鉛鋅礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物根際土促生菌的分離、篩選及鑒定研究ISOLATION,SCREENINGANDIDENTIFICATIONOFPLANTGROWTHPROMOTINGRHIZOBACTERIAFROMDOMINANTPLANTSINLEAD-ZINCMININGAREATOC\o"1-3"\h\u2201摘要 鉛鋅礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物根際土促生菌的分離、篩選及鑒定研究學(xué)生：劉爽指導(dǎo)老師：肖云花(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128)摘□要：目前我國(guó)耕地重金屬污染嚴(yán)重，影響糧食品質(zhì)，進(jìn)而會(huì)危害人體健康，耕地土壤重金屬修復(fù)迫在眉睫。微生物-植物協(xié)同修復(fù)重金屬因?yàn)槠渚G色友好的修復(fù)特點(diǎn)受到廣大研究者的重視。其中，高效的植物促生菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，強(qiáng)化植物富集重金屬的能力，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)從湖南省花垣縣鉛鋅礦區(qū)采集了五種優(yōu)勢(shì)植物的根際土，從中分離純化得到22株細(xì)菌，并對(duì)它們依次進(jìn)行分泌吲哚乙酸（IAA）、產(chǎn)ACC脫氨酶活性、產(chǎn)鐵載體、溶磷、固氮、解鉀等促生能力測(cè)定，復(fù)篩出具有高效促生作用的菌株，包括MS3、PS3、ZS1、ZS3、ZS4、TS8，經(jīng)分子鑒定，MS3，PS3為Serratiamarcescens，ZS4，ZS1，TS8是Klebsiellaoxytoca，ZS3是Bacterium屬。其中，TS8的促生效能最強(qiáng)。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)可以對(duì)細(xì)菌促生作用加深了解以及為生物修復(fù)提供新的思路。關(guān)鍵詞：鉛鋅礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物；根際促生細(xì)菌；吲哚乙酸；ACC脫氨酶；鐵載體；溶磷；固氮；解鉀Isolation,

Screening

and

Identification

of

plantgrowthpromotingrhizobacteria

from

dominantplantsinlead-zincminingareaStudent:LiuShuangTutor:XiaoYunhua(CollegeofBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China)Abstract:Nowadays,Chinaisfullofcultivatedlandpollutedbyheavymetals,andthequalityoffoodhasbecomeworse,leadingtotheweakeningofhumanbody.Asagreenandfriendlymeansofremediation,themicrobial-plantcooperativeremediationofheavymetalshasattractedtheattentionofmanyresearchers.Amongthem,highlyeffectiveplantprobioticbacteriacanpromoteplantgrowth,strengthenplantenrichmentofheavymetals,soastoachieveheavymetalpollutionremediation.Thisexperimentthroughcountylead-zincmineareawascollectedfromHunanprovinceandfiveadvantageplantrhizospheresoil,whichscored22strainsofbacteria,isolationandpurificationofsecretionandtheyinturnareindoleaceticacid(IAA),produceACCdeaminaseactivity,producingironcarrier,solublephosphorus,nitrogenfixation,theabilitytodeterminethegrowth,suchasbetweencompoundsieveoutaneffectiveroleinthegrowthofstrains,includingMS3,PS3,ZS1,theZS3,ZS4,TS8,viamolecularappraisal,MS3,PS3(identificationtospecies)isaSerratiamarcescens,ZS4,ZS1,TS8isKlebsiellaoxytoca,andZS3isBacterium.Amongthem,theeffectofTS8canbethestrongest.Throughthisexperiment,wecanstrengthenthecomprehensionofthegrowth-promotinginfluenceofbacteriaandaffordnewideasformicrobialrepair.

Keywords:dominantplantsoflead-zincminingarea；Plantrhizospherebacteria；indoleaceticacid；ACCdeaminase；siderophore；phosphorussolubilizing；nitrogenaseactivity；dissolvepotassium1前言1.1重金屬污染的嚴(yán)重性類(lèi)似于Cd、Pb等含有嚴(yán)重毒性且不能被降解的重金屬，會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)換形態(tài)、分離或者富集繼續(xù)存在。為了推動(dòng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和獲取能源，礦產(chǎn)資源和化石燃料一直處在被開(kāi)采的狀態(tài)，而且在農(nóng)業(yè)方面農(nóng)民為了方便高效，濫用農(nóng)藥和化肥。，使得生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，土壤重金屬污染尤為嚴(yán)重。土壤重金屬污染具有隱蔽性，不可逆性，長(zhǎng)期性和危害大的特點(diǎn)[1]。它會(huì)使得農(nóng)作物生長(zhǎng)緩慢，減少其產(chǎn)量，甚至有毒重金屬會(huì)積累在作物中被送上餐桌，進(jìn)入人體，在體內(nèi)囤積，有些重金屬會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)能甚至致癌。不僅如此，它對(duì)生態(tài)環(huán)境，耕地質(zhì)量和糧食安全，社會(huì)發(fā)展等都是極其不利的因素[2]。所以修復(fù)土壤重金屬污染迫在眉睫。為了尋找經(jīng)濟(jì)綠色且不會(huì)造成二次污染的修復(fù)方法，研究者們做了很多的研究，結(jié)果探究到生存在重金屬污染土壤中的PGPR有些不僅對(duì)植物有良好的促生性能，而且自身具備多種重金屬耐性，甚至可以幫助植物修復(fù)污染土壤。因此植物——微生物聯(lián)合修復(fù)成為土壤重金屬修復(fù)的熱門(mén)研究[3]。1.2礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物的生物特性和土壤修復(fù)價(jià)值礦區(qū)會(huì)有很大程度重金屬污染，植物的生長(zhǎng)條件相對(duì)惡劣，生長(zhǎng)發(fā)育勢(shì)必受到影響。。因此在礦區(qū)生長(zhǎng)的植物抗環(huán)境脅迫能力強(qiáng)，生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單，多是草本植物。在長(zhǎng)期的自然選擇下，礦區(qū)生長(zhǎng)占優(yōu)勢(shì)的植物會(huì)產(chǎn)生對(duì)重金屬毒害的防衛(wèi)機(jī)制，其中有些優(yōu)勢(shì)植物對(duì)重金屬具有一定耐性，同時(shí)具有吸收富集污染土壤中的重金屬能力，它們就可以作為植物修復(fù)的資源。由于不同植物對(duì)重金屬吸收和富集方式不同，可以概括為三種分別是是富集型植物、根囤積植物和規(guī)避型植物。富集型植物吸收重金屬能力很強(qiáng)，它們會(huì)把植物根吸收的重金屬向上轉(zhuǎn)移，積累在植物地上部分。。根囤積型植物同樣可以吸收大量重金屬，但是都儲(chǔ)存在根部，不會(huì)向上轉(zhuǎn)移。規(guī)避型植物在高濃度重金屬地區(qū)生長(zhǎng)，只能少量吸收重金屬[4]。富集型植物和根囤積型植物對(duì)土壤修復(fù)效果更好。其中，修復(fù)能力較為突出的優(yōu)勢(shì)植物有芒草、東南景天、金絲草等。芒草生長(zhǎng)快且生物量大，適應(yīng)性極強(qiáng)，能夠適應(yīng)各種氣候和土壤環(huán)境，在正常的土壤下不要肥料也能生長(zhǎng)，生命力旺盛。它的水分利用率和光合效率明顯高于其他作物[5-7]。芒草同時(shí)也具有較強(qiáng)的重金屬耐性，所以它們?cè)谛迯?fù)重金屬污染土壤方面也是強(qiáng)于其他植物。在2002年的時(shí)候就有關(guān)于野外芒草對(duì)重金屬耐性的報(bào)道。，韋朝陽(yáng)[8]等通過(guò)對(duì)兩個(gè)中國(guó)典型砷礦區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國(guó)芒對(duì)砷具有極強(qiáng)的耐性，其地上部砷的累積可達(dá)760mg/kg。據(jù)統(tǒng)計(jì)，芒草以其適應(yīng)性強(qiáng)和耐重金屬的優(yōu)勢(shì)在我國(guó)二十多個(gè)礦區(qū)頑強(qiáng)生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，芒屬植物不管是應(yīng)對(duì)單一重金屬還是多種重金屬的高濃度脅迫環(huán)境，都能表現(xiàn)出很好的耐性。，但是不同的芒屬植物的耐性存在差異，五節(jié)芒在Cd含量為320mg/kg礦區(qū)土壤上仍可以正常生長(zhǎng)，荻卻不可以[9]。東南景天是一類(lèi)重金屬超積累植物，對(duì)土壤中的鎘具有良好的修復(fù)能力。Xiong等人比較了礦區(qū)和非礦區(qū)生長(zhǎng)的東南景天對(duì)土壤中鎘修復(fù)性能的區(qū)別。礦區(qū)東南景天所能夠承受的最大鎘濃度為非礦區(qū)東南景天的四倍[10]。東南景天同時(shí)也能超富集鋅，對(duì)礦區(qū)土壤高濃度鋅表現(xiàn)出良好的耐性。金絲草（Pogonatherumcrinitum）是多年草本生植物，它也是一種超富集植物，在鉛鋅礦區(qū)超富集鉛。它可以在土壤Pb含量小于20000mg/kg的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，對(duì)Pb有強(qiáng)的耐性和富集能力[11]。它們這些植物在植物修復(fù)上有廣泛的應(yīng)用前景。并且研究表明礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物耐重金屬的原因大多是根系代謝能力強(qiáng)，具有較強(qiáng)抗氧化和光合作用能力并且根際存在多種有益微生物[12]。所以為了能更好地了解植物耐重金屬特性以及更好地利用其修復(fù)重金屬土壤，研究礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物根際土促生菌是很有價(jià)值的。本實(shí)驗(yàn)選取的材料是湖南花垣縣鉛鋅礦區(qū)的五種優(yōu)勢(shì)植物，分別是五節(jié)芒、艾草、婆婆納、唐菖蒲、苧麻。花垣縣資源豐富，有二十多種礦產(chǎn)，鉛鋅礦儲(chǔ)量在湖南甚至全國(guó)都是排在前列。它被譽(yù)為“有色金屬之鄉(xiāng)”。選擇此處礦區(qū)的優(yōu)勢(shì)植物非常有代表性。五節(jié)芒是芒草的一個(gè)品種，是多年生的禾本科植物；艾草和婆婆納都是草本植物，艾草多年生，婆婆納一年至二年生；草本植物；唐菖蒲是鳶尾科的一個(gè)種，大多半野生；苧麻則是一種亞灌木或灌木植物。它們?cè)诘V區(qū)生長(zhǎng)狀況良好，生長(zhǎng)旺盛，是優(yōu)良的研究材料，對(duì)探究礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物在植物——微生物聯(lián)合修復(fù)中起的作用很有意義。1.3植物根際促生菌及研究進(jìn)展在植物根際土壤中生活著大量微生物，它們?cè)谕寥郎鷳B(tài)系統(tǒng)起著推動(dòng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)的作用，，參與了土壤中多種元素的流動(dòng)，例如C、N、P等，而且還參與了有機(jī)物的分解[13]。不同的微生物群落存在于不同植物的根際，與植物相互作用。有一部分對(duì)植物生長(zhǎng)有害，而另外一類(lèi)能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，防止植物被病毒微生物傷害，從而增加產(chǎn)量的微生物被稱(chēng)作植物根際促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，簡(jiǎn)稱(chēng)PGPR)。從1978年Burr等研究者報(bào)道出對(duì)馬鈴薯有促生作用的PGPR以來(lái)，在這30多年里國(guó)內(nèi)外的學(xué)者和科學(xué)家對(duì)PGPR進(jìn)行了不斷地研究，現(xiàn)在分離培養(yǎng)出的PGPR的種類(lèi)主要有假單孢菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、埃文氏菌屬(Eriwinia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)等[14-17]。王光華[18]等從大豆根際土壤分離到一株可以抵抗七種病原微生物的芽孢桿菌BRF-1。康貽軍[19]等從江蘇揚(yáng)州、鹽城等地土壤樣品篩選出14株P(guān)GPR,包括假單胞菌、類(lèi)芽抱桿菌屬等，具有體外抑菌、產(chǎn)NH3、產(chǎn)IAA、解磷、固氮以及產(chǎn)抗生素等多種促生能力。吳皓瓊[20]等分離篩選的ASP－15克雷伯氏菌(Klebsilla)，兼具解磷、固氮及抑制病原真菌生長(zhǎng)的功能。PGPR可以促進(jìn)植物對(duì)礦物元素的吸收，獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)PGPR能夠產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)植物的激素濃度，達(dá)到對(duì)植物直接地促生效果；其間接促生方式主要是抑制病原微生物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等[21]。直接和間接作用共同的結(jié)果就是促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，從重金屬污染土壤分離出來(lái)的，對(duì)多種重金屬具有較高耐受性PGPR，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加修復(fù)植物生物量，提高植物修復(fù)重金屬的效率的作用。2014年，Ahmad[22]發(fā)現(xiàn)在重金屬污染條件下，接種PGPRKlebsiellasp.CIK-502能夠增加小麥和玉米生物量，同時(shí)顯著降低地上部與地下部Cd含量。當(dāng)前，PGPR的促生機(jī)制以及對(duì)重金屬污染的土壤修復(fù)成為了農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)、生態(tài)研究的一大熱點(diǎn)。1.4植物根際土促生菌的促生機(jī)制1.4.1調(diào)節(jié)植物激素的濃度對(duì)植物生長(zhǎng)起作用并且控制植物其他生命活動(dòng)的植物激素主要有細(xì)胞分裂素、吲哚乙酸、赤霉素、乙烯等，尤其是吲哚乙酸IAA被視為最重要的天然生長(zhǎng)素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，80%的PGPR具有產(chǎn)生IAA的功能[23]。IAA可以增加植物根的數(shù)量，有助于植物根系的生長(zhǎng)，擴(kuò)大根系吸收面積，然后促進(jìn)根系對(duì)重金屬和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而增加金屬修復(fù)量。羅雅[24]從重金屬污染土壤分離到一株P(guān)b和Cd耐性菌株（Ochrobactrumsp.J3），盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，接種菌株J3的香根草（Vetiveriazizanioides）生物量是不加菌的2.1倍。同時(shí)，PGPR也會(huì)產(chǎn)生ACC(1-Aminocyclopropane-1-carboxylicacid)脫氨酶調(diào)節(jié)乙烯的濃度。Sheng[25]從重金屬污染土壤生長(zhǎng)油菜根系中分離到兩株對(duì)重金屬鉛有較強(qiáng)耐受性，且具有分泌ACC脫氨酶能力的植物促生菌PseudomonasfluorescensG10和Microbacteriumsp.G16，在鉛污染土壤盆栽試驗(yàn)中，接種菌株G10和G16顯著提高了油菜生物量和鉛積累量。在正常的情況下，乙烯的作用是幫助打破種子休眠，加速植物生長(zhǎng)發(fā)育，而且也是防御信號(hào)分子。但是在種子萌發(fā)和即將成熟的時(shí)期會(huì)合成大量乙烯，或者在重金屬等逆境脅迫下，乙烯濃度會(huì)急劇上升，而過(guò)量的乙烯會(huì)抑制大多數(shù)植株根的伸長(zhǎng)，損害植物的生長(zhǎng)，此時(shí)根際促生細(xì)菌產(chǎn)生的ACC脫氨酶就發(fā)揮作用了，它可以分解合成乙烯的前體ACC，ACC被分解后，乙烯無(wú)法合成，進(jìn)而濃度就會(huì)降低，也加強(qiáng)了植物抗性，削弱了環(huán)境脅迫對(duì)植株的傷害。1.4.2產(chǎn)生鐵載體鐵元素是植物生長(zhǎng)所必需的生長(zhǎng)因子，如果植物體內(nèi)缺乏鐵元素會(huì)影響葉綠體的合成，植物會(huì)得黃葉病。盡管在植物根際中有一大批鐵元素，不過(guò)基本上是以難溶性的三價(jià)鐵離子形態(tài)出現(xiàn)，不允許直接進(jìn)入植物體內(nèi)。此時(shí)PGPR會(huì)分泌鐵載體，鐵載體與Fe3+特異性結(jié)合形成可溶性鐵——嗜鐵素復(fù)合體，復(fù)合體進(jìn)入植物體內(nèi)會(huì)被水解，被還原成Fe2+，F(xiàn)e2+則可以被植物高效利用。研究表明，類(lèi)似Fe等植物生長(zhǎng)所需金屬元素如果要進(jìn)入植物的根，大部分是被根表皮細(xì)胞吸收然后轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的。這種方式特定且專(zhuān)一。可以將植物體內(nèi)的金屬元素濃度控制在正常范圍，防止植物因金屬濃度過(guò)高被毒害。。Guo[26]等研究發(fā)現(xiàn)在Cd污染條件下，接種具有鐵載體分泌能力的植物促生菌（Bradyrhizobiumsp.YL-6）能夠顯著增加大豆葉片里Fe和Mg元素的含量，同時(shí)也能增加葉片光合色素含量。也有研究表明，PGPR還有其他的促生作用，因?yàn)椴≡L(zhǎng)同樣需要鐵元素，而PGPR產(chǎn)生的鐵載體更容易獲得土壤根際的鐵，所以它們的生長(zhǎng)會(huì)受到限制，就可以創(chuàng)造一個(gè)相對(duì)健康的生長(zhǎng)環(huán)境，使植物更好地發(fā)育。1.4.3溶磷解鉀磷元素和鉀元素都是植物生長(zhǎng)中重要的營(yíng)養(yǎng)素，磷還參與了植物的蛋白質(zhì)代謝、脂肪代謝、糖類(lèi)代謝。在重金屬污染的土壤里，重金屬元素會(huì)與磷酸鹽礦物形成難溶性磷酸鹽沉淀，有些PGPR會(huì)分泌出甲酸、乙酸等有機(jī)酸，從而降低根際土壤的PH，使不溶態(tài)的無(wú)機(jī)磷和無(wú)機(jī)鉀的可溶性和有效化提升，變成易于植物吸收的可溶態(tài)形式。當(dāng)磷元素被吸收，磷酸鹽分解，重金屬元素也會(huì)被分離出來(lái)，重金屬離子的增加就會(huì)讓植物根系增加對(duì)其的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)。Jiang[27]等人從重金屬污染土壤分離得到一株具有溶磷功能的伯克氏菌（Burkholderiasp.J62），將其接種于玉米和番茄的土壤中進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個(gè)菌對(duì)金屬活化能力很強(qiáng)，玉米和番茄中的Pb和Cd含量明顯高于未接菌的。1.4.4固氮大自然中最常見(jiàn)的的固氮方式是生物固氮。氮?dú)馐强諝獾闹饕M成成分，生物固氮的機(jī)理就是通過(guò)固氮微生物吸收空氣中氮?dú)獠⑺D(zhuǎn)化成氨。由于植物不能直接利用空氣中的氮?dú)庾鳛榈?，但是氮素又是必需的元素，所以固氮作用?duì)它們的生長(zhǎng)大有影響。生物固氮包括共生固氮、非共生固氮和聯(lián)合固氮[28]。根際細(xì)菌參與固氮的形式主要是共生固氮和非共生固氮。很多豆科植物生根時(shí)根瘤菌入侵根部形成根瘤與植物共生，植物給根瘤菌運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，根瘤菌通過(guò)固氮作用幫助植物獲得其所需的氮素，這就是共生固氮。非共生固氮就是非豆科植物根際土壤中的PGPR釋放固氮酶，將較高價(jià)態(tài)的N2還原成NH3，再利用土壤中的硝化細(xì)菌轉(zhuǎn)換成硝酸根，然后以離子形式被吸收。在缺氮環(huán)境下，PGPR比其他菌存活得更好并且對(duì)植物生長(zhǎng)有很大的促生效果。1.5論文的主要內(nèi)容及研究意義本論文的主要內(nèi)容是對(duì)湖南花垣縣鉛鋅區(qū)優(yōu)勢(shì)植物的根際土促生細(xì)菌進(jìn)行研究。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，分析這些細(xì)菌的促生性能和耐重金屬性，選出優(yōu)良的根際促生細(xì)菌。在本實(shí)驗(yàn)的研究后，經(jīng)過(guò)盆栽試驗(yàn)依然能表現(xiàn)出優(yōu)良的促生能力和耐重金屬特性的菌株如果可以投入到實(shí)際栽培，與植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染的土壤，同時(shí)利用PGPR的促生功能促進(jìn)植物生長(zhǎng)。例如，投入到重金屬污染的礦區(qū)中，可以吸收礦區(qū)重金屬，恢復(fù)礦區(qū)的生態(tài)環(huán)境，保持當(dāng)?shù)氐乃?，提高礦區(qū)的植被覆蓋率。如果運(yùn)用到耕地，這些細(xì)菌可以作為一種綠色肥料，起到部分農(nóng)藥，化肥的作用，但是又不會(huì)像農(nóng)藥化肥因?yàn)檫^(guò)度使用而留下殘留物毒害作物。它們可以吸收有毒物質(zhì)，改善耕地土壤質(zhì)量；提高作物在面對(duì)土壤污染等環(huán)境脅迫下的抗性；產(chǎn)生的IAA、ACC脫氨酶和鐵載體等生長(zhǎng)因子直接地促進(jìn)作物的生長(zhǎng)，提高作物的產(chǎn)量。雖然這只是我的猜想，植物根際促生細(xì)菌還未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，大量生產(chǎn)應(yīng)用于實(shí)際，但是本研究的篩菌工作豐富了PGPR的菌株庫(kù)，為開(kāi)展植物根際促生菌株資源調(diào)查和特性研究，探究與植物交互作用等工作做出了貢獻(xiàn)，為菌肥的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。2材料和方法2.1試驗(yàn)材料采集位于湖南省花垣縣鉛鋅礦區(qū)的優(yōu)勢(shì)植物五節(jié)芒、艾、唐菖蒲、苧麻、婆婆納，將完整植株以及植株距離地面5cm下的土壤和根系鏟出裝入密封袋低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室做樣品。2.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化鈉NaCl10g，1000ml去離子水，pH7.2。DF培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀4.0g，七水硫酸鎂0.2g，磷酸氫二鈉6.0g，葡萄糖酸鈉2.0g，檸檬酸0.2g，葡萄糖2.0g，硫酸銨2.0g，pH7.2。ADF培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀4.0g，磷酸氫二鈉6.0g，七水硫酸鎂0.2g，葡萄糖酸鈉2.0g，檸檬酸0.2g，葡萄糖2.0g，硫酸銨2.0g，ACC3g，pH7.2ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>秦寶軍</Author><Year>2012</Year><RecNum>7</RecNum><DisplayText>[3]</DisplayText><record><rec-number>7</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xr29wsz5fa0f0qes05f5r2f8vzs5pvp0xeas"timestamp="1571969266">7</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>秦寶軍</author><author>羅瓊</author><author>高淼</author><author>胡海燕</author><author>徐晶</author><author>周義清</author><author>孫建光</author></authors></contributors><titles><title>小麥內(nèi)生固氮菌分離及其ACC脫氨酶測(cè)定</title><secondary-title>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)</secondary-title></titles><periodical><full-title>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)</full-title></periodical><pages>1066-1073</pages><volume>45</volume><number>6</number><dates><year>2012</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>。Ashby培養(yǎng)基：購(gòu)自索萊寶公司，產(chǎn)品編號(hào)LA6960。PDA培養(yǎng)基：購(gòu)自索萊寶公司，產(chǎn)品編號(hào)PA831。改良馬丁培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g，酵母提取物2.0g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，1000ml去離子水，pH6.6。蒙金娜（PKO）無(wú)機(jī)培養(yǎng)基：七水硫酸鎂0.3g，葡萄糖10.0g，硫酸銨0.5g，氯化鈉0.3g，磷酸鈣2.0g，氯化鉀0.3g，一水合硫酸錳0.03g，綠礬0.036g，1000ml去離子水，瓊脂20g。亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基：磷酸氫二鈉2.0g，七水硫酸鎂0.5g，碳酸鈣0.1g，六水合氯化鐵0.005g，蔗糖5.0g，鉀長(zhǎng)石粉1.0g，1000ml去離子水，瓊脂20.0g。CAS培養(yǎng)基：將A液倒入B液中混勻。A液：60.5mgCAS溶于50ml去離子水中，再與10ml1mM六水合氯化鐵混合后，加入到72.9mg十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）與10ml水的混合溶液中。115℃滅菌20min，保溫至50℃。B液：七水合磷酸氫二鈉12.8g，磷酸二氫鉀0.3g，氯化鈉0.5g,氯化銨1g，0.1mol/L硫酸鎂200ul，0.1mol/L氯化鈣100ul，100ml去離子水，稀釋10倍。在75ml超純水中加入10mlMM9，3.024gPIPES，0.6g氫氧化鈉溶解，高溫滅菌保溫50℃，加入2ml20％葡萄糖和100ul0.2mol/L鹽酸硫銨，得B液。2.3根際細(xì)菌的分離、純化將湖南花垣鉛鋅礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物根際附著的松散大顆粒土抖落，取10g土樣置于錐形瓶中，使用滅菌超純水充分沖洗植物根際土，靜置10min，收集懸濁液，取1ml懸濁液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0-4~10-6梯度的懸濁液0.1ml涂布接種于LB固體培養(yǎng)基，在30℃恒溫培養(yǎng)2d，得到植物根際土細(xì)菌。2d后，根據(jù)菌株的生長(zhǎng)情況，挑選大小，顏色及形態(tài)各異的菌落，將它們接于LB固體培養(yǎng)基上，劃線(xiàn)純化，得到的菌株即是純菌株，將純菌株利用甘油保藏法置于超低溫（-80℃）冰箱中備用。2.4菌株促生特性測(cè)定2.4.1產(chǎn)IAA能力測(cè)定為了測(cè)定菌株IAA的含量，本實(shí)驗(yàn)采用Salkowski比色法，每種菌吸取1ml菌懸液放入含有100mg·L-1L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)1d。用移液槍取50uL菌懸液滴加到于白瓷板上，取完后滴加50uLSalkowski’s比色液到每份菌液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，即在白瓷板上滴加50uLIAA（50mg?L-1），然后加入50uL比色液混合。在室溫下，將白瓷板放到避光處?kù)o放置30min，觀察混合液體的顏色，顏色能夠變紅的菌液說(shuō)明這個(gè)菌株可以產(chǎn)IAA。將反應(yīng)液變紅的菌株記錄下來(lái)，然后按照記錄吸取每種菌的菌懸液1ml，將菌懸液放進(jìn)離心機(jī)，10000rpm離心10min后，取0.5ml上清液加入兩倍體積的Salkowski顯色劑充分混合后放到于暗處反應(yīng)30min，后使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)液OD530nm。IAA進(jìn)行梯度稀釋后制做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就能得出每種菌株分泌IAA量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。Salkowski’s比色液：35%的高氯酸和0.5mol/L的氯化鐵按體積比50:1配制混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。2.4.2產(chǎn)ACC脫氨酶活性測(cè)定取1mlLB培養(yǎng)基中的菌液接種到100mlDF培養(yǎng)基，在30℃，180r/min條件下培養(yǎng)1d，從中取1ml菌懸液加入100mlADF培養(yǎng)基中，30℃，180r/min培養(yǎng)1~2d，吸取ADF培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行ACC脫氨酶活性測(cè)定。ACC脫氨酶活性參照HONMA[29]等方法，上述能生長(zhǎng)的菌株在LB液體培養(yǎng)基中活化1d，設(shè)置3組重復(fù)，4℃離心，用不含（NH4）2SO4的DF培養(yǎng)基洗滌3次，重懸于ADF培養(yǎng)基培養(yǎng)1d后，4℃離心收集菌體，0.1mol/LTris-HCl(PH=7.6)洗滌三次，重懸于600μL0.1mol/LTris-HCl(PH=8.5)中，加入30μL甲苯，渦旋震蕩儀震蕩30s，100μL細(xì)胞提取液使用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白濃度。取200μL細(xì)胞提取液加入20μL0.5mol/LACC，同時(shí)再此設(shè)置對(duì)照即空試管中加0.5mol/LACC，置于30℃水浴加熱15min，添加1mL2mol/LHCl，12000r/min離心5min，取上清液1mL，添加800μL0.56mol/LHCl和300μL在2mol/LHCl中溶解的0.2%2,4-二硝基苯肼溶液，30℃保溫30min，加入2mLNaOH,540nm測(cè)吸光度值。α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定[30]：用0.1mol/L（PH8.5）的Tris-HCl緩沖液配制α-丁酮酸梯度稀釋液，每管分別加入300μl0.2%的2,4-二硝基苯肼，混勻后于30oC水浴30min，加入2ml2mol/L的NaOH溶液顯色，穩(wěn)定后測(cè)其OD540，以Tris-HCl（PH=8.5）溶液做空白對(duì)照。OD540測(cè)吸光度。以α-丁酮酸濃度（0,0.2,0.4,0.6,0.8,1μmol）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定：0.01g牛血清白蛋白(BSA),定容至100ml，0.1mg/ml。取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0ml）加水至5ml，加入5ml考馬斯亮藍(lán)G250，OD595測(cè)吸光度。酶活力比=生成丁酮酸物質(zhì)的量/[總蛋白質(zhì)含量（mg）*測(cè)定酶活所用體積（μl）*酶活反應(yīng)時(shí)間（min）/測(cè)總蛋白質(zhì)所用的體積（μl）][31]。2.4.3產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定將單菌落點(diǎn)接到CAS平板上，每個(gè)平板3個(gè)重復(fù)，30℃培養(yǎng)5-7d后，觀察CAS平板是否產(chǎn)生橙黃色透明暈圈，如果產(chǎn)生了，說(shuō)明這個(gè)菌可以分泌鐵載體。后期將初篩出具有產(chǎn)鐵載體能力的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)2d后,放到離心機(jī)離心10min，設(shè)置轉(zhuǎn)速為10000r/min。取出后吸取上清液，加水稀釋10倍，加入等體積CAS檢測(cè)液并混合，靜置60min后于用紫外分光光度計(jì)630nm檢測(cè)吸光度A。取培養(yǎng)基加水稀釋10倍，與CAS等體積混勻測(cè)得吸光度Ar。鐵載體活性單位(siderophoreunit,SU)=[(Ar-A)/Ar]×100。2.4.4產(chǎn)酸能力測(cè)定營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選菌株于30℃，180rpm條件下培養(yǎng)5天，每24小時(shí)測(cè)定一次PH值并記錄。2.4.5固氮菌株篩選吸取100μl菌液均勻點(diǎn)接到Ashby培養(yǎng)基的三處，形成類(lèi)似等邊三角形的形狀，即三點(diǎn)接種法，每種菌株重復(fù)三次，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)的則為固氮菌。2.4.6溶磷菌株篩選吸取100μl菌液均勻點(diǎn)接到PKO無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的三處，形成類(lèi)似等邊三角形的形狀，即三點(diǎn)接種法，每種菌株重復(fù)三次，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察菌株形態(tài)，以透明圈作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，如果出現(xiàn)了就說(shuō)明這個(gè)菌株可以溶磷。然后測(cè)量菌株直徑d1和透明圈直徑D1，菌株溶磷能力=透明圈直徑(D1)/菌落直徑(d1)。2.4.7解鉀菌株篩選同樣使用三點(diǎn)接種法將菌液點(diǎn)接到亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基上，每種菌株重復(fù)三次，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察菌株形態(tài)，以透明圈作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，如果出現(xiàn)了就說(shuō)明這個(gè)可以解鉀。然后測(cè)量菌株直徑d2和透明圈直徑D2，菌株解鉀能力=透明圈直徑(D2)/菌落直徑(d2)。2.4.8根際土壤細(xì)菌的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定：在載玻片上滴加少量無(wú)菌水再滴加10μl菌液，酒精燈蒸干，結(jié)晶紫染色1min，沖洗，碘液染色1min，沖洗，無(wú)水乙醇脫色，番紅復(fù)染1min，蒸餾水沖洗。干燥，鏡檢。分子生物學(xué)鑒定：菌株DNA提取步驟按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TiangenDP302)進(jìn)行，利用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA片段。PCR反應(yīng)體系（50μL）：正向引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')各1μL，DNA模板1μL，ddH2O22μL，2×TaqPlusMasterMixⅡ（DyePlus）（VazymeP213-01）25μL。反應(yīng)條件:95℃5min(95℃45s,55℃45s，72℃1min)×35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳：1.2g瓊脂糖溶于120ml1×TAEBuffer，微波爐（中火）加熱溶解，中途取出搖勻至透明，清亮。冷卻至50℃（不燙手）加入5μlEB，倒入插有梳子膠槽，冷凝。將膠置于核酸電泳槽，倒入1×TAEBuffer。膠槽中加入5μl含有l(wèi)oadingbuffer的PCR產(chǎn)物，DNAmarker5μl單獨(dú)加入一個(gè)膠孔。120V,45min。凝膠呈像儀呈像。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的結(jié)果進(jìn)行拼接，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列對(duì)比，確定與已知序列的關(guān)系，相似度達(dá)97%以上即為一個(gè)種。2.5優(yōu)良菌株耐Cd能力測(cè)定將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，挑選出促生性能較為優(yōu)良的菌株，接種到含有不同Cd濃度平板上。測(cè)定其生長(zhǎng)曲線(xiàn)。2.6數(shù)據(jù)處理使用Microsoftexcel2010和SPSS20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。3結(jié)果和分析3.1菌株篩選通過(guò)第一步的分離純化，從五種優(yōu)勢(shì)植物根際土壤樣品中一共篩選出22株植物根際細(xì)菌，將其編號(hào)為T(mén)S1-TS8，PS1-PS5，AS1-AS2，ZS1-ZS4，MS1-MS3，接下來(lái)的研究便是選擇這22株菌進(jìn)行的。3.2產(chǎn)IAA能力觀察白瓷板上反應(yīng)液的變色情況來(lái)判斷22株被測(cè)菌株是否能產(chǎn)生IAA，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)這22株根際土細(xì)菌中有10株菌有分泌IAA的促生性能。它們分別是TS3、TS7、TS8、ZS1、ZS3、ZS4、PS3、PS5、MS3、AS1。顏色越深表示分泌IAA能力越強(qiáng)。對(duì)具有產(chǎn)IAA能力的菌株進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，IAA的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=54.871x-3.9959R2=0.9969）計(jì)算。從定量結(jié)果（圖2）表明菌株TS8與ZS3產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)，分別為65.75mg/L和74.21mg/L，PS5產(chǎn)IAA的能力最弱，其余菌株的產(chǎn)IAA含量在1.38~15.90mg/L之間，并且相對(duì)于TS8和ZS3來(lái)說(shuō)，分泌IAA的量還是有很大的差異的。說(shuō)明TS8和ZS3具有較強(qiáng)的促生性能。圖1菌株IAA定性測(cè)定Fig1qualitativedeterminationofIAAstrain圖2菌株產(chǎn)IAA定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果P<0.05Fig2quantitativetestresultsofIAAproductionbystrainP<0.053.3產(chǎn)ACC脫氨酶能力前面已經(jīng)篩選出10株具有分泌IAA功能的根際土促生細(xì)菌，接下來(lái)通過(guò)對(duì)這些細(xì)菌的ACC脫氨酶的活性測(cè)定來(lái)選出同時(shí)具有產(chǎn)ACC脫氨酶能力的優(yōu)良菌株。主要以每小時(shí)形成1μmolα-丁酮酸的活性作為ACC脫氨酶的單位活性。從結(jié)果（圖3）可以看出這10株菌都具備產(chǎn)ACC脫氨酶的性能。不過(guò)還是有能力高低之分的。分析得出這些菌的ACC脫氨酶的活性范圍是在0.1249~1.4122μmolα-Kb/h·mg，依然是TS8的ACC脫氨酶活性最高，然后是PS5，排在最后的是MS3，且TS8顯著高于其他菌（P<0.05）。圖3菌株ACC脫氨酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig3experimentalresultsofdeaminaseactivityofACCstrain3.4產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定測(cè)定根際細(xì)菌產(chǎn)鐵載體的能力主要是使用CAS平板法。通過(guò)觀察藍(lán)色的CAS平板是否產(chǎn)生橙黃色透明圈鑒定性能。結(jié)果（圖4）表明在上個(gè)實(shí)驗(yàn)篩選出的10株菌中剩有6株能夠產(chǎn)生鐵載體，分別是MS3、PS3、TS8、ZS1、ZS3、ZS4。再對(duì)這6株菌進(jìn)行定量檢測(cè)，鐵載體活性單位(siderophoreunit,SU)=[(Ar-A)/Ar]×100。SU數(shù)值越大，說(shuō)明鐵載體活性越強(qiáng)，這株菌的促生性能也越強(qiáng)。從（圖5）不難看出，這6株菌中ZS4產(chǎn)鐵載體的能力很高，SU達(dá)到了39.47%，其他菌就稍微弱了些。SU的總體范圍是39.48~14.03%之間。圖4鐵載體定性實(shí)驗(yàn)Fig4qualitativeexperimentofironcarrier圖5鐵載體定量實(shí)驗(yàn)Fig5quantitativeexperimentofironcarrier3.5固氮溶磷解鉀能力通過(guò)觀察Asbby培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)情況可以選出能固氮的根際促生菌。而要選出具有溶磷能力的菌株就是要能夠在PKO無(wú)機(jī)培養(yǎng)基產(chǎn)生透明光圈，選出具有解鉀能力的菌株就是要能夠在亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明光圈。然后將6株菌進(jìn)行測(cè)定，如（圖6）所示，TS8、ZS1、ZS3、ZS4、PS3、MS3都能夠固氮。從（圖7）看到，具有溶磷功能的有5株，TS8不能溶磷，其他菌株可以。而具有解鉀功能的是（圖8）4株，分別是ZS1、ZS4、TS8。定量分析得到各自的固氮溶磷解鉀能力可以在（表1）上體現(xiàn)。PS3固氮最厲害，為2.66。MS3的溶磷最厲害，為3.39，TS8的解鉀最厲害，為2.33。圖6菌株固氮能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig6experimentalresultsofnitrogenfixationcapacityofstrain圖7菌株溶磷能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig7experimentalresultsofphosphorousdissolutionofstrain圖8菌株解鉀能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig8experimentalresultsofpotassiumdecomposingabilityofstrain表1固氮，溶磷，解鉀能力研究結(jié)果Table1Theresultsofnitrogenfixation,phosphorusdissolutionandpotassiumdissolution固氮能力溶磷能力解鉀能力ZS11.9633±0.153081.5233±0.013651.9667±0.38109ZS31.9967±0.342692.1100±0.19053-ZS41.3033±0.046192.6333±0.202071.9600±0.40596MS31.3600±0.121243.3900±0.67179-PS32.6633±0.565252.2433±0.21362-TS8-1.6667±0.288682.3333±0.57735注：“-”表示不具有響應(yīng)的功能3.6產(chǎn)酸能力在植物根際土壤中，部分根際細(xì)菌具有產(chǎn)酸的能力，能夠降低土壤的PH，增加不溶礦物的溶解性和金屬元素的有效性。通過(guò)觀察記錄5天里這6株菌的PH，結(jié)果（圖9）顯示菌株TS8、MS3、PS3具有產(chǎn)酸功能，其余3株并不能產(chǎn)酸。其中PS3產(chǎn)酸能力最高，TS8和MS3的能力差不多。圖9產(chǎn)酸能力測(cè)定Fig9determinationofacidproductioncapacity3.7細(xì)菌鑒定通過(guò)篩選最終選出了6株具有產(chǎn)IAA，產(chǎn)ACC脫氨酶，產(chǎn)鐵載體三項(xiàng)主要功能的菌株，鏡檢結(jié)果如圖10。經(jīng)測(cè)序后，在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析和相似性比較，MS3，PS3為Serratiamarcescens（相似性100%），ZS4，ZS1，TS8是Klebsiellaoxytoca（相似性98%），ZS3是Bacterium屬（相似性99%）。圖10菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Fig10morphologicalidentificationresultsofstrain3.8生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，TS8在產(chǎn)IAA、ACC脫氨酶兩方面最厲害，產(chǎn)鐵載體含量較多，并且具有固氮和解鉀能力，所以綜合考慮，決定選取TS8進(jìn)行平皿試驗(yàn)，將其接種在Cd濃度分別為0ppm，10ppm，20ppm，30ppm，40ppm，50ppm，60ppm，70ppm的培養(yǎng)基上，測(cè)得TS8在36h下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如（圖11），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TS8在沒(méi)有Cd的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力強(qiáng)，但在含有大于10ppmCd的培養(yǎng)基中，它的生長(zhǎng)受到抑制，且隨著鎘濃度升高，抑制作用越明顯。圖11TS8的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig11growthcurveofTS84結(jié)論和討論近年來(lái)，化肥的過(guò)度使用使農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境遭到破壞，土壤重金屬污染嚴(yán)重，此時(shí)，修復(fù)土壤環(huán)境并同時(shí)能夠促進(jìn)作物、植物生長(zhǎng)的綠色高效可持續(xù)肥料迫切被需要。而PGPR與植物相互作用的機(jī)制成為生物修復(fù)的一個(gè)重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)PGPR的作用方式多樣，但是PGPR的菌株特性和對(duì)不同生物環(huán)境的適應(yīng)性存在差異限制了的應(yīng)用，因此篩選更多優(yōu)良PGPR菌株就顯得十分迫切。所以在重金屬污染嚴(yán)重的環(huán)境下更容易篩選出具有重金屬抗性的促生細(xì)菌。在重金屬污染的環(huán)境下，PGPR已經(jīng)形成了耐重金屬的特性并且有一套自身的解毒機(jī)制。本研究從常年被重金屬污染的礦區(qū)選擇優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)植物的根際土中篩選具有促生性能的菌株，實(shí)驗(yàn)的初篩結(jié)果顯示，22株篩選出來(lái)的細(xì)菌中有10株具有促生性能，但是這10株菌的促生能力有強(qiáng)弱之分。有6株菌可以分泌IAA，ACC脫氨酶，鐵載體，同時(shí)還具備固氮的能力，促生能力比其他4株菌相對(duì)更強(qiáng)一些。它們分別是ZS1、ZS3、ZS4、TS8、MS3、PS3。其中部分菌還具有溶磷解鉀能力。從各項(xiàng)促生性能的測(cè)定的結(jié)果比較下，TS8的促生性能應(yīng)該是最高的，因此挑選了它進(jìn)行耐性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雖然受到了Cd的影響但還是具備了耐重金屬性。不過(guò)，僅僅依靠這些菌在實(shí)驗(yàn)室測(cè)驗(yàn)的表現(xiàn)就能判定它具有優(yōu)異的促生能力是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因?yàn)閷⒕杲臃N到實(shí)際土壤中，植物的生長(zhǎng)不止受菌株的影響，環(huán)境中還會(huì)有另外成分的干預(yù)，利用PGPR與植物一起修復(fù)重金屬土壤的情況則更為復(fù)雜。所以，PGPR在實(shí)際中的促生成效才是促生能力的判斷依據(jù)。在接下來(lái)的盆栽試驗(yàn)，要更加關(guān)注菌株對(duì)植物的實(shí)際促生效果。而且，如果將PGPR投入生產(chǎn)，不同的菌株對(duì)相同植物或者不同植物的促生效果是否相同也是一個(gè)值得研究的問(wèn)題。因?yàn)镻GPR主要的菌屬如假單胞菌屬(Pseudomonas)、布克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等，也是植物常見(jiàn)病原菌較為集中的幾類(lèi)菌屬[32]。這些菌在實(shí)際作用于作物時(shí)，對(duì)作物的生長(zhǎng)是有好處還是壞處，是由作物的種類(lèi)和菌的產(chǎn)物濃度決定的。但是哪種作物最匹配哪種菌以及菌株產(chǎn)物的最適濃度是多少還未可知。同樣的，具有不同功能的菌是否可以作用于同一種作物，達(dá)到彼此最好的促生效果同樣值得深思。參考文獻(xiàn)[1]郭軍康,董明芳,丁永禎等.根際促生菌影響植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2015(07):140-146.[2]彭云霄.根際促生細(xì)菌提高植物抗重金屬能力的研究進(jìn)展[J].云南化工，201946(02):42-44.[3]韋革宏,馬占強(qiáng).根瘤菌-豆科植物共生體系在重金屬污染地修復(fù)中的地位、應(yīng)用及潛力[J].微生物學(xué)報(bào),2010,50(11):1421-1430.[4]趙英松,江洪,甘國(guó)東,史開(kāi)舉,呂濤.湖南花垣和蘇仙礦區(qū)重金屬污染評(píng)價(jià)及優(yōu)勢(shì)植物富集研究[J].貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,33(05):146-155.[5]MoCalmontJP,HastingsA,McNamaraNP,etal.EnvironmentalcoatsandbenefitsofgrowingMiscanthusforbioenergyintheUK.GCBBioenergy,2016,Doi:10.1111/gobb.12294.[6]ChungJH,KimDS.MiscanthusasapotenttialbioenergycropinEastAsia.JournalofGropScienceandBio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