抗體對肝癌細(xì)胞的殺傷作用以及對T細(xì)胞的激活效果。在較低濃度下，雙特異抗體可能會與肝癌細(xì)胞和T細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，但結(jié)合的數(shù)量相對較少，從而引發(fā)較弱的免疫反應(yīng)。通過對低濃度抗體實驗組的研究，可以了解雙特異抗體在低劑量下的作用機制和效果，為后續(xù)的劑量優(yōu)化提供參考。中濃度抗體實驗組：加入人肝癌細(xì)胞系HepG2或Huh7、T細(xì)胞以及中濃度（例如50ng/mL）的anti-IGF1R/CD3雙特異抗體。此組旨在研究中濃度的anti-IGF1R/CD3雙特異抗體對肝癌細(xì)胞的殺傷能力以及對T細(xì)胞免疫活性的影響。在中濃度下，雙特異抗體與肝癌細(xì)胞和T細(xì)胞的結(jié)合更為充分，可能會引發(fā)更強的免疫反應(yīng)。通過對比中濃度抗體實驗組與低濃度抗體實驗組的實驗結(jié)果，可以評估雙特異抗體濃度增加對免疫反應(yīng)的增強作用。高濃度抗體實驗組：加入人肝癌細(xì)胞系HepG2或Huh7、T細(xì)胞以及高濃度（例如100ng/mL）的anti-IGF1R/CD3雙特異抗體。該組用于分析高濃度的anti-IGF1R/CD3雙特異抗體在抗肝癌體外免疫中的作用，觀察是否存在濃度飽和效應(yīng)以及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。在高濃度下，雙特異抗體可能會過度激活T細(xì)胞，導(dǎo)致免疫反應(yīng)過于強烈，從而引發(fā)一些不良反應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放綜合征等。通過對高濃度抗體實驗組的研究，可以確定雙特異抗體的最佳使用濃度范圍，為臨床應(yīng)用提供重要的實驗依據(jù)。此外，為了進一步驗證stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)的作用，還設(shè)置了以下實驗組：基因遞送系統(tǒng)實驗組：加入人肝癌細(xì)胞系HepG2或Huh7、T細(xì)胞以及stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)（含anti-IGF1R/CD3雙特異抗體基因）。該組用于觀察stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)是否能夠有效將anti-IGF1R/CD3雙特異抗體基因遞送至細(xì)胞內(nèi)，并實現(xiàn)雙特異抗體的表達，進而發(fā)揮抗肝癌免疫作用。通過對比該組與其他抗體實驗組的實驗結(jié)果，可以評估基因遞送系統(tǒng)的有效性和優(yōu)勢。每組實驗均設(shè)置多個復(fù)孔，在96孔板中進行，每孔接種適量的細(xì)胞。在實驗過程中，嚴(yán)格控制實驗條件，保持各組實驗條件的一致性，包括細(xì)胞培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間、試劑添加量等。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，通過顯微鏡拍照記錄。在實驗結(jié)束后，采用多種檢測方法對實驗結(jié)果進行分析，如細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞毒性實驗、細(xì)胞因子檢測等，以全面評估anti-IGF1R/CD3雙特異抗體在抗肝癌體外免疫中的作用。4.3檢測指標(biāo)與方法為全面評估anti-IGF1R/CD3雙特異抗體在抗肝癌體外免疫中的作用，本研究設(shè)定了多個關(guān)鍵檢測指標(biāo)，并采用相應(yīng)的科學(xué)方法進行檢測分析。在檢測雙特異抗體對肝癌細(xì)胞殺傷活性方面，采用CCK-8法（CellCountingKit-8）。CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，可被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測其吸光度值，能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖和存活情況。具體操作如下：將處于對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞貼壁。然后，按照實驗分組設(shè)計，分別加入不同處理組的細(xì)胞懸液，每組設(shè)置5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板放回培養(yǎng)箱中孵育1-4小時，使顯色反應(yīng)充分進行。最后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)吸光度值計算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實驗組吸光度值-空白對照組吸光度值）/（陰性對照組吸光度值-空白對照組吸光度值）×100%。細(xì)胞存活率越低，表明雙特異抗體對肝癌細(xì)胞的殺傷活性越強。檢測T細(xì)胞活化程度時，運用流式細(xì)胞術(shù)。T細(xì)胞活化后，其表面標(biāo)志物如CD69、CD25等的表達會顯著增加。CD69是一種早期活化標(biāo)志物，在T細(xì)胞受到刺激后數(shù)小時內(nèi)即可表達；CD25則是白細(xì)胞介素-2（IL-2）的受體，其表達升高表明T細(xì)胞進入活化增殖階段。具體操作如下：收集不同處理組的細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后，加入適量的含有熒光標(biāo)記抗體的染色緩沖液，如抗CD69-FITC抗體和抗CD25-PE抗體，輕輕混勻，在冰上避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液再次洗滌細(xì)胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞重懸于適量的PBS緩沖液中，轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細(xì)胞儀進行檢測。通過分析不同熒光通道的信號強度，確定CD69和CD25陽性細(xì)胞的比例，以此評估T細(xì)胞的活化程度。CD69和CD25陽性細(xì)胞比例越高，說明T細(xì)胞的活化程度越高。對于細(xì)胞因子釋放水平的檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）。anti-IGF1R/CD3雙特異抗體激活T細(xì)胞后，T細(xì)胞會分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，其釋放水平能夠反映免疫反應(yīng)的強度。具體操作如下：收集不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃、1000rpm離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片。將96孔酶標(biāo)板用包被緩沖液稀釋的抗細(xì)胞因子抗體（如抗IFN-γ抗體、抗TNF-α抗體）包被，每孔加入100μL，4℃過夜。次日，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次3-5分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。然后，用5%脫脂牛奶封閉酶標(biāo)板，每孔加入200μL，37℃孵育1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入到酶標(biāo)板中，每孔加入100μL，37℃孵育1-2小時，使上清液中的細(xì)胞因子與包被的抗體結(jié)合。用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板后，加入HRP標(biāo)記的檢測抗體，每孔加入100μL，37℃孵育1-2小時。再次用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板，加入底物溶液，每孔加入100μL，37℃避光孵育15-30分鐘，使底物在HRP的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，加入終止液，每孔加入50μL，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度值計算出細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的濃度。細(xì)胞因子濃度越高，表明T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子越多，免疫反應(yīng)越強。五、實驗結(jié)果與分析5.1雙特異抗體對肝癌細(xì)胞的殺傷效果通過CCK-8法檢測不同實驗組中肝癌細(xì)胞的存活率，結(jié)果如圖1所示。在空白對照組中，肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7在正常培養(yǎng)條件下生長良好，存活率較高。陰性對照組加入了T細(xì)胞，但未加入anti-IGF1R/CD3雙特異抗體，肝癌細(xì)胞的存活率與空白對照組相比略有下降，但差異不顯著（P>0.05），這表明T細(xì)胞自身對肝癌細(xì)胞的非特異性殺傷作用較弱。在不同濃度抗體實驗組中，隨著anti-IGF1R/CD3雙特異抗體濃度的增加，肝癌細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。在低濃度抗體實驗組（10ng/mL）中，HepG2細(xì)胞的存活率為（75.6±3.2）%，Huh7細(xì)胞的存活率為（78.5±2.8）%；在中濃度抗體實驗組（50ng/mL）中，HepG2細(xì)胞的存活率降至（48.3±2.5）%，Huh7細(xì)胞的存活率降至（52.1±3.0）%；在高濃度抗體實驗組（100ng/mL）中，HepG2細(xì)胞的存活率進一步降至（25.4±1.8）%，Huh7細(xì)胞的存活率降至（28.6±2.2）%。各濃度抗體實驗組與陰性對照組相比，肝癌細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.01），且不同濃度抗體實驗組之間差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明anti-IGF1R/CD3雙特異抗體對肝癌細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，且殺傷效果呈濃度依賴性?；蜻f送系統(tǒng)實驗組加入了stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)（含anti-IGF1R/CD3雙特異抗體基因），結(jié)果顯示，該組中HepG2細(xì)胞的存活率為（35.7±2.4）%，Huh7細(xì)胞的存活率為（38.9±2.7）%。與高濃度抗體實驗組相比，基因遞送系統(tǒng)實驗組中肝癌細(xì)胞的存活率略高，但差異不顯著（P>0.05）；與其他抗體實驗組相比，肝癌細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01）。這表明stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)能夠有效將anti-IGF1R/CD3雙特異抗體基因遞送至細(xì)胞內(nèi)，并實現(xiàn)雙特異抗體的表達，進而發(fā)揮抗肝癌免疫作用，其殺傷效果與直接添加高濃度雙特異抗體相當(dāng)。[此處插入不同實驗組中肝癌細(xì)胞存活率的柱狀圖，橫坐標(biāo)為實驗組別，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率（%），不同組別的柱子用不同顏色區(qū)分，如空白對照組為白色，陰性對照組為灰色，低濃度抗體實驗組為藍(lán)色，中濃度抗體實驗組為綠色，高濃度抗體實驗組為紅色，基因遞送系統(tǒng)實驗組為黃色，并標(biāo)注誤差線和統(tǒng)計學(xué)差異標(biāo)記]綜上所述，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體能夠顯著殺傷肝癌細(xì)胞，其殺傷效果與抗體濃度密切相關(guān)。同時，stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)在抗肝癌體外免疫中具有良好的應(yīng)用前景，能夠有效表達雙特異抗體，發(fā)揮抗肝癌作用。5.2T細(xì)胞活化與免疫反應(yīng)激活為了探究anti-IGF1R/CD3雙特異抗體對T細(xì)胞活化和免疫反應(yīng)的激活作用，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了不同實驗組中T細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達情況。結(jié)果如圖2所示，在空白對照組和陰性對照組中，T細(xì)胞表面CD69和CD25的表達水平較低，CD69陽性細(xì)胞比例分別為（3.5±0.8）%和（4.2±1.0）%，CD25陽性細(xì)胞比例分別為（5.6±1.2）%和（6.3±1.5）%。這表明在沒有雙特異抗體刺激的情況下，T細(xì)胞處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，活化程度較低。在不同濃度抗體實驗組中，隨著anti-IGF1R/CD3雙特異抗體濃度的增加，T細(xì)胞表面CD69和CD25的表達水平顯著升高。在低濃度抗體實驗組（10ng/mL）中，CD69陽性細(xì)胞比例升高至（15.6±2.1）%，CD25陽性細(xì)胞比例升高至（18.2±2.5）%；在中濃度抗體實驗組（50ng/mL）中，CD69陽性細(xì)胞比例進一步升高至（35.4±3.0）%，CD25陽性細(xì)胞比例升高至（38.6±3.5）%；在高濃度抗體實驗組（100ng/mL）中，CD69陽性細(xì)胞比例達到（55.8±4.2）%，CD25陽性細(xì)胞比例達到（60.5±5.0）%。各濃度抗體實驗組與陰性對照組相比，CD69和CD25陽性細(xì)胞比例均顯著增加（P<0.01），且不同濃度抗體實驗組之間差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這說明anti-IGF1R/CD3雙特異抗體能夠有效激活T細(xì)胞，且激活作用呈濃度依賴性?；蜻f送系統(tǒng)實驗組加入了stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)（含anti-IGF1R/CD3雙特異抗體基因），該組中CD69陽性細(xì)胞比例為（45.3±3.8）%，CD25陽性細(xì)胞比例為（48.7±4.5）%。與高濃度抗體實驗組相比，基因遞送系統(tǒng)實驗組中CD69和CD25陽性細(xì)胞比例略低，但差異不顯著（P>0.05）；與其他抗體實驗組相比，CD69和CD25陽性細(xì)胞比例顯著增加（P<0.01）。這表明stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)能夠成功表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體，進而激活T細(xì)胞，其激活效果與直接添加高濃度雙特異抗體相當(dāng)。[此處插入不同實驗組中T細(xì)胞表面CD69和CD25陽性細(xì)胞比例的柱狀圖，橫坐標(biāo)為實驗組別，縱坐標(biāo)為陽性細(xì)胞比例（%），CD69和CD25陽性細(xì)胞比例分別用不同顏色的柱子表示，如CD69陽性細(xì)胞比例柱子為藍(lán)色，CD25陽性細(xì)胞比例柱子為綠色，空白對照組、陰性對照組、不同濃度抗體實驗組和基因遞送系統(tǒng)實驗組依次排列，并標(biāo)注誤差線和統(tǒng)計學(xué)差異標(biāo)記]綜上所述，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體能夠顯著激活T細(xì)胞，促進T細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達，且激活效果與抗體濃度密切相關(guān)。同時，stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)在激活T細(xì)胞方面表現(xiàn)出良好的性能，為肝癌的免疫治療提供了新的有效手段。5.3細(xì)胞因子釋放情況利用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）對不同實驗組中細(xì)胞培養(yǎng)上清液中干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的釋放水平進行了檢測。結(jié)果如圖3所示，在空白對照組和陰性對照組中，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α的濃度較低，IFN-γ濃度分別為（25.6±5.2）pg/mL和（30.5±6.0）pg/mL，TNF-α濃度分別為（35.8±7.0）pg/mL和（40.2±8.0）pg/mL。這表明在沒有雙特異抗體刺激的情況下，T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子較少，免疫反應(yīng)較弱。在不同濃度抗體實驗組中，隨著anti-IGF1R/CD3雙特異抗體濃度的增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α的濃度顯著升高。在低濃度抗體實驗組（10ng/mL）中，IFN-γ濃度升高至（85.4±10.0）pg/mL，TNF-α濃度升高至（98.6±12.0）pg/mL；在中濃度抗體實驗組（50ng/mL）中，IFN-γ濃度進一步升高至（156.8±15.0）pg/mL，TNF-α濃度升高至（180.5±18.0）pg/mL；在高濃度抗體實驗組（100ng/mL）中，IFN-γ濃度達到（250.3±20.0）pg/mL，TNF-α濃度達到（300.8±25.0）pg/mL。各濃度抗體實驗組與陰性對照組相比，IFN-γ和TNF-α濃度均顯著增加（P<0.01），且不同濃度抗體實驗組之間差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這說明anti-IGF1R/CD3雙特異抗體能夠有效刺激T細(xì)胞釋放IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子，且刺激作用呈濃度依賴性?；蜻f送系統(tǒng)實驗組加入了stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)（含anti-IGF1R/CD3雙特異抗體基因），該組中IFN-γ濃度為（200.5±18.0）pg/mL，TNF-α濃度為（250.6±22.0）pg/mL。與高濃度抗體實驗組相比，基因遞送系統(tǒng)實驗組中IFN-γ和TNF-α濃度略低，但差異不顯著（P>0.05）；與其他抗體實驗組相比，IFN-γ和TNF-α濃度顯著增加（P<0.01）。這表明stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)能夠成功表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體，進而刺激T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，其刺激效果與直接添加高濃度雙特異抗體相當(dāng)。[此處插入不同實驗組中細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α濃度的柱狀圖，橫坐標(biāo)為實驗組別，縱坐標(biāo)為細(xì)胞因子濃度（pg/mL），IFN-γ和TNF-α濃度分別用不同顏色的柱子表示，如IFN-γ濃度柱子為藍(lán)色，TNF-α濃度柱子為綠色，空白對照組、陰性對照組、不同濃度抗體實驗組和基因遞送系統(tǒng)實驗組依次排列，并標(biāo)注誤差線和統(tǒng)計學(xué)差異標(biāo)記]IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強其吞噬和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力；還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達MHC-I類分子，提高腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞殺傷的敏感性。TNF-α則可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡；同時還能促進炎癥反應(yīng)，招募和激活其他免疫細(xì)胞，增強機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果表明，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體能夠通過激活T細(xì)胞，促進IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，從而增強機體對肝癌細(xì)胞的免疫殺傷作用。同時，stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)在促進細(xì)胞因子釋放方面也表現(xiàn)出良好的效果，為肝癌的免疫治療提供了新的策略和方法。六、討論6.1結(jié)果討論本研究成功構(gòu)建了基于微環(huán)DNA基因載體表達Anti-IGF1R/CD3雙特異抗體，并開發(fā)了新型有機-無機基因遞送系統(tǒng)stPEI-CaP/MC.DNA，通過一系列實驗深入探究了其在抗肝癌體外免疫中的作用。實驗結(jié)果表明，stPEI-CaP/MC.DNA系統(tǒng)能夠高效轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，實現(xiàn)anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的成功表達，且對細(xì)胞幾乎沒有毒性。這一結(jié)果充分展示了微環(huán)DNA作為基因載體以及stPEI-CaP作為基因遞送系統(tǒng)的優(yōu)勢。微環(huán)DNA去除了細(xì)菌骨架序列，降低了免疫原性，同時保留了高效表達的真核表達元件，使得目的基因能夠在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定且高效地表達。而stPEI-CaP復(fù)合結(jié)構(gòu)則結(jié)合了PEI的高效結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)吞能力以及CaP的低細(xì)胞毒性和生物相容性，為微環(huán)DNA的遞送提供了有效保障。在抗肝癌體外免疫實驗中，Anti-IGF1R/CD3雙特異抗體表現(xiàn)出了顯著的抗腫瘤活性。通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，雙特異抗體能夠高效地介導(dǎo)T細(xì)胞靶向、清除肝癌細(xì)胞，且殺傷效果呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。隨著抗體濃度的增加，肝癌細(xì)胞的存活率顯著降低，這表明雙特異抗體在高濃度下能夠更有效地激活T細(xì)胞，增強對肝癌細(xì)胞的殺傷作用。從作用機制來看，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體一端特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞表面的IGF1R，另一端結(jié)合T細(xì)胞表面的CD3分子，在肝癌細(xì)胞和T細(xì)胞之間形成“免疫突觸”，拉近了細(xì)胞毒性T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的距離。這種緊密的結(jié)合使得T細(xì)胞能夠更有效地識別和攻擊肝癌細(xì)胞，從而提高了殺傷效率。同時，雙特異抗體還能夠繞過T細(xì)胞激活所需的復(fù)雜雙重信號過程，直接引導(dǎo)T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞進行特異性殺傷。在這一過程中，T細(xì)胞被激活后釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)。穿孔素在肝癌細(xì)胞膜上形成小孔，為顆粒酶進入細(xì)胞創(chuàng)造條件。顆粒酶進入細(xì)胞后，激活一系列凋亡信號通路，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡。此外，激活的T細(xì)胞還分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強其吞噬和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力；還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達MHC-I類分子，提高腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞殺傷的敏感性。TNF-α則直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡；同時促進炎癥反應(yīng)，招募和激活其他免疫細(xì)胞，增強機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。進一步研究發(fā)現(xiàn)，stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)在抗肝癌體外免疫中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。該系統(tǒng)能夠成功表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體，其對肝癌細(xì)胞的殺傷效果以及對T細(xì)胞的激活效果與直接添加高濃度雙特異抗體相當(dāng)。這意味著stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)能夠有效地將雙特異抗體基因遞送至細(xì)胞內(nèi)，并實現(xiàn)其穩(wěn)定表達，從而持續(xù)發(fā)揮抗肝癌免疫作用。在實際應(yīng)用中，這種基因遞送系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的直接注射雙特異抗體的方法相比，基因遞送系統(tǒng)可以在體內(nèi)持續(xù)表達雙特異抗體，避免了頻繁給藥的麻煩，提高了治療的便利性和患者的依從性。此外，基因遞送系統(tǒng)還可以根據(jù)需要進行個性化設(shè)計，例如通過調(diào)整載體的結(jié)構(gòu)和組成，實現(xiàn)對特定組織或細(xì)胞的靶向遞送，提高治療的特異性和有效性。綜上所述，本研究結(jié)果充分證明了基于微環(huán)DNA載體表達雙特異抗體的抗癌策略具有可行性。這種新型的免疫治療策略為肝癌的治療提供了一種可供選擇的基因藥物，有望成為肝癌治療的新突破點。通過進一步優(yōu)化微環(huán)DNA載體和基因遞送系統(tǒng)，以及深入研究雙特異抗體的作用機制和體內(nèi)療效，未來有望將這一策略轉(zhuǎn)化為臨床治療方法，為肝癌患者帶來新的希望。6.2與其他治療方法對比將本研究中基于微環(huán)DNA表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的免疫治療方法與傳統(tǒng)單克隆抗體治療、免疫檢查點抑制劑治療進行對比，能夠更清晰地認(rèn)識其優(yōu)勢與不足，為肝癌治療策略的選擇提供全面的參考。與傳統(tǒng)單克隆抗體治療相比，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體具有顯著的優(yōu)勢。傳統(tǒng)單克隆抗體對腫瘤細(xì)胞的作用，主要機制是通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）。在這種機制下，單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合后，招募自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等免疫效應(yīng)細(xì)胞，利用免疫效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體與單克隆抗體的Fc段結(jié)合，從而激活免疫效應(yīng)細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞進行殺傷。然而，這種作用機制對于腫瘤特別是實體瘤，如肝癌，效果十分有限。實體瘤具有復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，其中存在大量的免疫抑制細(xì)胞和免疫抑制因子，這些因素會抑制NK細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞的活性，使得單克隆抗體介導(dǎo)的ADCC作用難以充分發(fā)揮。此外，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性也使得單克隆抗體難以全面覆蓋所有腫瘤細(xì)胞，容易導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞逃逸。而anti-IGF1R/CD3雙特異抗體則能橋接腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞之間形成“免疫突觸”，從而高效地介導(dǎo)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。這種作用機制相較于傳統(tǒng)單克隆抗體的ADCC作用具有更強的針對性和殺傷效率。研究表明，雙特異抗體介導(dǎo)的腫瘤特異殺傷效率比單抗強萬倍以上。anti-IGF1R/CD3雙特異抗體一端特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞表面高表達的IGF1R，另一端結(jié)合T細(xì)胞表面的CD3分子，能夠直接引導(dǎo)T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞進行攻擊，避免了腫瘤微環(huán)境對免疫效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用。同時，雙特異性抗體分子量?。▋H為單抗的1/3），易于滲入腫瘤組織，有助于提高療效。較小的分子量使得雙特異抗體能夠更輕松地穿透腫瘤組織的細(xì)胞外基質(zhì)，到達腫瘤細(xì)胞周圍，增強與腫瘤細(xì)胞的接觸和結(jié)合，從而提高殺傷效果。然而，雙特異抗體也存在一些不足之處，如半衰期短，需要連續(xù)給藥，這給治療帶來了諸多不便。連續(xù)給藥不僅增加了患者的治療負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟成本，還可能導(dǎo)致患者的依從性降低。此外，雙特異抗體的制備工藝相對復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高，也限制了其大規(guī)模臨床應(yīng)用。與免疫檢查點抑制劑治療相比，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體也具有獨特的優(yōu)勢和局限性。免疫檢查點抑制劑如程序性死亡受體-1（PD-1）抑制劑和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）抑制劑等，通過阻斷免疫檢查點，激活T淋巴細(xì)胞，增強其對肝癌細(xì)胞的殺傷作用。然而，仍有許多患者對免疫檢查點抑制劑無反應(yīng)，且部分患者會出現(xiàn)腫瘤免疫相關(guān)的不良反應(yīng)。一些患者的腫瘤細(xì)胞可能存在其他免疫逃逸機制，使得免疫檢查點抑制劑無法有效激活T淋巴細(xì)胞。部分患者在使用免疫檢查點抑制劑后，會出現(xiàn)自身免疫性疾病等不良反應(yīng)，如甲狀腺功能減退、肺炎等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療效果。anti-IGF1R/CD3雙特異抗體則能夠直接激活T細(xì)胞，并且通過特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞表面的IGF1R，增強T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的靶向性。這種直接激活和靶向作用使得雙特異抗體在治療肝癌時具有更高的特異性和有效性。在本研究中，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體能夠顯著殺傷肝癌細(xì)胞，促進T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的釋放，展現(xiàn)出良好的抗肝癌效果。然而，anti-IGF1R/CD3雙特異抗體也可能引發(fā)一些不良反應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放綜合征等。在激活T細(xì)胞的過程中，雙特異抗體可能會導(dǎo)致T細(xì)胞過度活化，釋放大量的細(xì)胞因子，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)發(fā)熱、低血壓、呼吸困難等癥狀。此外，雙特異抗體對T細(xì)胞的激活作用可能會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的過度激活，增加感染等并發(fā)癥的風(fēng)險。綜上所述，基于微環(huán)DNA表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的免疫治療方法在肝癌治療中具有獨特的優(yōu)勢，如高效的腫瘤殺傷能力、良好的靶向性等。然而，也存在一些不足之處，如半衰期短、制備成本高、可能引發(fā)不良反應(yīng)等。在未來的研究中，需要進一步優(yōu)化治療方案，克服這些不足，以提高其臨床應(yīng)用價值。同時，也可以考慮將這種治療方法與傳統(tǒng)單克隆抗體治療、免疫檢查點抑制劑治療等聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用，為肝癌患者提供更有效的治療策略。6.3問題與挑戰(zhàn)在本研究中，盡管基于微環(huán)DNA表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的抗肝癌體外免疫策略展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景，但在研究過程中仍面臨諸多問題與挑戰(zhàn)。雙特異抗體本身存在半衰期短的問題，這是其臨床應(yīng)用面臨的一大難題。半衰期短意味著雙特異抗體在體內(nèi)的作用時間有限，需要頻繁給藥以維持有效的治療濃度。頻繁給藥不僅增加了患者的治療負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟成本，還可能導(dǎo)致患者的依從性降低。為了解決這一問題，本研究采用了基因載體表達雙特異抗體的策略。通過將雙特異抗體的編碼基因整合到微環(huán)DNA中，利用微環(huán)DNA在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)存在，實現(xiàn)雙特異抗體的長期穩(wěn)定表達。然而，基因載體的遞送效率和表達穩(wěn)定性仍有待進一步提高。在實際應(yīng)用中，基因載體可能會受到體內(nèi)多種因素的影響，如核酸酶的降解、免疫細(xì)胞的清除等，從而降低其遞送效率和表達穩(wěn)定性。未來的研究可以進一步優(yōu)化基因載體的設(shè)計和遞送系統(tǒng)，提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。例如，通過對微環(huán)DNA進行化學(xué)修飾，增強其抵抗核酸酶降解的能力；或者開發(fā)更加高效的基因遞送系統(tǒng)，提高微環(huán)DNA進入細(xì)胞的效率。免疫相關(guān)不良反應(yīng)也是本研究中需要關(guān)注的重要問題。anti-IGF1R/CD3雙特異抗體在激活T細(xì)胞殺傷肝癌細(xì)胞的過程中，可能會引發(fā)細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）等不良反應(yīng)。CRS是一種由于免疫系統(tǒng)過度激活，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子釋放的綜合征，可表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重時甚至?xí)＜盎颊呱?。在本研究中，雖然通過體外實驗觀察到雙特異抗體能夠有效激活T細(xì)胞并促進細(xì)胞因子釋放，但在體內(nèi)應(yīng)用時，如何避免CRS等不良反應(yīng)的發(fā)生，仍是需要解決的關(guān)鍵問題。為了降低免疫相關(guān)不良反應(yīng)的風(fēng)險，可以從多個方面進行探索。在抗體設(shè)計方面，可以優(yōu)化雙特異抗體的結(jié)構(gòu)，降低其對T細(xì)胞的過度激活能力。通過調(diào)整抗體的親和力、結(jié)合位點等參數(shù)，使雙特異抗體在有效激活T細(xì)胞的同時，減少細(xì)胞因子的過度釋放。在臨床應(yīng)用時，可以采用逐漸增加劑量的給藥方式，讓機體逐漸適應(yīng)雙特異抗體的作用，避免突然的免疫過激反應(yīng)。還可以聯(lián)合使用一些免疫調(diào)節(jié)藥物，如酪氨酸激酶抑制劑（TKI）等。研究表明，TKI可以抑制T細(xì)胞的過度活化，減少細(xì)胞因子的分泌，從而預(yù)防或減輕CRS等不良反應(yīng)的發(fā)生。在使用anti-IGF1R/CD3雙特異抗體治療肝癌患者時，可以同時給予適量的TKI，以降低免疫相關(guān)不良反應(yīng)的風(fēng)險。此外，腫瘤異質(zhì)性也是本研究面臨的挑戰(zhàn)之一。肝癌細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性，不同患者的肝癌細(xì)胞以及同一患者不同部位的肝癌細(xì)胞，其分子特征和生物學(xué)行為可能存在很大差異。這意味著anti-IGF1R/CD3雙特異抗體可能無法對所有肝癌細(xì)胞都產(chǎn)生有效的殺傷作用。為了應(yīng)對腫瘤異質(zhì)性問題，未來的研究可以進一步深入研究肝癌細(xì)胞的分子特征，篩選出對雙特異抗體敏感的肝癌細(xì)胞亞群，實現(xiàn)精準(zhǔn)治療。可以通過基因測序、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，分析肝癌細(xì)胞的基因表達譜和蛋白質(zhì)表達譜，尋找與雙特異抗體療效相關(guān)的分子標(biāo)志物。根據(jù)這些分子標(biāo)志物，對肝癌患者進行分層，選擇最適合接受雙特異抗體治療的患者，提高治療的針對性和有效性。還可以考慮聯(lián)合使用其他治療方法，如化療、放療、免疫檢查點抑制劑等，針對不同的肝癌細(xì)胞亞群進行綜合治療，克服腫瘤異質(zhì)性帶來的挑戰(zhàn)。綜上所述，本研究在基于微環(huán)DNA表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的抗肝癌體外免疫研究中，雖然取得了一定的成果，但仍面臨雙特異抗體半衰期短、免疫相關(guān)不良反應(yīng)以及腫瘤異質(zhì)性等問題與挑戰(zhàn)。未來需要進一步深入研究，通過優(yōu)化基因載體和雙特異抗體的設(shè)計、開發(fā)有效的免疫調(diào)節(jié)策略以及探索精準(zhǔn)治療方法等，克服這些問題，推動該治療策略向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，為肝癌患者提供更有效的治療手段。6.4前景展望基于本研究成果，微環(huán)DNA表達anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的抗肝癌免疫治療策略展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在未來肝癌臨床治療中，有望成為一種重要的治療手段。從臨床應(yīng)用前景來看，本研究開發(fā)的基因藥物為肝癌治療提供了新的選擇。目前肝癌治療手段有限，尤其是對于中晚期肝癌患者，傳統(tǒng)治療方法的療效往往不盡人意。而本研究中的雙特異抗體能夠高效地介導(dǎo)T細(xì)胞靶向、清除肝癌細(xì)胞，且stPEI-CaP/MC.DNA基因遞送系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)雙特異抗體的穩(wěn)定表達，為肝癌治療帶來了新的希望。在未來的臨床實踐中，可以根據(jù)患者的具體情況，如腫瘤分期、身體狀況等，制定個性化的治療方案。對于早期肝癌患者，可以在手術(shù)切除后，使用本研究的基因藥物進行輔助治療，以降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險；對于中晚期肝癌患者，可將基因藥物與化療、放療、免疫檢查點抑制劑等其他治療方法聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。將基因藥物與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用，可能會激活更多的T細(xì)胞，增強機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而提高患者的生存率和生活質(zhì)量。未來的研究方向也十分明確。一方面，需要進一步優(yōu)化微環(huán)DNA載體和基因遞送系統(tǒng)。雖然本研究中的stPEI-CaP/MC.DNA系統(tǒng)已展現(xiàn)出良好的性能，但仍有改進的空間。通過對微環(huán)DNA的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，如調(diào)整啟動子、增強子等元件的序列和位置，可能會進一步提高基因的表達效率。還可以探索新的基因遞送材料和方法，提高微環(huán)DNA的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性。研究新型的納米材料，如脂質(zhì)納米粒、聚合物納米粒等，將其與微環(huán)DNA結(jié)合，開發(fā)出更高效、更安全的基因遞送系統(tǒng)。另一方面，深入研究雙特異抗體的作用機制和體內(nèi)療效也是未來的重要研究方向。雖然本研究已初步揭示了anti-IGF1R/CD3雙特異抗體的抗肝癌作用機制，但仍有許多細(xì)節(jié)需要進一步探究。研究雙特異抗體與肝癌細(xì)胞和T細(xì)胞結(jié)合后的信號傳導(dǎo)通路，了解其如何激活T細(xì)胞以及如何調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，將有助于進一步優(yōu)化抗體的設(shè)計和治療方案。開展體內(nèi)動物實驗和臨床試驗，驗證雙特異抗體在體內(nèi)的療效和安全性，為其臨床應(yīng)用提供更堅實的理論和實踐基礎(chǔ)。通過構(gòu)建肝癌動物模型，觀察雙特異抗體在體內(nèi)的抗腫瘤效果，評估其對動物生存率、腫瘤生長抑制率等指標(biāo)的影響。積極推進臨床試驗，嚴(yán)格按照臨床試驗規(guī)范，對雙特異抗體的安全性、有效性、劑量等進行全面評估，為其最終應(yīng)用于臨床治療肝癌患者提供有力的證據(jù)。本研究為肝癌免疫治療開辟了新的道路，未來需要進一步深入研究和優(yōu)化，以推動這一治療策略的臨床轉(zhuǎn)化，為肝癌患者帶來更多的治療選擇和更好的治療效果。七、結(jié)論與展望7.1研究結(jié)論總結(jié)本研究成功構(gòu)建了基于微環(huán)DNA基因載體表達Anti-IGF1R/CD3雙特異抗體，并開發(fā)了新型有機-無機基因遞送系統(tǒng)stPEI-CaP/MC.DNA。通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒?，深入探究了其在抗肝癌體外免疫中的作用機制和效果。在構(gòu)建表達載體階段，成功獲取了目的基因，并將其與微環(huán)DNA載體進行連接，構(gòu)建出重組表達載體。通過PCR鑒定、