ICS11.020CCSC05團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)CD31陽性及陰性循環(huán)異倍體腫瘤細(xì)胞檢DetectionmethodforcirculatinganeuploidtumorcellswitheitherposinegativeCD31experss中關(guān)村標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會發(fā)布T/ZSA320-2025前言 III IV 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 5試劑及存儲要求 5.1差相富集檢測 5.2iFISH腫瘤細(xì)胞檢測 6儀器設(shè)備及材料 7差相富集檢測方法 7.1檢測原理 7.2檢測前準(zhǔn)備工作 7.3差相富集檢測樣本采集 7.4差相富集檢測的總體要求 7.5差相富集檢測步驟 8iFISH腫瘤細(xì)胞檢測方法 8.1檢測原理 8.2檢測前準(zhǔn)備工作 8.3iFISH腫瘤細(xì)胞檢測的總體要求 8.4iFISH腫瘤細(xì)胞檢測步驟 9識別指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn) 9.1識別指標(biāo) 9.3CTEC判斷標(biāo)準(zhǔn) 9.4數(shù)字病理掃描儀識別標(biāo)準(zhǔn) 11質(zhì)量控制與安全要求 附錄A（資料性）檢測原理 附錄B（規(guī)范性）人外周血CTC差相富集檢測流程 附錄C（規(guī)范性）i?FISH腫瘤細(xì)胞檢測流程 T/ZSA320-2025附錄D（規(guī)范性）數(shù)字病理掃描儀識別標(biāo)準(zhǔn) 參考文獻(xiàn) T/ZSA320-2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中關(guān)村標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：北京大學(xué)人民醫(yī)院、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、四川大學(xué)華西醫(yī)院、北京醫(yī)院、泰州賽特生物醫(yī)藥科技有限公司、國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院、北京大學(xué)首鋼醫(yī)院、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院內(nèi)蒙古醫(yī)院、中日友好醫(yī)院、中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院、中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院、海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院、中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院、上海市第一人民醫(yī)院、浙江省腫瘤醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院、天津市第一中心醫(yī)院、山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院、上海復(fù)旦臨床病理診斷中心有限公司、寧波市臨床病理診斷中心、江蘇省蘇北人民醫(yī)院、宜昌市中心人民醫(yī)院、寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院、杭州市第三人民醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、江蘇蘇州明基醫(yī)院、寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司、中關(guān)村標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會。本文件主要起草人：王建六、昌曉紅、沈琳、巴一、王紅霞、陳念平、果吉爾銻、劉京曦、岳山、李凱、高梓茗、鄭直、尹洪芳、楊明、王良、張同梅、車南穎、韓毅、政祿、邢亞楠、季曉春、彭建中、余志杰、徐興祥、王克惠、王鈞、宮賀軍。T/ZSA320-2025本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及到3條相關(guān)的專利的使用。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)承諾，他愿意同任何申請人在合理無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。專利權(quán)人或?qū)＠暾埲送庠诠?、合理、無歧視基礎(chǔ)上，有償許可任何組織或者個人在實施該中關(guān)村標(biāo)準(zhǔn)時實施專利。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：專利持有人姓名：見表1。專利1和專利2地址：北京東城區(qū)東單新開路80號。專利3地址：北京市西城區(qū)西直門南大街11號。表1本文件相關(guān)專利1一種從外周血中快速提取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)2鑒別從人或動物生物體液中富集的非血源性有3北京昂科未來醫(yī)療請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。1T/ZSA320-2025CD31陽性及陰性循環(huán)異倍體腫瘤細(xì)胞檢測方法本文件規(guī)定了利用試劑盒進(jìn)行體內(nèi)CD31陽性異倍體循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及CD31陰性異倍體循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測試劑及存儲要求、儀器設(shè)備及材料、差相富集檢測方法、免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交（i?FISH）腫瘤細(xì)胞檢測方法、識別指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn)、檢測報告、質(zhì)量控制與安全要求。本文件適用于罹患實體腫瘤或腫瘤高危人群外周血或其他生物體液樣本（胸腹水、骨髓、尿液、腦脊液、淋巴穿刺標(biāo)本等）中非血源性循環(huán)異倍體腫瘤細(xì)胞的CD31及腫瘤標(biāo)志物表達(dá)、8號染色體倍體數(shù)目、細(xì)胞大小、團(tuán)聚等的檢測。本文件適用于實體腫瘤的輔助診斷及有腫瘤轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移傾向患者手術(shù)或治療療效評估、耐藥監(jiān)測、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測等。具備循環(huán)腫瘤細(xì)胞及循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞檢測資質(zhì)和條件的醫(yī)院或第三方檢驗機(jī)構(gòu)可參照使用。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29791.2體外診斷醫(yī)療器械制造商提供的信息(標(biāo)示)第2部分:專業(yè)用體外診斷試劑GB/T29791.3體外診斷醫(yī)療器械制造商提供的信息(標(biāo)示)第3部分:專業(yè)用體外診斷儀器3術(shù)語和定義GB/T26124界定的及下列術(shù)語和定義適用于本文件。循環(huán)腫瘤細(xì)胞circulatingtumorcell；CTC從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤中脫落入血的腫瘤細(xì)胞。循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞circulatingtumorendothelialcell；CTEC從腫瘤血管脫落并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。標(biāo)本背景specimenbackground血液樣本制成染色玻片后出現(xiàn)的蛋白背景（非特異性染色或背景染色）。2T/ZSA320-2025異倍體aneuploidy細(xì)胞中染色體數(shù)目的非整倍性變化。4縮略語下列縮略語適用于本文件。5試劑及存儲要求5.1差相富集檢測差相富集檢測試劑（單人份）及存儲條件應(yīng)符合表1要求。表1差相富集檢測試劑及存儲條件要求1234差相富集檢測試劑應(yīng)符合GB/T29791.2，具體要求如下：a)實驗結(jié)束后應(yīng)將試劑盒內(nèi)各組分按表1中相應(yīng)儲存條件保存；b)不應(yīng)使用過期試劑，試劑有效期要求如下：1)未開封試劑自生產(chǎn)日期起一年內(nèi)有效；3T/ZSA320-20252)開封試劑按照表1中相應(yīng)的儲存條件應(yīng)于90d內(nèi)用完。c)不應(yīng)將不同批號的試劑混用；d)不應(yīng)拆除組織固定液瓶口密封金屬圈，每次使用時，應(yīng)用注射器扎入瓶中抽取。5.2iFISH腫瘤細(xì)胞檢測i?FISH腫瘤細(xì)胞檢測試劑（單人份）及存儲條件應(yīng)符合表2要求。表2i?FISH腫瘤細(xì)胞檢測試劑及存儲條件要求12μL23458μL62μL7891μL1μL血細(xì)胞分析用染色液C061μL3μLi?FISH腫瘤細(xì)胞檢測試劑應(yīng)符合GB/T29791.2，要求如下：a)實驗結(jié)束后應(yīng)將試劑盒內(nèi)各組分按表2中相應(yīng)儲存條件保存；b)不應(yīng)使用過期試劑，試劑有效期要求如下：1)未開封試劑自生產(chǎn)日期起一年內(nèi)有效；2)開封試劑按照表1中相應(yīng)的儲存條件應(yīng)于90d內(nèi)用完。c)不應(yīng)將不同批號的試劑混用；d)每次實驗前應(yīng)觀察血細(xì)胞分析用稀釋液，如液體中漂浮絮狀物，應(yīng)使用離心機(jī)(950g)高速離心5min，取上清可繼續(xù)使用。6儀器設(shè)備及材料差相富集及i?FISH腫瘤細(xì)胞檢測所需的儀器設(shè)備應(yīng)符合GB/T29791.3，具體儀器設(shè)備4T/ZSA320-2025及材料要求如表3所示。表3儀器設(shè)備及材料要求KF-PF-040/TS-1//1把2把2把2把2把/////////////////////////////5T/ZSA320-2025表3儀器設(shè)備及材料要求（續(xù)）//////////熒光染色-熒光原位雜交樣品處理試劑盒//7差相富集檢測方法7.1檢測原理差相富集檢測原理參考附錄A。7.2檢測前準(zhǔn)備工作按照表3準(zhǔn)備好相應(yīng)品牌型號或符合檢測要求的儀器設(shè)備，并通過設(shè)備檢測驗證要求。實驗前應(yīng)在真空泵試劑瓶、廢液缸中倒入少量84消毒液，及時對吸棄的廢液進(jìn)行消毒。按照表3及下列要求準(zhǔn)備好相應(yīng)耗材：a)所有與細(xì)胞接觸的離心管、各個規(guī)格的槍頭、10mL移液管，無需滅菌，一次性使用，不應(yīng)重復(fù)利用；b)用于制片的載玻片應(yīng)使用Cytelligen格式化CTC包被載玻片；c)將20μL～200μL、0.2mL～1mL和1mL～5mL等規(guī)格加樣器及相應(yīng)規(guī)格槍頭、1.5mL離心管、15mL離心管、50mL離心管整齊擺放于臺面，并分別標(biāo)記4個506T/ZSA320-202打開體液脫落細(xì)胞檢測試劑盒，取出清洗液10×CRC、樣本密度分離液。a)將清洗液10×CRC置于37℃水浴中1.5h～2h溶解所有結(jié)晶，充分顛倒混勻后再稀釋；注：如結(jié)晶未溶解充分均勻，可能會造成稀釋液pH值、滲透壓偏差，造成細(xì)胞破裂。c)用1000mL量筒加入800mL純化水，并將上述100mL清洗液10×CRC全部倒入其中；e)剪一正方形大塊封口膜，用封口膜將量筒口密封，輕柔頭尾顛倒10次以混勻試劑，過程中避免起泡；f)將配制后的清洗液1×CRC裝在干凈的1000mL試劑瓶中，2℃~8℃保存，每次分裝使用。根據(jù)當(dāng)天血樣人份，按照表1分裝適量清洗液1×CRC、適量樣本密度分離液置于水浴鍋中預(yù)熱至27℃,預(yù)熱后混勻。每次實驗后的多余試劑應(yīng)置于2℃~8℃環(huán)境中單獨保存以供下次實驗使用。如試劑量不夠，應(yīng)開啟下一個試劑盒按照7.2.3進(jìn)行試劑準(zhǔn)備，不同批次的試劑不應(yīng)混合使用。7.3差相富集檢測樣本采集7.3.1采集前準(zhǔn)備應(yīng)使用ACD抗凝采血管（6mL，黃帽不應(yīng)使用臨床上其他抗凝管，如EDTA、肝素等，否則影響細(xì)胞形態(tài)、抗體染色、標(biāo)本背景等鑒別指標(biāo)。準(zhǔn)備一次性采血針及消毒、止血用具。根據(jù)輔助診斷、手術(shù)、治療等情況，及時通知安排病人采血，相關(guān)要求如下：a)輔助診斷患者：病理診斷確診前采集外周血；b)接受治療的患者：每一程治療前1d～2d（即上一程治療結(jié)束）采血檢測，用藥期間不應(yīng)采血；c)接受手術(shù)的患者：手術(shù)前及術(shù)后一周采血；d)采血前一天患者盡量避免油膩飲食，晚上10點以后避免大量喝水以免稀釋血液，抽血當(dāng)日，宜餓血采血。7.3.2采血量及要求血液靜脈采血6mL，應(yīng)待采血管負(fù)壓消耗盡再拔針，立即頭尾顛倒8次，充分混勻以防凝血。如因受檢者個體差異未能抽6mL時，可按不低于4mL進(jìn)行采血。采血時，可在受檢者抽血常規(guī)樣本后抽取本檢測血樣。采血開始抽取避免皮膚穿刺時上皮細(xì)胞污染。受檢者抽血處消毒處理，一次性采血針一頭插入靜脈，另一頭插入采血管黃色橡皮塞正中央。由于采血管內(nèi)有負(fù)壓，血液會自動流進(jìn)采血管，一般液面到達(dá)采血管標(biāo)簽上沿時即為滿管，如圖1所示，從靜脈拔出采血針。7T/ZSA320-2025圖16mLACD抗凝采血管滿管示意圖在ACD抗凝采血管貼條形碼，室溫避光保存。7.3.3樣本配送及保存采樣后應(yīng)室溫避光放置，不應(yīng)放置在冰箱中，并立即或盡快送至實驗室。室外氣溫低于5℃時，應(yīng)將樣本用保溫材料（如保溫袋）包裹后置于保溫箱中，應(yīng)避免露天運輸。平穩(wěn)運送，減少或盡量避血樣運輸過程中振蕩，以免細(xì)胞破裂。防止血樣溶血。血液樣本采集完至標(biāo)本開始處理最長不應(yīng)超過72h，宜在24h內(nèi)進(jìn)行處理。實驗室應(yīng)由專人接收樣本，對樣本進(jìn)行檢測編號，嚴(yán)格對應(yīng)標(biāo)記所用載玻片和試管，室溫放置，宜盡快進(jìn)行樣本處理及檢測。7.4差相富集檢測的總體要求7.4.1實驗全程實驗人員應(yīng)穿戴白大衣、口罩、帽子及無粉手套，保障安全，并防止唾液、頭屑等上皮細(xì)胞污染血樣本。7.4.2整個富集實驗加上抗體液染大約耗時1.5h，在細(xì)胞涂到玻片上干燥前，人不可因故中途離開，實驗前應(yīng)計算好時間。7.4.3應(yīng)檢查采血管血量，采血量一般為6mL，實際血量不應(yīng)低于4mL，記錄實際處理血7.4.4檢查樣本有無凝塊，如有凝塊應(yīng)評估其體積大小，凝塊大于1mL（花生米大小）時應(yīng)重新采血。7.4.5離心前應(yīng)將血標(biāo)本置于配平天平上精確配平，不應(yīng)肉眼觀察離心管刻度估測配平。7.4.6整個實驗中，所有離心前的頭尾顛倒混勻、細(xì)胞吹打混勻、轉(zhuǎn)移細(xì)胞液等過程應(yīng)輕柔，注意避免起泡。7.4.7使用移液槍吸取液體或細(xì)胞時，槍頭應(yīng)從液面處先吸取，慢慢隨液面的下降而下降；將液體或細(xì)胞打入離心管等容器中時，槍頭應(yīng)沿管壁注入，以避免起泡。7.4.8實驗過程中使用真空泵吸棄廢液時，吸棄速度不應(yīng)過大、過快，越接近底部細(xì)胞沉淀時，吸棄速度則應(yīng)越慢。7.4.9使用移液槍吹打細(xì)胞或緩沖液沉淀時，為避免起泡并充分混勻沉淀，應(yīng)將槍調(diào)節(jié)成與液體相近但略小的體積，多次反復(fù)輕柔混勻沉淀。8T/ZSA320-20257.4.10使用可調(diào)速漩渦混合儀震蕩混勻細(xì)胞時，震蕩速度不應(yīng)過快，應(yīng)采用低速、多次點震混勻細(xì)胞，震蕩速度過大易傷害細(xì)胞。推薦使用SI旋渦混合儀（vortex-genie2速度調(diào)節(jié)至3時混勻細(xì)胞。7.4.11清洗細(xì)胞時，操作過程輕柔，避免細(xì)胞在清洗過程中被檢細(xì)胞的丟失或/和細(xì)胞破裂。7.5差相富集檢測步驟7.5.1制備離心管A采血管配平顛倒混勻后，室溫400g離心10min，棄上清至棕紅色沉淀上加入清洗液1×CRC至采血管6mL標(biāo)簽處，蓋上黃色管帽，頭尾顛倒混勻后將全部血液倒入50mL離心管A中，在采血管中加入3mL清洗液1×CRC洗滌采血管，將洗滌液全部倒入離心管A中。7.5.2制備離心管B在50mL離心管B中加入3mL樣本密度分離液，將離心管A中的血液豎直搖勻、充分混合，使用大容量手動移液器將離心管A中的血細(xì)胞沿離心管B管壁液面處緩慢加到分離液頂層，疊加后可見清晰的分界面，少量紅細(xì)胞慢慢沉降至管底，如圖2所示。具體要求如下：a)在將離心管A中的血細(xì)胞疊加到管B分離液頂層時，離心管A中的血細(xì)胞應(yīng)充分混勻，混勻后立即疊加；b)將血細(xì)胞疊加至3mL分離液時，將移液管管尖置于分離液液面處，緩慢疊加血細(xì)胞，尤其是打入液體的第一下。整個疊加過程應(yīng)緩慢，避免將血細(xì)胞混入分離液中；c)將管A中的血細(xì)胞全部疊加到分離液上后，距離離心的時間最長不應(yīng)超過5min，如果血樣本較多，可分批疊加、離心。（a）操作中（b）加注后圖2血細(xì)胞加入分離液示意圖7.5.3制備離心管C將離心管B配平后，在室溫下350g離心6min，離心后可見三層液體，上層為黃色液體(1層)，中間層為透明或淡紅色液體(2層)，底層為深棕紅色沉積紅細(xì)胞(3層)，如圖3所示。9T/ZSA320-20251層1層2層2層3層圖3離心管B離心后狀態(tài)示意圖按照如下步驟制備離心管C：a)首先從1層最上方取出4mL液體棄去；b)將剩余1層、2層所有液體轉(zhuǎn)移至50mL離心管C中，不應(yīng)吸取到3層紅細(xì)胞；c)沿管壁加入清洗液1×CRC至6mL，豎直搖勻液體。制備離心管C的注意事項及相關(guān)要求如下：a)離心管B疊加后離心如遇溶血應(yīng)加離處理，微紅無需加離，加離條件為350g/3min；b)加離后微紅可正常處理，如依然溶血嚴(yán)重或只有兩層則取1層和2層，應(yīng)盡量避免取到3層的紅色部分，如不小心取到，不應(yīng)超過50μL；c)在棄4mL1層黃色液體時應(yīng)從1層液面最上方取，應(yīng)遠(yuǎn)離2層，且避免取到細(xì)胞；d)取剩余1層、2層液體時，如不小心取到底部紅細(xì)胞，應(yīng)將槍尖處的紅細(xì)胞打掉。7.5.4離心管C混合緩沖液a)按照每管250μL的比例將緩沖液緩慢加入離心管C中，邊加邊搖動離心管C以混勻緩沖液；b)將離心管C以35°~40°角傾斜固定于水平搖床上，如圖4所示；c)室溫下以125r/min的速度搖動20min，注意液面搖晃的最高處應(yīng)在刻度30mL~圖4離心管C置于水平搖床示意圖7.5.5制備離心管D按照如下步驟制備離心管D：a)將離心管C置于磁力架上；b)1min時使用5mL槍頭伸入管底中央輕柔吹打2下；T/ZSA320-2025c)2min后使用同樣槍頭沿離心管C正中央將液體小心轉(zhuǎn)移至50mL離心管D中,不應(yīng)取d)在離心管D中加入清洗液1×CRC至45mL，配平，顛倒混勻；f)棄上清至100μL，立即按照第8章進(jìn)行后續(xù)操作。7.5.6差相富集檢測操作的流程見附錄B。差相富集檢測結(jié)束后，進(jìn)行如下操作：a)將分裝未用完的清洗液1×CRC、樣本密度分離液放入冰箱2℃~8℃保存，以供下次使用，同時檢查剩余試劑是否足夠備份，如不足，應(yīng)提前稀釋準(zhǔn)備；b)檢查、關(guān)閉儀器設(shè)備，并進(jìn)行表面清潔，75%酒精消毒處理；c)擦洗實驗臺面，75%酒精表面消毒；d)將實驗臺面上的耗材、槍頭盒等碼放整齊；e)進(jìn)行實驗記錄。8iFISH腫瘤細(xì)胞檢測方法8.1檢測原理iFISH腫瘤細(xì)胞檢測原理參考附錄A。8.2檢測前準(zhǔn)備工作按照表3準(zhǔn)備好相應(yīng)品牌型號或符合檢測要求的儀器設(shè)備，并通過設(shè)備檢測驗證要求。實驗前應(yīng)在真空泵試劑瓶、廢液缸中倒入少量84消毒液，及時對吸棄的廢液進(jìn)行消毒。用于制片的載玻片應(yīng)使用Cyte將實驗用到的2個Coplin染色缸，0.2μL～2.0μL、2.0μL～20μL、20μL~200μL和0.2mL～1mL規(guī)格移液打開熒光染色-熒光原位雜交樣品處理試劑盒，取出緩沖液10×FR3、血細(xì)胞分析T/ZSA320-2025b)用1000mL量筒加入750mL純化水，并將上述91mL緩沖液10×FR3全部倒入其d)剪一正方形大塊封口膜，用封口膜將量筒口密封，輕柔頭尾顛倒10次以混勻試劑；e)將配制后的1×FR3洗滌液裝于干凈的1000mL試劑瓶中，2℃~8℃保存，每次分裝使用。分裝染色缸中的試劑：b)按下列順序向每個染色缸中加入40mL相應(yīng)液體：1)染色缸Ⅰ：緩沖液1×FR3，使用前于恒溫水浴鍋中預(yù)熱至37℃;每次實驗前，應(yīng)更換2個染色缸中的溶液，一個染色缸一次最多處理5張標(biāo)本。如果樣本較多，建議根據(jù)樣本量再準(zhǔn)備染色缸，缸中分裝的試劑同上。根據(jù)當(dāng)天樣本數(shù)量，做好各類試劑分裝準(zhǔn)備：a)每次實驗前取出富集預(yù)熱至27℃的適量清洗液1×CRC（30mL/樣本）；b)分裝適量緩沖液1×FR3（0.8mL/樣本）于離心管中，恒溫水浴鍋中預(yù)熱27℃;c)分裝適量樣本稀釋液FR2（180μL樣本稀釋液FR2/樣本）于恒溫水浴鍋中預(yù)熱d)分裝適量血細(xì)胞分析用稀釋液（200探針混合液配置：a)室溫融化-20℃環(huán)境中保存的CEP8探針和CEP7探針；b)將探針管分別于振蕩器上頭尾分別充分振蕩，每次振蕩不少于5s；c)高速離心5s后，再次頭尾振蕩并高速離心5s；d)按照每張標(biāo)本8μLCEP8探針和2μLCEP7探針的比例加到0.5mL離心管中，使用槍頭混勻并離心；e)2℃~8℃避光保存?zhèn)溆?，原探針管放?20℃環(huán)境中保存。收到壞死細(xì)胞熒光染色液后應(yīng)提前將壞死細(xì)胞熒光染色液按3μL/管分裝到0.5mL離心管中，摁緊管蓋，封口膜封口，置于-20℃環(huán)境中保存。每次按標(biāo)本量取用壞死細(xì)胞熒光染色液，并進(jìn)行預(yù)熱：a)水浴鍋或手心融化-20℃環(huán)境中保存的壞死細(xì)胞熒光染色液；b)將壞死細(xì)胞熒光染色液置于1.5mL離心管臺式離心機(jī)中高速離心5s；c)室溫避光放置備用。8.3iFISH腫瘤細(xì)胞檢測的總體要求8.3.1實驗全程實驗人員應(yīng)穿戴白大衣、口罩、帽子及無粉手套，保障安全，并防止唾液、頭屑等上皮細(xì)胞污染標(biāo)本。T/ZSA320-20258.3.2差相富集檢測后的細(xì)胞液應(yīng)立即執(zhí)行i?FISH腫瘤細(xì)胞檢測前半部分液染操作，整個富集檢測加上液染操作的時間約1.5h，液染后應(yīng)將細(xì)胞涂到玻片上干燥，在這之前，實驗人員不應(yīng)中途離開，實驗前應(yīng)計算好時間。8.3.3離心前應(yīng)將標(biāo)本置于配平天平上精確配平，不應(yīng)肉眼觀察離心管刻度估測配平。8.3.4整個實驗中，所有離心前的頭尾顛倒混勻、細(xì)胞吹打混勻、轉(zhuǎn)移細(xì)胞液等過程應(yīng)輕柔，注意避免起泡。8.3.5使用移液槍吸取液體或細(xì)胞時，槍頭應(yīng)從液面處先吸取，慢慢隨著液面的下降而下降；將液體或細(xì)胞打入離心管等容器中時，槍頭應(yīng)沿管壁注入，以避免起泡。8.3.6實驗過程中使用真空泵吸棄玻片上的液體時，應(yīng)將真空泵吸頭套上200μL的槍頭。吸棄時，槍頭不應(yīng)伸入標(biāo)本框內(nèi)，應(yīng)將玻片傾斜，槍頭在玻片框外吸掉流下的液體。8.3.7使用移液槍吹打細(xì)胞沉淀時，應(yīng)將槍調(diào)節(jié)成與液體相近但略小的體積，多次反復(fù)輕柔混勻沉淀。8.3.8使用可調(diào)速漩渦混合儀來震蕩混勻細(xì)胞時，震蕩速度不應(yīng)過快，應(yīng)采用低速、多次點震來混勻細(xì)胞。推薦使用SI旋渦混合儀vortex-genie2，速度調(diào)節(jié)至3時震蕩混勻細(xì)胞。8.3.9差相富集檢測后的細(xì)胞加入血細(xì)胞分析用染色液混合液孵育，F(xiàn)ISH雜交，直到最后一步，均應(yīng)避光。8.3.10整個FISH實驗過程中，除乙醇脫水，吹干標(biāo)本，其他任何步驟不應(yīng)使標(biāo)本干燥，加液洗滌應(yīng)及時。8.4iFISH腫瘤細(xì)胞檢測步驟8.4.1取按照7.5.5制備的含有棄上清后100μL細(xì)胞液的離心管D，在液面加入按提前分裝好的3μL壞死細(xì)胞熒光染色液，使用振蕩混合儀輕柔振蕩混勻沉淀細(xì)胞，室溫避光孵育30min，15min時使用振蕩混合儀輕柔振蕩混勻沉淀細(xì)胞。于管中加入1mL清洗液1×CRC，使用1mL移液槍混勻，轉(zhuǎn)移至新的15mL離心管中，補(bǔ)加清洗液1×CRC至148.4.2在上述液面加入2μL抗原修復(fù)緩沖液，使用可調(diào)節(jié)速度振蕩混合儀輕柔振蕩混勻沉8.4.3靜置過程中由雙人配制血細(xì)胞分析用染色液混合液（時間不夠可在實驗前配好a)在配制血細(xì)胞分析用染色液混合液前，取來碎冰，將血細(xì)胞分析用染色液離心后插到碎冰上取用。取用完立即放回冰箱2℃~8℃保存，以避免反復(fù)室溫取用可能引起抗體失活；b)從冰箱取出染色液保存管于1.5mL離心管臺式離心機(jī)中高速離心5s；c)2℃~8℃條件下吸取染色液，按每張玻片計算，200μL血細(xì)胞分析用稀釋液+1μL血細(xì)胞分析用染色液A01(CD45)+1μL血細(xì)胞分析用染色液C06(CD31)+1μL血細(xì)胞分析用染色液B13(PD-L1)；d)使用加樣器輕柔吹打10次以充分混勻抗體，不應(yīng)起泡；e)將配制后的血細(xì)胞分析用染色液混合液室溫避光放置。T/ZSA320-20258.4.4在避光環(huán)境中在細(xì)胞液中加入全部200μL上述血細(xì)胞分析用染色液混合液，使用振蕩混合儀輕柔振蕩混勻沉淀細(xì)胞（避免起泡室溫避光孵育20min。玻片/人份置于1.5mL離心管中，立即蓋上管蓋。相關(guān)要求如下：a)由于注射器抽取液體不精確，為避免反復(fù)抽取，每張玻片可取出100μL～150μL固定液；b)如因瓶內(nèi)真空而抽不出液體，使用注射器打入少量空氣。使用完畢后，將剩余固定液棄去，不應(yīng)打回至原包裝瓶內(nèi)；c)1mL注射器用純化水反復(fù)洗滌并晾干后可反復(fù)使用。8.4.7將上述100μL細(xì)胞液輕輕吹打混勻（保留加樣器槍頭）后加入100μL組織固定液CytelligenFixative，并使用保留的加樣器槍頭輕柔吹打混勻。將每管標(biāo)本液體分別涂于Cytelligen載玻片標(biāo)本框內(nèi)（1人份/玻片），小心輕輕放于干燥箱中，按照步驟8.4.8進(jìn)行標(biāo)本避光干燥。具體操作要求如下：a)加組織固定液之前應(yīng)先充分吹打混勻細(xì)胞，估算沉淀體積，再加入等量組織固定液，組織固定液的量可比細(xì)胞液多10μL～20μL，不應(yīng)少于細(xì)胞液；b)不應(yīng)將細(xì)胞液涂于框外，建議細(xì)胞液加組織固定液不超過250μL；c)標(biāo)本干燥時應(yīng)將標(biāo)本放于干燥箱的鐵架上，鐵架置于干燥箱中央，不應(yīng)將標(biāo)本置于底部加熱板上。8.4.8標(biāo)本干燥與保存：將標(biāo)本放置30℃~32℃干燥箱避光過夜。全程不開鼓風(fēng)，打開頂置通風(fēng)口，第二天關(guān)閉干燥箱溫度后將標(biāo)本繼續(xù)靜置于干燥箱中30min涼至室溫，立即進(jìn)行后續(xù)FISH檢測。相關(guān)要求如下：a)標(biāo)本放于干燥箱干燥的時間不應(yīng)短于10h，否則影響干燥效果，造成細(xì)胞脫落；最長不應(yīng)超過25h，否則易造成標(biāo)本背景增高；b)當(dāng)夏天環(huán)境溫度高于干燥箱設(shè)定的30℃~32℃時，干燥箱會停止運轉(zhuǎn)，建議將室內(nèi)空調(diào)溫度調(diào)節(jié)至25℃。如室內(nèi)沒有空調(diào)設(shè)施，可將標(biāo)本放置35℃干燥箱中；c)如果干燥箱過夜干燥后，因各種原因無法進(jìn)行后續(xù)FISH檢測，應(yīng)將干燥后的標(biāo)本放于冰箱2℃~8℃避光保存，保存時間不應(yīng)超過48h。2℃~8℃冰箱保存的標(biāo)本取出后按照以上干燥條件重新干燥后進(jìn)行FISH操作；d)做FISH檢測前應(yīng)觀察細(xì)胞干燥效果：1)正常的干燥效果：標(biāo)本區(qū)干燥、泛白，邊緣有時存在顆粒狀的現(xiàn)象；2)干燥不完全：標(biāo)本區(qū)濕潤，甚至出現(xiàn)明顯的油狀或液滴狀，應(yīng)檢查干燥箱內(nèi)實際溫度是否達(dá)到設(shè)置溫度，如干燥箱正常，則適當(dāng)提高1℃~2℃。對于未干燥的標(biāo)本用調(diào)整后的溫度干燥至少3h或過夜干燥。8.4.9標(biāo)本干燥后，先進(jìn)行上述實驗前準(zhǔn)備（試劑、分裝、預(yù)熱等然后將干燥箱關(guān)閉，將標(biāo)本繼續(xù)靜置于干燥箱中30min涼至室溫（最長不超過1h），進(jìn)行以下操作：a)使用1.5mL離心管離心機(jī)室溫高速離心組織固定液FR1管10s；b)按每張玻片計算取液：20μL組織固定液FR1+180μL樣本稀釋液FR2（取用前從37℃水浴中取出，確保已預(yù)熱至37℃),置于振蕩器上充分振蕩混勻；c)混合液配制好后立即加入標(biāo)本上：沿CytelligenCTC載玻片標(biāo)本框內(nèi)側(cè)邊角輕柔滴加200μL混合液覆蓋標(biāo)本框，不應(yīng)將液體滴于標(biāo)本框外，如液體不能覆蓋整個標(biāo)本框，使用槍頭平推液體，槍頭不應(yīng)觸碰玻片上的細(xì)胞；T/ZSA320-20258.4.10沿標(biāo)本框內(nèi)側(cè)邊角輕柔滴加200μL緩沖液1×FR3后，立即吸棄溶液，共重復(fù)28.4.11沿標(biāo)本框內(nèi)側(cè)邊角輕柔滴加200μL緩沖液1×FR3，室溫靜置2min，吸棄溶液，共重復(fù)2次。沿標(biāo)本框內(nèi)側(cè)邊角輕柔滴加200μL無水乙醇后，立即吸棄，共重復(fù)2次。8.4.12將玻片插入染色缸Ⅱ（無水乙醇）中靜置2min。取出玻片，豎立在濾紙上完全吸干玻片流下的殘留液，并使用微型吹風(fēng)機(jī)將玻片輕柔吹至完全干燥后，立即按8.4.13滴加探針。多張玻片操作時可先取出2張玻片，剩余玻片應(yīng)一直保存在染色缸Ⅱ（無水乙醇）中，直至先取出的2張玻片干燥、加上探針并置放好蓋玻片。8.4.13在避光環(huán)境中從2℃~8℃存儲環(huán)境中取出分裝好的探針混合液，在標(biāo)本框中央滴加10μL探針后（不應(yīng)起泡），立即使用鑷子將蓋玻片平放在探針液上，使液體向四周蔓延至整個標(biāo)本框（不應(yīng)起泡)。如果需要，可輕按蓋玻片以使探針液覆蓋整個標(biāo)本框。8.4.14封片：剪去1mL加樣器尖頭，每張玻片使用250μL（或更多）封片膠封住蓋玻片四邊邊緣后，直接放入雜交儀，不需等待封片膠干燥。使用封片膠封片時，應(yīng)將蓋玻片與載玻片的縫隙處全部封好，以防雜交過程中探針干涸。8.4.15將玻片平放于雜交儀中，放入濕條，設(shè)置雜交條件：8.4.16雜交完畢取出玻片，并進(jìn)行如下操作：a)用手輕按蓋玻片一角，使用鑷子撕去封片膠,不應(yīng)掀動蓋玻片；缸Ⅰ,直至蓋玻片脫落。如蓋玻片不易脫落，使用鑷子輕推至蓋玻片松動，繼續(xù)晃c)蓋玻片脫落后，將玻片繼續(xù)在染d)取出玻片，使用濾紙吸干玻片流下的殘留液，并擦干標(biāo)本框外圍液體。8.4.17沿標(biāo)本框內(nèi)側(cè)邊角輕柔滴加200μL清洗液后，立即吸棄溶液，共重復(fù)2次；沿標(biāo)本框內(nèi)側(cè)邊角輕柔滴加200μL清洗液，室溫靜置2min，吸干溶液，使用吹風(fēng)機(jī)將玻片標(biāo)本框吹干。8.4.18將血細(xì)胞分析用染色液DAPI分裝管瞬時高速離心，取10μL血細(xì)胞分析用染色液DAPI滴加于標(biāo)本框中央，置放蓋玻片后，一手固定蓋玻片防止其滑動，另一手用真空泵吸頭或濾紙擠壓并吸干溢出的多余液體，封干標(biāo)本，不應(yīng)出現(xiàn)氣泡。封干后使用封片膠將蓋玻片的四個邊角封住，以防玻片滑落。操作過程中應(yīng)注意如下事項：a)血細(xì)胞分析用染色液DAPI比較粘稠，應(yīng)慢慢取出；b)如果觀察到槍頭外壁沾有血細(xì)胞分析用染色液DAPI，應(yīng)將保存液沾到血細(xì)胞分析用染色液DAPI分裝管管壁上，以免造成試劑損失，不夠量。8.4.19立即將玻片置于數(shù)字病理掃描儀中，并設(shè)置全自動掃描，為避免FISH信號及抗體染色熒光減弱，標(biāo)本應(yīng)在一周內(nèi)完成檢測。在熒光顯微鏡上反復(fù)觀察標(biāo)本會使熒光淬滅，人工讀片應(yīng)在第一次讀片時儲存細(xì)胞圖片。8.4.20i?FISH腫瘤細(xì)胞檢測流程按附錄C操作。8.4.21實驗結(jié)束后，應(yīng)進(jìn)行如下操作：a)將分裝未用完的試劑放入冰箱2℃~8℃保存，以供下次使用，同時檢查剩余試劑是否足夠備份，如不足，則提前稀釋準(zhǔn)備；b)檢查、關(guān)閉儀器設(shè)備，并進(jìn)行表面清潔，75%酒精消毒處理；T/ZSA320-2025c)擦洗實驗臺面，75%酒精表面消毒；d)將實驗臺面上的耗材、槍頭盒等碼放整齊；e)進(jìn)行實驗記錄。9識別指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn)9.1識別指標(biāo)完成i?FISH檢測的細(xì)胞包含7項識別指標(biāo)。a)CD45：紅色通道。大多呈現(xiàn)圍繞細(xì)胞核的完整的或部分的環(huán)狀染色，白細(xì)胞陽性，b)CEP8：橙色通道。點狀著色，每個點代表一條8號染色體，白細(xì)胞絕大多數(shù)染色c)CEP7：綠色通道。點狀著色，每個點代表一條7號染色體，內(nèi)參對照探針，細(xì)胞大多數(shù)有2個及以上染色體信號；d)PD-L1：綠色通道?？沙尸F(xiàn)細(xì)胞整體染色或圍繞細(xì)胞核的環(huán)狀染色，白細(xì)胞、CTC、CTEC均可能有陽性；e)CD31：Cy5通道。大多呈現(xiàn)圍繞細(xì)胞核的完整的或部分的環(huán)狀染色，CTEC陽性，CTC陰性，白細(xì)胞絕大多數(shù)陰性。同時CD31與血小板結(jié)合，黃光下有成簇點狀背景染色；f)DAPI：藍(lán)色通道。大多呈現(xiàn)圓或橢圓形整體染色，所有細(xì)胞均陽性；g)NCS：Cy7通道?？沙尸F(xiàn)各種類型的染色：如細(xì)胞核內(nèi)點狀或塊狀染色、圍繞細(xì)胞核的完整的或部分的環(huán)狀染色，白細(xì)胞、CTC、CTEC均可能有陽性。9.2CTC判斷標(biāo)準(zhǔn)通道下壞死細(xì)胞染色陽性，即為死細(xì)胞CTC；如果Cy7通道下壞死細(xì)胞染色陰性，即為活9.3CTEC判斷標(biāo)準(zhǔn)通道下壞死細(xì)胞染料陽性，即為死細(xì)胞CTEC；如果Cy7通道下壞死細(xì)胞染料陰性，即為活細(xì)胞CTEC。9.4數(shù)字病理掃描儀識別標(biāo)準(zhǔn)數(shù)字病理掃描儀識別標(biāo)準(zhǔn)按照附錄D。10檢測報告檢測后應(yīng)詳細(xì)記錄檢驗結(jié)果并輸出檢測報告，檢測報告應(yīng)至少包含如下內(nèi)容：c)判定標(biāo)準(zhǔn)；e)腫瘤患者檢測結(jié)果提示；f)健康人群檢測結(jié)果建議。T/ZSA320-202511質(zhì)量控制與安全要求11.1質(zhì)量控制11.1.1差相富集檢測應(yīng)嚴(yán)格按照第7章的要求進(jìn)行檢測。11.1.2i?FISH腫瘤細(xì)胞檢測應(yīng)嚴(yán)格按照第8章要求進(jìn)行檢測。如玻片中間區(qū)域20x鏡下絕大部分視野小于5個細(xì)胞（如圖5（a或存在大片區(qū)域的細(xì)胞團(tuán)聚或疊層（如圖5（b則檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，在排除操作失誤的前提下，應(yīng)考慮治療因素及個體差異，決定是否重新檢測。圖5讀片細(xì)胞數(shù)目異常示意圖如樣本出現(xiàn)探針異常，大部分區(qū)域應(yīng)無探針或探針信號弱，影響細(xì)胞識別。產(chǎn)生的原因如下：a)人工因素：未2次充分震蕩、混勻探針或加錯試劑；b)血樣個體差異因素：細(xì)胞剩余過多導(dǎo)致探針雜交效果不佳。免疫熒光染色異常紅色、綠色等通道無相關(guān)細(xì)胞染色或背景，應(yīng)考慮未加或加錯相關(guān)抗體。11.2安全要求實驗室安全管理及工作人員行為應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。11.2.2個人安全防護(hù)實驗室工作人員在工作期間基本采用一級生物安全防護(hù)措施，穿工作服，戴醫(yī)用外科口T/ZSA320-2025罩、乳膠手套，為防止標(biāo)本離心后產(chǎn)生的氣溶膠，應(yīng)戴防護(hù)帽及護(hù)目鏡。工作完畢后脫手套，帽子，口罩及護(hù)目鏡，進(jìn)行手衛(wèi)生。11.2.3試劑材料防污染應(yīng)對實驗室進(jìn)行功能分區(qū)，各區(qū)的工作服實驗用具和實驗記錄本應(yīng)區(qū)分標(biāo)記，不應(yīng)混用。注意因交談或其他活動造成的飛沫、落塵帶入的污染，必要的情況下在超凈工作臺中進(jìn)行操作。11.2.4標(biāo)本離心處理為防止離心開蓋后可能的氣溶膠，標(biāo)本離心結(jié)束后打開試管蓋時動作應(yīng)輕柔緩慢，和操作者面部應(yīng)保持距離。盡可能縮短打開的持續(xù)時間。盡可能避免產(chǎn)生氣溶膠。標(biāo)本按檢測項目和工作分工，將標(biāo)本送抵相應(yīng)實驗區(qū)操作臺進(jìn)行待檢或處理。標(biāo)本如若離心后管破損或碎裂造成離心機(jī)適配器及內(nèi)腔污染，則立即使用消毒液或75%酒精進(jìn)行消毒（消毒液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，24h內(nèi)使用）。11.2.5標(biāo)本檢驗及后處理待檢標(biāo)本應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，操作人員應(yīng)全程穿工作服，戴口罩（根據(jù)防護(hù)要求佩戴帽子，護(hù)目鏡）。檢測完畢的空采血管置于2℃~8℃環(huán)境中保存14天。操作區(qū)應(yīng)有專門的固體和液體廢棄物收集容器，所有醫(yī)用廢棄物品應(yīng)放在專用密閉防漏的容器內(nèi)儲存，等待專人收集運輸及處理。11.2.7實驗室清潔與消毒實驗室的清潔與消毒應(yīng)滿足下列要求：a)實驗室保持每日通風(fēng)；b)每天工作完畢后使用500mg/L有效氯的消毒液或75%乙醇進(jìn)行桌面、臺面及地面消毒。消毒液新鮮配置，不超過24h；c)每天離心機(jī)用畢后需用酒精擦拭內(nèi)腔；d)對于濺灑的標(biāo)本，局部污染區(qū)進(jìn)行消毒。1)先用面巾紙吸附濺灑物；2)然后用75%酒精或有效氯含量為3000mg/L的含氯消毒劑進(jìn)行覆蓋；3)停留污染區(qū)至少5min進(jìn)行消毒。T/ZSA320-2025附錄A檢測原理A.1檢測原理A.1.1概述CD31陽性及陰性循環(huán)異倍體腫瘤細(xì)胞檢測主要分為循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC及循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞CTEC的分離和鑒別兩個方面。本方法采用差相富集分離技術(shù)將外周血或其他生物體液（胸腹水、骨髓、尿液、腦脊液、淋巴穿刺標(biāo)本等）中的腫瘤細(xì)胞分離出來，采用i?FISH腫瘤細(xì)胞鑒定技術(shù)鑒別CTC及CTEC。A.1.2差相富集分離技術(shù)應(yīng)用非血源性細(xì)胞的特殊離心介質(zhì)及偶聯(lián)抗人白細(xì)胞表面抗原的特殊單克隆抗體組合群的免疫磁微?？焖俑咝コ庵苎械募t細(xì)胞、白細(xì)胞，富集病人外周血標(biāo)本中的循環(huán)稀有細(xì)胞，包括來源于所有不同組織實體瘤的CTC、腫瘤血管的CTEC及干細(xì)胞等。A.1.3iFISH腫瘤細(xì)胞鑒定技術(shù)用于檢測人或腫瘤動物模型（鼠）外周血中富集的循環(huán)稀有細(xì)胞CTC和CTEC。將免疫熒光染色CD45/CD31/腫瘤標(biāo)志物與人8號染色體熒光原位雜交技術(shù)整合為同步實施的i?FISH平臺，在CD45區(qū)分血源性與非血源性細(xì)胞的基礎(chǔ)上，CD31進(jìn)一步區(qū)分非血源性細(xì)胞是否是內(nèi)皮來源，同時根據(jù)腫瘤標(biāo)志物和8號染色體倍體進(jìn)一步判斷該細(xì)胞是否為腫瘤細(xì)胞：a)非血源性非內(nèi)皮來源腫瘤細(xì)胞即為CTC；b)非血源性內(nèi)皮來源腫瘤細(xì)胞即為CTEC。T/ZSA320-2025附錄B人外周血C