基因工程實驗基本操作指南基因工程實驗通過定向改造核酸分子實現(xiàn)生物性狀的精準(zhǔn)調(diào)控，其操作的規(guī)范性與細(xì)節(jié)把控直接決定實驗成敗。本指南聚焦基礎(chǔ)實驗流程，從樣本處理到產(chǎn)物分析，梳理關(guān)鍵操作邏輯與質(zhì)控要點，為科研實踐提供可落地的技術(shù)參考。一、實驗前的準(zhǔn)備工作（一）環(huán)境與器材準(zhǔn)備基因工程實驗對無菌、無核酸污染的環(huán)境要求嚴(yán)苛：超凈工作臺需提前開啟紫外燈照射30分鐘（操作前通風(fēng)15分鐘）；PCR操作區(qū)需獨立設(shè)置，避免擴增產(chǎn)物“氣溶膠污染”模板。移液器、離心機等儀器需定期校準(zhǔn)；微量離心管、吸頭經(jīng)高壓滅菌（121℃，20分鐘），槍頭盒、離心管架用75%乙醇擦拭消毒。（二）試劑與耗材準(zhǔn)備1.核酸相關(guān)試劑：根據(jù)實驗需求配制/購買DNA提取試劑盒、PCR預(yù)混液（含Taq酶、dNTP、緩沖液）、限制性內(nèi)切酶（及配套緩沖液）、T4DNA連接酶、瓊脂糖等。酶類需-20℃保存，避免反復(fù)凍融。2.載體與宿主菌：常用載體（如pUC、pET系列）需經(jīng)質(zhì)粒提取后定量；宿主菌（如*E.coli*DH5α、BL21）需新鮮活化（-80℃凍存菌需提前復(fù)蘇并劃板培養(yǎng)）。二、核酸的分離與擴增（一）基因組DNA/質(zhì)粒提取1.植物基因組DNA提取（CTAB法）稱取0.1g新鮮組織，液氮研磨成粉后加入600μL預(yù)熱的CTAB提取液（含β-巰基乙醇），65℃水浴30分鐘（期間輕柔顛倒混勻）。加入等體積氯仿-異戊醇（24:1），渦旋后____rpm離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至新管。加0.6倍體積異丙醇，-20℃靜置30分鐘沉淀DNA；____rpm離心10分鐘，棄上清后用70%乙醇洗滌沉淀2次，晾干后用TE緩沖液溶解。用Nanodrop檢測濃度與純度（理想值：OD???/???≈1.8，OD???/???≈2.0）。2.質(zhì)粒DNA提取（小量法）挑取單菌落接種于5mL含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12~16小時。取1.5mL菌液，____rpm離心1分鐘，棄上清后加250μL溶液I（含RNaseA）重懸菌體。加250μL溶液II（溫和顛倒混勻，室溫靜置5分鐘，勿劇烈振蕩），再加350μL溶液III，顛倒混勻至出現(xiàn)絮狀沉淀，____rpm離心10分鐘。取上清過柱，按試劑盒說明洗滌、洗脫，最終用TE或ddH?O溶解質(zhì)粒，電泳或定量檢測。（二）PCR擴增技術(shù)1.反應(yīng)體系設(shè)計（以20μL為例）模板DNA（質(zhì)?！?0ng，基因組≤100ng）、10μL2×PCR預(yù)混液、上下游引物（各0.5μL，10μM）、ddH?O補至體積。2.程序設(shè)置（通用模板）預(yù)變性：95℃3分鐘；循環(huán)（25~35次）：95℃30秒（變性）→*Tm*℃30秒（退火，依引物Tm值調(diào)整）→72℃*n*分鐘（延伸，1kb/min）；終延伸：72℃5分鐘；4℃保存。3.質(zhì)控要點設(shè)置陰性對照（模板換ddH?O），引物需經(jīng)PAGE純化；若條帶模糊，可調(diào)整退火溫度梯度（±5℃）或增加模板量。三、核酸的酶切與連接（一）限制性內(nèi)切酶酶切1.酶切體系（50μL）質(zhì)粒DNA（1~5μg）、10×酶切緩沖液5μL、內(nèi)切酶（1~2μL，單位數(shù)依酶活性）、ddH?O補至體積。2.反應(yīng)條件37℃水浴1~4小時（依酶說明書）；雙酶切若緩沖液兼容，可同時加兩種酶；若不兼容，先低鹽酶后高鹽酶（中間換緩沖液）。3.產(chǎn)物檢測取5μL酶切液進(jìn)行瓊脂糖電泳（1%膠，80V電泳30分鐘），觀察載體骨架與插入片段是否分離。（二）T4DNA連接1.連接體系（20μL）線性化載體（≤0.1pmol）、插入片段（3~10倍載體摩爾數(shù)）、10×連接緩沖液2μL、T4連接酶（1μL，200U/μL）、ddH?O補至體積。2.反應(yīng)條件粘性末端：16℃過夜；平末端：22℃2小時（快速連接可25℃30分鐘，但效率略低）。3.優(yōu)化策略載體需去磷酸化（用CIAP酶）避免自連；插入片段與載體的摩爾比可通過核酸濃度計算：*摩爾數(shù)（pmol）=(ng×10??)/(bp×660)*，確保片段量為載體的3~10倍。四、重組載體的轉(zhuǎn)化與篩選（一）感受態(tài)細(xì)胞制備（CaCl?法）挑取*E.coli*單菌落接種于5mLLB，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???≈0.4~0.6。菌液冰浴30分鐘，4℃4000rpm離心10分鐘，棄上清后用預(yù)冷的0.1MCaCl?重懸菌體，冰浴30分鐘。再次離心后，用含15%甘油的0.1MCaCl?重懸，分裝后-80℃保存。（二）熱激轉(zhuǎn)化取50μL感受態(tài)細(xì)胞，加入5μL連接產(chǎn)物（或質(zhì)粒對照），冰浴30分鐘。42℃熱激90秒（精確計時），迅速冰浴2分鐘。加450μL無抗LB，37℃振蕩培養(yǎng)1小時（復(fù)蘇）。取100μL菌液涂布于含抗生素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12~16小時。（三）陽性克隆篩選1.菌落PCR：挑取單菌落至10μLddH?O，煮沸5分鐘裂解，取1μL作為模板，用載體通用引物（如M13）或插入片段特異性引物PCR，電泳檢測條帶大小。2.酶切驗證：挑取陽性菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用原酶切體系酶切，電泳觀察載體與插入片段條帶。3.測序驗證：將陽性質(zhì)粒送測序，比對序列確保無突變或移碼。五、蛋白表達(dá)與檢測（可選）（一）原核表達(dá)誘導(dǎo)挑取含重組質(zhì)粒的BL21菌，接種于含抗生素的LB，37℃培養(yǎng)至OD???≈0.6。加IPTG（終濃度0.1~1mM），20~37℃振蕩培養(yǎng)3~6小時（低溫利于可溶性表達(dá)）。（二）蛋白檢測1.SDS：收集菌液，超聲破碎（冰浴，功率30%，工作3秒停5秒，總時間5分鐘），____rpm離心10分鐘，取上清與沉淀分別上樣，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察目的條帶。2.WesternBlot：蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1小時，加一抗（4℃過夜），TBST洗膜后加二抗（室溫1小時），ECL發(fā)光顯影。六、實驗安全與規(guī)范1.生物安全：宿主菌、重組菌需經(jīng)高壓滅菌（121℃，20分鐘）后處理；操作時佩戴手套、口罩，防止氣溶膠吸入。2.試劑安全：EB（溴化乙錠）、DMSO等有毒試劑需妥善保存，操作時戴手套；酶類、核酸染料避免接觸皮膚與黏膜。3.數(shù)據(jù)記錄：實驗過程需詳細(xì)記錄試劑批號、反應(yīng)條件、電泳結(jié)果等，原始數(shù)據(jù)（如凝膠