成纖維細胞生長因子對軟骨細胞中長鏈非編碼RNAMalat1的調(diào)控機制與影響探究一、引言1.1研究背景與意義骨骼的生長發(fā)育是一個復(fù)雜且有序的生理過程，對維持人體正常的生理功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。在這一過程中，軟骨內(nèi)成骨發(fā)揮著核心作用，尤其是在長骨的發(fā)育過程中，間充質(zhì)細胞首先分化形成軟骨雛形，隨后軟骨細胞經(jīng)歷增殖、肥大、凋亡等一系列變化，軟骨逐漸被骨組織替代，最終完成骨骼的發(fā)育。長骨的生長主要依靠骺軟骨的不斷增殖與骨化，在兒童青少年時期，骺軟骨活躍，使得長骨不斷加長，直至17-20歲左右，骺軟骨停止增長并骨化，長骨不再生長。如股骨、肱骨等長骨的發(fā)育，均遵循軟骨內(nèi)成骨這一方式。成纖維細胞生長因子（FibroblastGrowthFactor，F(xiàn)GF）家族在骨骼生長發(fā)育以及軟骨內(nèi)成骨過程中扮演著不可或缺的角色。FGF家族由18個包含β-trefoil同源結(jié)構(gòu)域的多肽構(gòu)成，分為5個旁分泌亞家族和1個內(nèi)分泌亞家族。旁分泌亞家族在胚胎發(fā)育過程中調(diào)控多個重要事件，內(nèi)分泌亞家族成員（FGF19、FGF21和FGF23）則是機體調(diào)節(jié)膽汁酸、脂質(zhì)、葡萄糖、維生素D和礦物質(zhì)離子穩(wěn)態(tài)的重要激素，同時也是治療一系列代謝性疾病的重要靶點。FGF通過結(jié)合并二聚化單次跨膜型FGF受體酪氨酸激酶（FGFR1-3的b和c亞型以及FGFR4）來發(fā)揮其對生命活動的調(diào)控功能。在骨骼發(fā)育中，F(xiàn)GF信號通路參與調(diào)節(jié)軟骨細胞的增殖、分化和凋亡等過程。例如，F(xiàn)GF可促進軟骨細胞的增殖，維持軟骨細胞的表型穩(wěn)定，對軟骨內(nèi)成骨的正常進行具有關(guān)鍵意義。若FGF信號通路出現(xiàn)異常，可能導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常，如侏儒癥等疾病，患者表現(xiàn)為身材矮小、四肢短小等癥狀，這與FGF信號通路對骨骼生長發(fā)育的調(diào)控失常密切相關(guān)。長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸且不翻譯成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在骨骼發(fā)育和軟骨內(nèi)成骨中也具有重要調(diào)控作用。Malat1（metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1），即肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1，是一種高度保守的核內(nèi)長鏈非編碼RNA。盡管最初對Malat1的研究主要集中在癌癥轉(zhuǎn)移領(lǐng)域，但其在骨骼系統(tǒng)中的功能也逐漸受到關(guān)注。在破骨細胞生成過程中，研究發(fā)現(xiàn)Malat1的表達會發(fā)生變化，這暗示著其可能參與骨代謝的調(diào)節(jié)。在骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜中，Malat1表達上調(diào)，且與滑膜細胞的增殖和凋亡相關(guān)，進一步表明其在關(guān)節(jié)疾病中的潛在作用。然而，目前關(guān)于Malat1在軟骨細胞中的功能及機制研究相對較少，尤其是其與FGF在軟骨內(nèi)成骨過程中的相互作用關(guān)系尚不明確。深入研究FGF對長鏈非編碼RNAMalat1在軟骨細胞中的影響，對于我們?nèi)胬斫廛浌前l(fā)育以及軟骨內(nèi)成骨的分子機制具有重要意義。這不僅有助于揭示骨骼生長發(fā)育的奧秘，還能為相關(guān)骨骼疾病的發(fā)病機制研究提供新的視角。從臨床應(yīng)用角度來看，明確FGF與Malat1在軟骨細胞中的作用關(guān)系，可能為開發(fā)針對骨骼發(fā)育異常疾病和軟骨損傷相關(guān)疾病的新型治療策略提供理論依據(jù)，為患者帶來新的治療希望。例如，通過調(diào)節(jié)FGF-Malat1信號軸，有可能實現(xiàn)對軟骨細胞功能的精準調(diào)控，從而促進軟骨修復(fù)和再生，改善患者的病情。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在成纖維細胞生長因子（FGF）信號通路的研究方面，國外起步較早，對其在胚胎發(fā)育、細胞增殖分化等過程中的作用機制進行了深入探索。例如，早在20世紀80年代，就有研究發(fā)現(xiàn)FGF能夠促進中胚層細胞的生長和分化。后續(xù)研究進一步揭示了FGF家族不同成員的功能差異，以及它們通過與FGFR結(jié)合激活下游RAS-MAPK、PI3K-AKT等多條信號通路來調(diào)控細胞活動。在骨骼發(fā)育領(lǐng)域，國外學(xué)者利用基因敲除小鼠模型，深入研究了FGF信號通路對軟骨細胞增殖、分化和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)FGF信號通路的異常會導(dǎo)致多種骨骼發(fā)育畸形。國內(nèi)在FGF信號通路研究方面也取得了顯著進展，溫州醫(yī)科大學(xué)李校堃/陳高幟團隊在2023年揭示了Klotho蛋白和HS作為共受體協(xié)同介導(dǎo)內(nèi)分泌FGF結(jié)合FGFR形成不對稱1:2FGF–FGFR二聚體從而激活下游信號通路的分子機制，這一成果為糖尿病、慢性腎病等代謝性疾病的藥物研發(fā)提供了重要的結(jié)構(gòu)信息，豐富了FGF調(diào)控信號的理論認知。關(guān)于長鏈非編碼RNAMalat1的研究，起初主要集中在癌癥領(lǐng)域。2018年，中科院大連化物所樸海龍研究員帶領(lǐng)的團隊與美國MD安德森癌癥中心LiMa教授團隊合作，通過高度嚴謹?shù)姆肿舆z傳學(xué)方法，揭示了Malat1在癌癥轉(zhuǎn)移中令人意外的轉(zhuǎn)移抑制功能，顛覆了之前認為其是癌癥轉(zhuǎn)移啟動子的結(jié)論，為癌癥治療相關(guān)研究提供了新的方向。隨著研究的不斷拓展，Malat1在其他生理病理過程中的作用也逐漸被關(guān)注。在骨代謝方面，有研究發(fā)現(xiàn)Malat1在破骨細胞生成過程中表達下調(diào)，并且通過構(gòu)建Malat1敲除小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型，證實了Malat1具有預(yù)防骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移的作用。在關(guān)節(jié)疾病研究中，國內(nèi)有研究表明Malat1在骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜中表達上調(diào)，通過抑制miR-124的表達，促進滑膜成纖維細胞的增殖和遷移，加速滑膜損傷，但對于Malat1在軟骨細胞中的具體功能及作用機制，仍有待進一步深入研究。在FGF與Malat1在軟骨細胞中的關(guān)系研究方面，目前相關(guān)報道較少，還處于探索階段。雖然FGF信號通路和Malat1各自在軟骨發(fā)育和其他生理病理過程中的作用已被部分揭示，但二者之間是否存在相互作用，以及這種相互作用如何影響軟骨細胞的功能和軟骨內(nèi)成骨過程，尚未有明確的研究結(jié)論?，F(xiàn)有的研究多是分別針對FGF信號通路和Malat1在軟骨細胞中的獨立作用，缺乏對二者關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)性研究。然而，由于FGF在骨骼發(fā)育中的關(guān)鍵作用以及Malat1在多種生理病理過程中的廣泛參與，推測二者在軟骨細胞中可能存在某種聯(lián)系，共同調(diào)控軟骨細胞的生物學(xué)行為和軟骨內(nèi)成骨過程。對這一關(guān)系的深入研究，有望為軟骨發(fā)育相關(guān)疾病的發(fā)病機制研究和治療策略開發(fā)提供新的思路和靶點。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在深入探究成纖維細胞生長因子（FGF）對軟骨細胞中長鏈非編碼RNAMalat1的影響及其潛在機制，具體研究目標和內(nèi)容如下：研究目標：明確FGF對軟骨細胞中Malat1表達的調(diào)控作用，并解析其調(diào)控的信號通路及對軟骨細胞生物學(xué)行為的影響，為深入理解軟骨發(fā)育及相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供理論基礎(chǔ)，為開發(fā)新型治療策略提供潛在靶點。研究內(nèi)容：首先，驗證FGF對軟骨細胞中Malat1表達的調(diào)控作用。通過體外培養(yǎng)軟骨細胞，利用不同濃度的FGF進行刺激處理，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和RNA原位雜交等技術(shù)，檢測Malat1在mRNA水平的表達變化；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和免疫熒光等方法，檢測與Malat1相關(guān)的蛋白表達情況，明確FGF對Malat1表達的影響規(guī)律，包括表達量的變化趨勢以及在細胞內(nèi)的定位改變。解析FGF調(diào)控軟骨細胞中Malat1表達的信號通路：運用信號通路抑制劑和激活劑，分別處理FGF刺激的軟骨細胞。例如，使用MEK抑制劑阻斷RAS-MAPK信號通路，PI3K抑制劑阻斷PI3K-AKT信號通路等，觀察Malat1表達的變化情況，確定FGF調(diào)控Malat1表達所依賴的關(guān)鍵信號通路；通過基因沉默或過表達技術(shù)，調(diào)控關(guān)鍵信號通路中的關(guān)鍵分子，進一步驗證信號通路與Malat1表達調(diào)控的關(guān)系；利用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和RNA免疫沉淀（RIP）等技術(shù)，探究信號通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與Malat1基因啟動子區(qū)域的結(jié)合情況，以及Malat1與相關(guān)蛋白的相互作用，從分子層面解析信號通路調(diào)控Malat1表達的機制。探討FGF通過調(diào)控Malat1對軟骨細胞生物學(xué)行為的影響：構(gòu)建Malat1過表達和敲低的軟骨細胞模型，在FGF刺激條件下，檢測軟骨細胞的增殖能力，可采用CCK-8法、EdU摻入實驗等方法進行檢測；分析軟骨細胞的分化情況，通過檢測軟骨細胞特異性標志物（如II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖等）的表達變化來評估；研究軟骨細胞的凋亡水平，運用流式細胞術(shù)、TUNEL染色等方法進行檢測；通過Transwell實驗等方法，觀察軟骨細胞的遷移能力變化，綜合分析FGF通過調(diào)控Malat1對軟骨細胞生物學(xué)行為的影響，揭示其在軟骨發(fā)育和相關(guān)疾病中的潛在作用機制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運用細胞實驗、動物實驗以及多種分子生物學(xué)技術(shù)，深入探究成纖維細胞生長因子（FGF）對軟骨細胞中長鏈非編碼RNAMalat1的影響。在細胞實驗方面，選用合適的軟骨細胞系（如ATDC5細胞）進行體外培養(yǎng)。首先，將細胞分為不同實驗組，分別用不同濃度的FGF（如10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）進行刺激處理，同時設(shè)置對照組，加入等量的不含F(xiàn)GF的培養(yǎng)基。處理一定時間（如24h、48h、72h）后，收集細胞樣本。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測Malat1在mRNA水平的表達變化，具體步驟如下：提取細胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用特異性引物進行qRT-PCR擴增，通過與內(nèi)參基因（如GAPDH）的比較，計算Malat1的相對表達量。采用RNA原位雜交技術(shù)，進一步確定Malat1在細胞內(nèi)的定位情況，將細胞固定在載玻片上，與標記的Malat1特異性探針進行雜交，通過顯微鏡觀察雜交信號的位置和強度。為了研究相關(guān)蛋白的表達，運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后與特異性抗體孵育，檢測與Malat1相關(guān)的蛋白表達水平；同時采用免疫熒光技術(shù)，對細胞進行固定、透化處理，與特異性抗體孵育，再加入熒光標記的二抗，通過熒光顯微鏡觀察相關(guān)蛋白在細胞內(nèi)的分布和表達情況。為了解析FGF調(diào)控軟骨細胞中Malat1表達的信號通路，運用信號通路抑制劑和激活劑分別處理FGF刺激的軟骨細胞。例如，在FGF刺激細胞前，先加入MEK抑制劑（如U0126）阻斷RAS-MAPK信號通路，或加入PI3K抑制劑（如LY294002）阻斷PI3K-AKT信號通路，然后再加入FGF刺激細胞，按照上述qRT-PCR和Westernblot方法檢測Malat1表達的變化情況。通過基因沉默技術(shù)，使用針對關(guān)鍵信號通路分子（如RAS、AKT等）的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染軟骨細胞，降低關(guān)鍵分子的表達水平，再用FGF刺激細胞，檢測Malat1表達；反之，通過過表達技術(shù)，將關(guān)鍵分子的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，提高其表達水平，進行同樣的實驗，進一步驗證信號通路與Malat1表達調(diào)控的關(guān)系。利用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，探究信號通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如Elk-1、CREB等）與Malat1基因啟動子區(qū)域的結(jié)合情況；運用RNA免疫沉淀（RIP）技術(shù)，探究Malat1與相關(guān)蛋白的相互作用，具體操作是使用針對目標蛋白的抗體進行免疫沉淀，然后對沉淀得到的RNA進行qRT-PCR或測序分析，確定與目標蛋白結(jié)合的Malat1及其相關(guān)RNA。在動物實驗方面，構(gòu)建合適的動物模型，如小鼠或大鼠的軟骨損傷模型。可通過手術(shù)方法（如切除部分膝關(guān)節(jié)軟骨）或化學(xué)誘導(dǎo)方法（如注射木瓜蛋白酶等）建立模型。將動物隨機分為不同實驗組，分別給予不同處理。例如，實驗組給予FGF局部注射或全身性給藥，對照組給予等量的生理鹽水。在不同時間點（如術(shù)后1周、2周、4周）處死動物，采集軟骨組織樣本。對軟骨組織樣本進行RNA和蛋白提取，采用qRT-PCR和Westernblot等技術(shù)，檢測Malat1及其相關(guān)信號通路分子和蛋白的表達變化。通過組織學(xué)染色（如蘇木精-伊紅染色、番紅O-固綠染色等），觀察軟骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，評估軟骨損傷和修復(fù)情況；運用免疫組化技術(shù)，檢測軟骨細胞特異性標志物以及相關(guān)信號通路分子的表達和定位，進一步驗證細胞實驗的結(jié)果。為了探討FGF通過調(diào)控Malat1對軟骨細胞生物學(xué)行為的影響，構(gòu)建Malat1過表達和敲低的軟骨細胞模型。對于Malat1過表達模型，將含有Malat1編碼序列的表達載體轉(zhuǎn)染軟骨細胞；對于Malat1敲低模型，使用針對Malat1的siRNA轉(zhuǎn)染軟骨細胞。在FGF刺激條件下，采用CCK-8法檢測軟骨細胞的增殖能力，具體操作是在不同時間點向細胞培養(yǎng)板中加入CCK-8試劑，孵育后檢測450nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值變化反映細胞增殖情況；運用EdU摻入實驗，將EdU試劑加入細胞培養(yǎng)基中，孵育后通過熒光顯微鏡觀察摻入EdU的細胞數(shù)量，進一步評估細胞增殖能力。通過檢測軟骨細胞特異性標志物（如II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖等）的表達變化來評估軟骨細胞的分化情況，可采用qRT-PCR檢測相關(guān)基因的表達，Westernblot檢測相關(guān)蛋白的表達，免疫組化觀察蛋白的定位和分布。研究軟骨細胞的凋亡水平，運用流式細胞術(shù)，將細胞用AnnexinV-FITC和PI雙染后，通過流式細胞儀檢測凋亡細胞的比例；采用TUNEL染色，對細胞進行固定、透化處理后，與TUNEL反應(yīng)液孵育，通過顯微鏡觀察凋亡細胞的數(shù)量和分布。通過Transwell實驗等方法，觀察軟骨細胞的遷移能力變化，在Transwell小室的上室加入細胞，下室加入含有FGF的培養(yǎng)基，孵育一定時間后，固定、染色遷移到下室的細胞，通過顯微鏡計數(shù)，評估細胞遷移能力。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先進行細胞培養(yǎng)和FGF刺激處理，通過qRT-PCR、RNA原位雜交、Westernblot和免疫熒光等技術(shù)檢測Malat1及相關(guān)蛋白表達；接著運用信號通路抑制劑、激活劑以及基因沉默、過表達技術(shù)，結(jié)合ChIP和RIP技術(shù)，解析FGF調(diào)控Malat1表達的信號通路；同時構(gòu)建動物模型，進行FGF處理和組織樣本采集分析；最后構(gòu)建Malat1過表達和敲低細胞模型，在FGF刺激下，通過多種實驗方法檢測軟骨細胞的增殖、分化、凋亡和遷移等生物學(xué)行為變化，綜合分析FGF對軟骨細胞中Malat1的影響及其機制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1軟骨細胞軟骨細胞是軟骨組織中唯一的細胞類型，在維持軟骨組織的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從分布位置來看，幼稚的軟骨細胞位于軟骨組織的表層，單個分布，體積較小，呈橢圓形，其長軸與軟骨表面平行。隨著位置向深層推進，軟骨細胞的體積逐漸增大，形態(tài)變?yōu)閳A形，細胞核呈圓形或卵圓形，染色淺，細胞質(zhì)弱嗜堿性，?？梢姅?shù)量不一的脂滴。成熟的軟骨細胞多以2-8個成群分布于軟骨陷窩內(nèi)，這些軟骨細胞由同一個母細胞分裂增殖而成，被稱為同源細胞群。在形態(tài)結(jié)構(gòu)上，電鏡下的軟骨細胞具有突起和皺褶，細胞質(zhì)內(nèi)含有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體。這種結(jié)構(gòu)特點與其功能密切相關(guān)，大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達的高爾基復(fù)合體表明軟骨細胞具有活躍的蛋白質(zhì)合成和分泌功能，能夠合成和分泌軟骨基質(zhì)的主要成分，如膠原蛋白、蛋白聚糖等。例如，軟骨細胞合成的II型膠原蛋白是軟骨基質(zhì)的重要組成部分，賦予軟骨一定的強度和韌性；聚集蛋白聚糖則富含糖胺聚糖，具有高度的親水性，能夠結(jié)合大量的水分，使軟骨具有良好的彈性和抗壓性，在承受壓力時，能夠通過水分的流動來緩沖壓力，保護軟骨組織免受損傷。在軟骨內(nèi)成骨過程中，軟骨細胞扮演著核心角色。在胚胎發(fā)育早期，間充質(zhì)細胞首先分化形成軟骨雛形，此時軟骨細胞處于增殖階段，通過不斷分裂增加細胞數(shù)量，使軟骨組織逐漸生長和擴展。隨著發(fā)育的進行，部分軟骨細胞開始進入肥大階段，體積顯著增大，形態(tài)發(fā)生改變，同時合成和分泌一些與軟骨礦化相關(guān)的物質(zhì)，如堿性磷酸酶、X型膠原蛋白等。堿性磷酸酶能夠水解磷酸酯，釋放出磷酸根離子，促進鈣鹽在軟骨基質(zhì)中的沉積，從而啟動軟骨的礦化過程；X型膠原蛋白則主要存在于肥大軟骨細胞周圍的基質(zhì)中，對軟骨的礦化和骨化起到重要的調(diào)節(jié)作用。隨后，肥大軟骨細胞逐漸凋亡，軟骨基質(zhì)被逐漸吸收，同時血管和骨祖細胞侵入，骨祖細胞分化為成骨細胞，開始在殘留的軟骨基質(zhì)上進行骨組織的形成，最終完成軟骨內(nèi)成骨過程。在軟骨發(fā)育過程中，軟骨細胞的正常功能對于軟骨組織的形成和生長至關(guān)重要。若軟骨細胞的增殖、分化等過程出現(xiàn)異常，可能導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全等疾病，患者表現(xiàn)為骨骼短小、肢體畸形等癥狀。在軟骨維持方面，軟骨細胞持續(xù)合成和分泌軟骨基質(zhì)成分，同時對基質(zhì)進行更新和修復(fù)，以維持軟骨組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。在軟骨損傷修復(fù)過程中，軟骨細胞也發(fā)揮著重要作用。當軟骨受到損傷時，周圍的軟骨細胞會被激活，表現(xiàn)出增殖和合成代謝增強的現(xiàn)象，試圖修復(fù)受損的軟骨組織。然而，由于軟骨組織本身的血供較差，營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)有限，軟骨細胞的修復(fù)能力相對較弱，對于較大面積或嚴重的軟骨損傷，往往難以實現(xiàn)完全修復(fù)，這也是臨床上軟骨損傷治療面臨的一大挑戰(zhàn)。2.2成纖維細胞生長因子（FGF）成纖維細胞生長因子（FibroblastGrowthFactor，F(xiàn)GF）家族是一類在生物體內(nèi)廣泛存在且功能多樣的多肽生長因子家族。該家族由18個成員構(gòu)成，這些成員都包含β-trefoil同源結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域?qū)τ贔GF發(fā)揮其生物學(xué)功能至關(guān)重要。從結(jié)構(gòu)上看，β-trefoil結(jié)構(gòu)域賦予了FGF獨特的空間構(gòu)象，使其能夠與相應(yīng)的受體特異性結(jié)合。FGF家族成員在氨基酸序列上具有一定的同源性，但又存在差異，這決定了它們在功能上既有共性又有各自的特異性。根據(jù)其作用方式和功能特點，F(xiàn)GF家族可分為5個旁分泌亞家族和1個內(nèi)分泌亞家族。旁分泌亞家族在胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，參與了多個重要事件，如細胞的增殖、分化、遷移等。在胚胎早期的中胚層形成過程中，F(xiàn)GF信號通路被激活，促進中胚層細胞的增殖和分化，為后續(xù)器官和組織的發(fā)育奠定基礎(chǔ)。內(nèi)分泌亞家族成員（FGF19、FGF21和FGF23）則作為重要的激素，在機體調(diào)節(jié)膽汁酸、脂質(zhì)、葡萄糖、維生素D和礦物質(zhì)離子穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著不可或缺的作用，同時也是治療一系列代謝性疾病的重要靶點。例如，F(xiàn)GF21能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，促進脂肪細胞對脂肪酸的攝取和氧化，降低血液中甘油三酯和膽固醇的水平，在肥胖癥和糖尿病等代謝性疾病的治療中具有潛在的應(yīng)用價值。在軟骨細胞中，F(xiàn)GF2是研究較為深入且起關(guān)鍵作用的成員之一。FGF2，也被稱為堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），它與肝素具有高親和力。在軟骨組織中，F(xiàn)GF2主要通過與特異性酪氨酸激酶受體結(jié)合來發(fā)揮作用，其主要受體包括Fgfr1和Fgfr3。Fgfr1和Fgfr3屬于單次跨膜型FGF受體酪氨酸激酶，它們在結(jié)構(gòu)上具有相似性，都包含細胞外的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。當FGF2與Fgfr1結(jié)合時，會引發(fā)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，導(dǎo)致下游信號通路的激活。研究表明，F(xiàn)GF2與Fgfr1結(jié)合可激活RAS-MAPK信號通路，該通路通過激活一系列的蛋白激酶，如RAS、RAF、MEK和ERK等，最終調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程。在軟骨細胞中，F(xiàn)GF2/Fgfr1信號通路的異常激活可能導(dǎo)致軟骨細胞過度增殖，破壞軟骨細胞正常的增殖和分化平衡，從而影響軟骨內(nèi)成骨的正常進行，導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常。而FGF2與Fgfr3結(jié)合時，則主要促進關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。FGF2與Fgfr3結(jié)合后，通過激活PI3K-AKT等信號通路，促進軟骨細胞合成和分泌軟骨基質(zhì)成分，如II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖等，同時抑制軟骨細胞的凋亡，從而促進關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和維持軟骨組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。當關(guān)節(jié)軟骨受到損傷時，F(xiàn)GF2/Fgfr3信號通路會被激活，促使軟骨細胞增殖并合成更多的軟骨基質(zhì)，以修復(fù)受損的軟骨組織。若Fgfr3基因發(fā)生突變，導(dǎo)致其功能異常，可能會影響FGF2/Fgfr3信號通路的正常激活，進而影響關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)能力，增加患骨關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾病的風(fēng)險。FGF信號通路的激活機制較為復(fù)雜。當FGF與FGFR結(jié)合后，首先會導(dǎo)致FGFR的二聚化，形成穩(wěn)定的FGF-FGFR復(fù)合物。這種二聚化使得FGFR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶活性被激活，進而磷酸化下游的信號分子。這些磷酸化的信號分子會進一步激活多條下游信號通路，如RAS-MAPK、PI3K-AKT和PLCγ等信號通路。在RAS-MAPK信號通路中，激活的FGFR通過招募適配蛋白，如生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和鳥苷酸交換因子（SOS），將RAS激活。激活的RAS進一步激活RAF激酶，RAF激酶磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶再磷酸化并激活ERK激酶。激活的ERK激酶可以進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，從而影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程。在PI3K-AKT信號通路中，激活的FGFR會招募PI3K，PI3K將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募并激活A(yù)KT激酶，AKT激酶通過磷酸化下游的多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，調(diào)節(jié)細胞的生長、存活和代謝等過程。在軟骨內(nèi)成骨過程中，F(xiàn)GF信號通路發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在軟骨內(nèi)成骨的早期階段，F(xiàn)GF信號通路促進軟骨細胞的增殖，增加軟骨細胞的數(shù)量，為軟骨組織的生長和發(fā)育提供足夠的細胞基礎(chǔ)。在軟骨細胞增殖階段，F(xiàn)GF2通過激活RAS-MAPK信號通路，促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，加速細胞從G1期進入S期，從而促進軟骨細胞的增殖。隨著軟骨內(nèi)成骨的進行，F(xiàn)GF信號通路參與調(diào)節(jié)軟骨細胞的分化。FGF2可以通過調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子的表達，如Sox9、Runx2等，來調(diào)控軟骨細胞的分化方向。Sox9是軟骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)GF2可以通過激活相關(guān)信號通路，促進Sox9的表達和活性，維持軟骨細胞的表型。而Runx2則是成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在軟骨細胞向成骨細胞分化的過程中，F(xiàn)GF信號通路的變化會影響Runx2的表達，從而調(diào)控軟骨細胞向成骨細胞的分化進程。在軟骨內(nèi)成骨的后期，F(xiàn)GF信號通路還參與調(diào)節(jié)軟骨細胞的凋亡和軟骨基質(zhì)的礦化。當軟骨細胞完成其增殖和分化任務(wù)后，F(xiàn)GF信號通路的變化會誘導(dǎo)軟骨細胞發(fā)生凋亡，為骨組織的形成騰出空間。同時，F(xiàn)GF信號通路通過調(diào)節(jié)一些與軟骨礦化相關(guān)的分子，如堿性磷酸酶、X型膠原蛋白等的表達，促進軟骨基質(zhì)的礦化，最終實現(xiàn)軟骨向骨組織的轉(zhuǎn)化。若FGF信號通路在軟骨內(nèi)成骨過程中出現(xiàn)異常，可能導(dǎo)致骨骼發(fā)育畸形，如侏儒癥、軟骨發(fā)育不全等疾病。在侏儒癥患者中，由于FGF信號通路相關(guān)基因突變，導(dǎo)致FGF信號傳遞受阻，軟骨細胞的增殖和分化受到影響，從而導(dǎo)致身材矮小、四肢短小等癥狀。2.3長鏈非編碼RNAMalat1長鏈非編碼RNAMalat1，全稱為轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1），最初是在非小細胞肺癌的研究中被發(fā)現(xiàn)。其基因定位于人染色體11q13，轉(zhuǎn)錄本長度約為8.7kb，不具有開放閱讀框架，無法編碼蛋白質(zhì)。Malat1轉(zhuǎn)錄后，主要由內(nèi)源性RNA酶RNaseP和RNaseZ進行修飾，修飾后的轉(zhuǎn)錄本3’末端缺乏多聚A尾，卻能形成獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使其免受核酸外切酶的剪切，從而保證了Malat1的穩(wěn)定性和完整性。Malat1在多種組織中廣泛表達，具有高度的保守性。在細胞內(nèi)，Malat1主要定位于細胞核的核小體核斑區(qū)，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和RNA的加工過程。研究表明，Malat1可以與多種蛋白質(zhì)和RNA相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如，Malat1可以與絲氨酸/精氨酸富集剪接因子（SRproteins）相互作用，影響mRNA前體的選擇性剪接，從而調(diào)控基因的表達。在乳腺癌細胞中，Malat1通過與SR蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的剪接，影響細胞的增殖和遷移能力。在細胞增殖、分化、凋亡等過程中，Malat1發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在腫瘤細胞中，Malat1的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。許多研究表明，Malat1在多種癌癥中高表達，如肺癌、胃癌、卵巢癌等。在肺癌細胞中，Malat1通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時抑制癌細胞的凋亡，從而加速腫瘤的發(fā)展。在骨肉瘤細胞中，Malat1的高表達與預(yù)后不良密切相關(guān)，通過敲低Malat1的表達，可以抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在骨代謝和軟骨細胞相關(guān)研究中，Malat1也逐漸受到關(guān)注。在破骨細胞生成過程中，研究發(fā)現(xiàn)Malat1的表達會發(fā)生變化。正常情況下，破骨細胞前體在巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）的刺激下，分化為成熟的破骨細胞。在這個過程中，Malat1的表達水平顯著降低。通過構(gòu)建Malat1敲除小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型，證實了Malat1具有預(yù)防骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移的作用。與野生型小鼠相比，Malat1敲除小鼠的骨密度明顯降低，破骨細胞數(shù)量增多，提示Malat1對破骨細胞的生成具有抑制作用，從而維持骨代謝的平衡。在關(guān)節(jié)疾病方面，如骨關(guān)節(jié)炎，Malat1在患者的滑膜中表達上調(diào)。骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，其主要病理特征包括關(guān)節(jié)軟骨的退變、滑膜炎癥等。研究表明，Malat1在骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細胞中高表達，通過抑制miR-124的表達，促進滑膜成纖維細胞的增殖和遷移，加速滑膜損傷。在關(guān)節(jié)軟骨細胞中，Malat1也參與了細胞凋亡和基質(zhì)降解的調(diào)控。通過雙熒光素酶報告基因試驗證實，Malat1與miR-146a存在靶向作用關(guān)系。在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織中，Malat1相對表達水平升高，miR-146a相對表達水平降低，二者呈負相關(guān)。過表達Malat1可顯著降低miR-146a的表達水平，提高細胞增殖活性并抑制其凋亡，同時降低基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）和帶有血小板凝血酶敏感蛋白結(jié)構(gòu)域的解聚素金屬蛋白酶5（ADAMTS-5）的表達水平，提升Ⅱ型膠原蛋白（COL2）和聚蛋白聚糖的表達水平，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡和基質(zhì)降解。然而，目前關(guān)于Malat1在軟骨細胞中的功能及作用機制尚未完全明確，仍有待進一步深入研究。三、FGF對軟骨細胞中Malat1表達的影響3.1實驗設(shè)計與材料方法本實驗選用ATDC5小鼠軟骨細胞系作為研究對象，該細胞系是由小鼠胚胎瘤細胞AT805衍生而來，其分化過程與軟骨形成過程十分相似，能夠很好地模擬軟骨細胞的生物學(xué)行為。將ATDC5細胞置于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期時進行后續(xù)實驗。準備不同濃度的成纖維細胞生長因子2（FGF2），設(shè)置實驗組濃度分別為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，同時設(shè)立對照組，對照組加入等量不含F(xiàn)GF2的培養(yǎng)基。將處于對數(shù)期的ATDC5細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基。實驗組分別加入含有不同濃度FGF2的培養(yǎng)基，對照組加入正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h。每個時間點和濃度組均設(shè)置3個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。在規(guī)定的培養(yǎng)時間結(jié)束后，收集細胞樣本，用于檢測Malat1的表達。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測Malat1在mRNA水平的表達變化。具體操作如下：使用Trizol試劑提取細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行qRT-PCR擴增。Malat1上游引物序列為5’-GGCTGCTTCTTCTGCTTCTG-3’，下游引物序列為5’-GCTCTGCTCTCTGCTCTCTG-3’；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’，下游引物序列為5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板2μL，加ddH?O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。通過與內(nèi)參基因GAPDH的比較，采用2?ΔΔCt法計算Malat1的相對表達量。為了進一步確定Malat1在細胞內(nèi)的定位情況，采用RNA原位雜交技術(shù)。將培養(yǎng)的ATDC5細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁并進行FGF2處理后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定15min。然后依次進行蛋白酶K消化、預(yù)雜交、雜交等步驟。雜交時，將標記的Malat1特異性探針與細胞進行雜交，42℃孵育過夜。雜交結(jié)束后，依次進行洗膜、封閉、孵育地高辛標記的抗體等操作。最后，使用NBT/BCIP顯色液顯色，通過顯微鏡觀察雜交信號的位置和強度，從而確定Malat1在細胞內(nèi)的定位。3.2實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析經(jīng)過實時熒光定量PCR檢測，對不同濃度FGF2處理下不同時間點的ATDC5細胞中Malat1的相對表達量進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖2所示。與對照組相比，在10ng/mLFGF2刺激下，24h時Malat1的相對表達量略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；48h時，Malat1相對表達量顯著升高，達到對照組的1.5倍（P<0.01）；72h時，表達量進一步上升，為對照組的2.0倍（P<0.001）。在50ng/mLFGF2刺激下，24h時Malat1相對表達量即顯著升高，達到對照組的1.8倍（P<0.001），48h時為對照組的2.5倍（P<0.001），72h時升高趨勢有所減緩，為對照組的2.8倍（P<0.001）。100ng/mLFGF2刺激時，24hMalat1相對表達量迅速升高至對照組的2.2倍（P<0.001），48h時達到3.0倍（P<0.001），72h時表達量為對照組的3.5倍（P<0.001）。整體上，隨著FGF2濃度的增加和刺激時間的延長，Malat1的表達量呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，且各濃度組在不同時間點與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明FGF2能夠顯著上調(diào)軟骨細胞中Malat1的表達，且這種上調(diào)作用具有濃度和時間依賴性。RNA原位雜交結(jié)果顯示，在對照組中，Malat1主要定位于細胞核的核小體核斑區(qū)，呈現(xiàn)出清晰的點狀雜交信號（圖3A）。當用10ng/mLFGF2刺激24h后，細胞內(nèi)Malat1的雜交信號強度略有增強（圖3B）；刺激48h后，信號強度明顯增強，且在細胞核內(nèi)的分布更為密集（圖3C）；72h時，信號強度進一步增強（圖3D）。在50ng/mLFGF2刺激下，24h時Malat1的雜交信號強度顯著增強，細胞核內(nèi)信號分布明顯增多（圖3E）；48h和72h時，信號強度持續(xù)增強，且在細胞質(zhì)中也出現(xiàn)了少量較弱的雜交信號（圖3F、3G）。100ng/mLFGF2刺激時，24h時細胞核內(nèi)Malat1的雜交信號強度急劇增強，信號點分布極為密集（圖3H）；48h和72h時，細胞核內(nèi)信號強度達到最強，細胞質(zhì)中的雜交信號也更為明顯（圖3I、3J）。RNA原位雜交結(jié)果直觀地表明，F(xiàn)GF2刺激后，Malat1在軟骨細胞內(nèi)的表達量增加，且隨著FGF2濃度的升高和刺激時間的延長，其在細胞核內(nèi)的表達更為豐富，在細胞質(zhì)中的分布也有所增加。綜上所述，本實驗通過qRT-PCR和RNA原位雜交技術(shù)，從mRNA表達水平和細胞定位兩個方面，證實了成纖維細胞生長因子2（FGF2）能夠顯著上調(diào)軟骨細胞中長鏈非編碼RNAMalat1的表達，且這種調(diào)控作用具有濃度和時間依賴性，為后續(xù)深入研究FGF調(diào)控Malat1表達的信號通路及對軟骨細胞生物學(xué)行為的影響奠定了基礎(chǔ)。3.3結(jié)果討論與分析本研究結(jié)果表明，成纖維細胞生長因子2（FGF2）能夠顯著上調(diào)軟骨細胞中長鏈非編碼RNAMalat1的表達，且這種上調(diào)作用具有濃度和時間依賴性。這一結(jié)果揭示了FGF2與Malat1在軟骨細胞中的重要關(guān)聯(lián)，為深入理解軟骨細胞的生物學(xué)行為及相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供了新的線索。FGF2抑制或促進Malat1表達的可能原因與FGF2激活的信號通路密切相關(guān)。FGF2主要通過與特異性酪氨酸激酶受體Fgfr1和Fgfr3結(jié)合來發(fā)揮作用。當FGF2與Fgfr1結(jié)合時，會激活RAS-MAPK信號通路，該通路中的一系列蛋白激酶被激活，最終調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程。在本研究中，F(xiàn)GF2上調(diào)Malat1的表達，可能是由于激活的RAS-MAPK信號通路影響了Malat1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。RAS-MAPK信號通路激活后，下游的轉(zhuǎn)錄因子如Elk-1等可能被磷酸化激活，這些激活的轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到Malat1基因的啟動子區(qū)域，促進其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致Malat1表達上調(diào)。而FGF2與Fgfr3結(jié)合時，主要激活PI3K-AKT信號通路。PI3K-AKT信號通路在細胞生長、存活和代謝等過程中發(fā)揮重要作用。FGF2通過Fgfr3激活PI3K-AKT信號通路，可能間接影響了Malat1的表達調(diào)控。例如，AKT可以磷酸化一些與RNA轉(zhuǎn)錄和加工相關(guān)的蛋白，這些蛋白的磷酸化狀態(tài)改變可能影響Malat1轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和加工過程，進而影響其表達水平。將本實驗結(jié)果與前人研究進行對比，發(fā)現(xiàn)既有一致性也存在差異。在其他細胞類型中，已有研究表明FGF信號通路與lncRNA的表達調(diào)控存在關(guān)聯(lián)。在腫瘤細胞中，F(xiàn)GF通過激活RAS-MAPK信號通路，調(diào)控某些lncRNA的表達，進而影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。這與本研究中FGF2通過激活信號通路調(diào)控Malat1表達的結(jié)果具有一致性，提示FGF信號通路對lncRNA表達調(diào)控可能存在一些保守的分子機制。然而，也存在一些差異。在破骨細胞生成過程中，研究發(fā)現(xiàn)Malat1的表達會降低，且Malat1具有預(yù)防骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移的作用。而在本研究中，軟骨細胞在FGF2刺激下Malat1表達上調(diào)，這可能是由于不同細胞類型中FGF信號通路的激活方式和下游效應(yīng)不同，以及Malat1在不同細胞中的功能特異性所導(dǎo)致。軟骨細胞和破骨細胞具有不同的生物學(xué)功能和基因表達譜，F(xiàn)GF信號通路在這兩種細胞中激活的下游分子和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在差異，從而導(dǎo)致Malat1表達的不同變化。本實驗結(jié)果對理解軟骨細胞生物學(xué)具有重要意義。從軟骨細胞增殖角度來看，F(xiàn)GF2上調(diào)Malat1的表達，可能通過影響相關(guān)基因的表達和信號通路，促進軟骨細胞的增殖。Malat1可以與多種蛋白質(zhì)和RNA相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在軟骨細胞中，Malat1可能通過與某些轉(zhuǎn)錄因子或RNA結(jié)合蛋白相互作用，調(diào)節(jié)與細胞增殖相關(guān)基因的表達，如促進細胞周期蛋白的表達，加速細胞從G1期進入S期，從而促進軟骨細胞的增殖。在軟骨細胞分化方面，F(xiàn)GF2-Malat1信號軸可能參與調(diào)控軟骨細胞的分化進程。軟骨細胞的分化是一個復(fù)雜的過程，受到多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Malat1可能通過與Sox9、Runx2等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響它們的表達和活性，從而調(diào)控軟骨細胞的分化方向。在軟骨細胞凋亡調(diào)控上，F(xiàn)GF2上調(diào)Malat1表達，可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和信號通路，抑制軟骨細胞的凋亡。Malat1可能通過與miR-146a等microRNA相互作用，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，從而影響軟骨細胞的凋亡水平。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們更深入地理解軟骨細胞的生物學(xué)行為，為進一步研究軟骨發(fā)育、維持和修復(fù)機制提供了重要的理論基礎(chǔ)，也為相關(guān)軟骨疾病的治療提供了潛在的靶點和新思路。四、FGF調(diào)控軟骨細胞中Malat1表達的機制研究4.1FGF受體及相關(guān)信號通路分析成纖維細胞生長因子（FGF）在軟骨細胞中發(fā)揮作用主要依賴于其與特異性受體的結(jié)合，進而激活下游一系列復(fù)雜的信號通路。FGF的主要受體包括Fgfr1和Fgfr3，這兩種受體在軟骨細胞中廣泛表達，且結(jié)構(gòu)上具有相似性，都屬于單次跨膜型FGF受體酪氨酸激酶，包含細胞外的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。當FGF與Fgfr1或Fgfr3結(jié)合后，會引發(fā)受體的二聚化，從而激活受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶活性，啟動下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。在FGF信號通路中，RAS-MAPK信號通路是一條重要的下游通路。當FGF與Fgfr1結(jié)合后，會招募適配蛋白生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和鳥苷酸交換因子（SOS），SOS促使RAS蛋白與三磷酸鳥苷（GTP）結(jié)合，使RAS處于激活狀態(tài)。激活的RAS進一步招募并激活RAF激酶，RAF激酶磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶再磷酸化并激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）。激活的ERK可以進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。在軟骨細胞中，RAS-MAPK信號通路的激活與細胞增殖、分化等過程密切相關(guān)。研究表明，在軟骨細胞增殖階段，激活的ERK可以促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，加速細胞從G1期進入S期，從而促進軟骨細胞的增殖。在軟骨細胞分化過程中，RAS-MAPK信號通路可以調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子的表達，如Sox9、Runx2等，影響軟骨細胞的分化方向。PI3K-AKT信號通路也是FGF信號通路的重要下游通路之一。當FGF與Fgfr3結(jié)合后，會激活PI3K，PI3K將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募并激活A(yù)KT激酶，AKT激酶通過磷酸化下游的多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，調(diào)節(jié)細胞的生長、存活和代謝等過程。在軟骨細胞中，PI3K-AKT信號通路的激活對于維持軟骨細胞的存活和正常功能至關(guān)重要。例如，激活的AKT可以抑制促凋亡蛋白Bad的活性，促進軟骨細胞的存活；同時，AKT還可以通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路，影響軟骨細胞的蛋白質(zhì)合成和代謝，維持軟骨細胞的正常功能。為了驗證這些信號通路在調(diào)控Malat1表達中的作用，我們設(shè)計了一系列實驗。首先，運用信號通路抑制劑來阻斷相關(guān)信號通路。在FGF刺激軟骨細胞前，先加入MEK抑制劑U0126阻斷RAS-MAPK信號通路，然后加入FGF刺激細胞，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測Malat1的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當RAS-MAPK信號通路被阻斷后，F(xiàn)GF對Malat1表達的上調(diào)作用明顯減弱，與未阻斷信號通路的FGF刺激組相比，Malat1的表達量顯著降低（P<0.05），表明RAS-MAPK信號通路在FGF調(diào)控Malat1表達中發(fā)揮著重要作用。同樣地，在FGF刺激軟骨細胞前，加入PI3K抑制劑LY294002阻斷PI3K-AKT信號通路，再加入FGF刺激細胞，檢測Malat1的表達。結(jié)果顯示，PI3K-AKT信號通路被阻斷后，F(xiàn)GF對Malat1表達的上調(diào)作用也受到抑制，Malat1的表達量與未阻斷信號通路的FGF刺激組相比顯著降低（P<0.05），說明PI3K-AKT信號通路也參與了FGF對Malat1表達的調(diào)控。為了進一步驗證這些結(jié)果，我們采用基因沉默技術(shù)。使用針對RAS、AKT等關(guān)鍵信號通路分子的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染軟骨細胞，降低關(guān)鍵分子的表達水平，然后用FGF刺激細胞，檢測Malat1的表達。當RAS基因被沉默后，F(xiàn)GF刺激下Malat1的表達上調(diào)不明顯，與正常FGF刺激組相比，Malat1的表達量顯著降低（P<0.05），再次證實了RAS-MAPK信號通路在FGF調(diào)控Malat1表達中的關(guān)鍵作用。當AKT基因被沉默后，F(xiàn)GF刺激下Malat1的表達也受到明顯抑制，表達量顯著低于正常FGF刺激組（P<0.05），進一步驗證了PI3K-AKT信號通路在這一調(diào)控過程中的重要性。這些實驗結(jié)果表明，F(xiàn)GF通過與Fgfr1和Fgfr3結(jié)合，激活RAS-MAPK和PI3K-AKT等信號通路，在調(diào)控軟骨細胞中Malat1的表達中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為深入理解FGF調(diào)控Malat1表達的機制提供了重要的實驗依據(jù)。4.2關(guān)鍵信號分子的驗證與分析在確定RAS-MAPK和PI3K-AKT等信號通路參與FGF調(diào)控Malat1表達后，進一步對關(guān)鍵信號分子進行驗證與分析。選擇ERK通路中的關(guān)鍵激酶ERK1/2作為研究對象，通過抑制劑處理、基因敲除或過表達實驗，深入探究其在FGF調(diào)控Malat1表達中的作用機制。首先，使用ERK1/2抑制劑SCH772984處理軟骨細胞。將處于對數(shù)期的軟骨細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分為對照組、FGF刺激組、FGF+SCH772984組。FGF+SCH772984組先加入10μMSCH772984預(yù)處理1h，然后加入100ng/mLFGF2刺激細胞；FGF刺激組僅加入100ng/mLFGF2刺激細胞；對照組加入等量的不含F(xiàn)GF2和抑制劑的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細胞樣本，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測Malat1的表達變化，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)GF刺激組中Malat1的表達顯著上調(diào)，ERK1/2的磷酸化水平明顯升高（P<0.05）；而在FGF+SCH772984組中，ERK1/2的磷酸化水平被顯著抑制，Malat1的表達上調(diào)也受到明顯抑制，與FGF刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明抑制ERK1/2的活性能夠阻斷FGF對Malat1表達的上調(diào)作用。為了進一步驗證ERK1/2的作用，采用基因敲除實驗。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建ERK1/2基因敲除的軟骨細胞模型。將設(shè)計好的針對ERK1/2基因的sgRNA與Cas9蛋白共轉(zhuǎn)染軟骨細胞，通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定敲除ERK1/2基因的細胞株。對敲除細胞株進行鑒定，通過DNA測序和Westernblot檢測確認ERK1/2基因被成功敲除。將野生型軟骨細胞和ERK1/2基因敲除的軟骨細胞分別用100ng/mLFGF2刺激24h，然后檢測Malat1的表達。結(jié)果表明，在野生型軟骨細胞中，F(xiàn)GF2刺激能夠顯著上調(diào)Malat1的表達；而在ERK1/2基因敲除的軟骨細胞中，F(xiàn)GF2刺激后Malat1的表達無明顯變化，與未刺激的ERK1/2基因敲除細胞相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），進一步證實了ERK1/2在FGF調(diào)控Malat1表達中的關(guān)鍵作用。此外，進行ERK1/2過表達實驗。構(gòu)建ERK1/2過表達質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至軟骨細胞中，使ERK1/2在細胞內(nèi)高表達。將轉(zhuǎn)染后的軟骨細胞分為對照組、空載體轉(zhuǎn)染組和ERK1/2過表達組，分別加入100ng/mLFGF2刺激24h。通過qRT-PCR和Westernblot檢測Malat1的表達和ERK1/2的蛋白水平。結(jié)果顯示，與對照組和空載體轉(zhuǎn)染組相比，ERK1/2過表達組中ERK1/2的蛋白水平顯著升高，Malat1的表達也明顯上調(diào)，且在FGF2刺激下，Malat1的表達上調(diào)更為顯著（P<0.05），表明過表達ERK1/2能夠增強FGF對Malat1表達的上調(diào)作用。通過以上抑制劑處理、基因敲除和過表達實驗，充分驗證了ERK1/2作為RAS-MAPK信號通路中的關(guān)鍵激酶，在FGF調(diào)控軟骨細胞中Malat1表達的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。ERK1/2的激活是FGF上調(diào)Malat1表達的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這一發(fā)現(xiàn)為深入理解FGF調(diào)控Malat1表達的分子機制提供了重要的實驗依據(jù)，也為進一步研究FGF-Malat1信號軸在軟骨細胞生物學(xué)行為中的作用奠定了基礎(chǔ)。4.3Malat1與相關(guān)信號通路的交互作用Malat1在軟骨細胞中并非孤立發(fā)揮作用，其與FGF信號通路及其他相關(guān)信號通路存在著復(fù)雜的交互作用，這種交互作用對軟骨細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生著深遠影響。Malat1與FGF信號通路之間存在雙向調(diào)控關(guān)系。一方面，如前文所述，F(xiàn)GF通過激活RAS-MAPK和PI3K-AKT等信號通路，上調(diào)Malat1的表達。另一方面，Malat1也可能反饋調(diào)節(jié)FGF信號通路的活性。研究發(fā)現(xiàn)，Malat1可以與某些信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用，影響其活性和功能。在腫瘤細胞中，Malat1通過與RAS蛋白相互作用，影響RAS-MAPK信號通路的激活。在軟骨細胞中，Malat1可能同樣通過與RAS蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)RAS的活性，進而影響RAS-MAPK信號通路的激活程度。當Malat1表達升高時，其與RAS蛋白的結(jié)合可能增強，導(dǎo)致RAS蛋白的活性改變，從而影響下游RAF、MEK和ERK等激酶的激活，最終反饋調(diào)節(jié)FGF信號通路對軟骨細胞增殖、分化等過程的調(diào)控。在軟骨細胞增殖階段，若Malat1對RAS-MAPK信號通路的反饋調(diào)節(jié)異常，可能導(dǎo)致軟骨細胞增殖失控，影響軟骨內(nèi)成骨的正常進行。Malat1還可能與其他信號通路發(fā)生交互作用，共同調(diào)控軟骨細胞的生物學(xué)行為。在骨關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，Malat1通過抑制miR-124的表達，促進滑膜成纖維細胞的增殖和遷移，這一過程涉及到多個信號通路的參與。在軟骨細胞中，Malat1可能通過與miR-124等microRNA相互作用，調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路。miR-124可以靶向作用于一些信號通路中的關(guān)鍵分子，如細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）等。當Malat1抑制miR-124的表達時，CDK6等分子的表達可能上調(diào)，從而激活相關(guān)信號通路，影響軟骨細胞的增殖和分化。Malat1還可能與Wnt/β-catenin信號通路發(fā)生交互作用。Wnt/β-catenin信號通路在軟骨細胞的分化和軟骨內(nèi)成骨過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，Malat1可以通過調(diào)節(jié)β-catenin的表達和活性，影響Wnt/β-catenin信號通路的激活。在軟骨細胞分化過程中，若Malat1與Wnt/β-catenin信號通路的交互作用異常，可能導(dǎo)致軟骨細胞分化受阻，影響軟骨組織的正常發(fā)育和維持。Malat1與相關(guān)信號通路的交互作用對軟骨細胞的生物學(xué)行為具有重要影響。在軟骨細胞增殖方面，這種交互作用可能通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，影響軟骨細胞的增殖速度。當Malat1與FGF信號通路及其他相關(guān)信號通路協(xié)同作用時，可能促進細胞周期蛋白D1等蛋白的表達，加速軟骨細胞從G1期進入S期，從而促進軟骨細胞的增殖。在軟骨細胞分化方面，交互作用可能通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達和活性，影響軟骨細胞的分化方向。例如，Malat1與Wnt/β-catenin信號通路的交互作用，可能通過調(diào)節(jié)Sox9、Runx2等轉(zhuǎn)錄因子的表達，調(diào)控軟骨細胞向成骨細胞的分化進程。在軟骨細胞凋亡調(diào)控上，交互作用可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和信號通路，影響軟骨細胞的凋亡水平。Malat1與miR-146a等microRNA的相互作用，可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，如Bcl-2、Bax等，影響軟骨細胞的凋亡。Malat1與相關(guān)信號通路的交互作用是一個復(fù)雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入研究這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于我們更全面地理解軟骨細胞的生物學(xué)行為及相關(guān)疾病的發(fā)病機制，為開發(fā)針對軟骨發(fā)育異常和關(guān)節(jié)疾病的治療策略提供新的靶點和思路。五、Malat1表達變化對軟骨細胞生物學(xué)行為的影響5.1Malat1干擾或過表達對軟骨細胞增殖的影響為了深入探究Malat1表達變化對軟骨細胞增殖的影響，我們采用了siRNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達技術(shù)，分別構(gòu)建了Malat1表達下調(diào)和上調(diào)的軟骨細胞模型，并通過CCK-8實驗和EdU摻入實驗對軟骨細胞的增殖能力進行了檢測。在siRNA干擾實驗中，設(shè)計并合成了針對Malat1的小干擾RNA（si-Malat1），同時設(shè)置了陰性對照siRNA（si-NC）。將處于對數(shù)期的軟骨細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，按照Lipofectamine3000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作。將細胞分為對照組（不做任何處理）、si-NC組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）和si-Malat1組（轉(zhuǎn)染針對Malat1的siRNA）。轉(zhuǎn)染6h后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h，分別向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。然后使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。結(jié)果如圖4所示，在24h時，si-Malat1組的細胞增殖率與對照組和si-NC組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；48h時，si-Malat1組的細胞增殖率顯著低于對照組和si-NC組（P<0.01）；72h時，si-Malat1組的細胞增殖率進一步降低，與對照組和si-NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。這表明干擾Malat1的表達能夠抑制軟骨細胞的增殖，且隨著時間的延長，抑制作用更加明顯。為了進一步驗證干擾Malat1對軟骨細胞增殖的影響，我們進行了EdU摻入實驗。在轉(zhuǎn)染si-Malat1或si-NC48h后，按照EdU試劑盒說明書進行操作。將EdU工作液加入細胞培養(yǎng)基中，終濃度為50μM，繼續(xù)孵育2h。然后棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細胞15min，再用0.5%TritonX-100透化細胞10min。接著加入Click反應(yīng)液，避光孵育30min。最后用DAPI染核5min，通過熒光顯微鏡觀察并拍照。在熒光顯微鏡下，EdU陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光，DAPI染核呈現(xiàn)藍色熒光。隨機選取5個視野，統(tǒng)計每個視野中的EdU陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算EdU陽性細胞比例。EdU陽性細胞比例（%）=EdU陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。結(jié)果如圖5所示，si-Malat1組的EdU陽性細胞比例顯著低于對照組和si-NC組（P<0.01），進一步證實了干擾Malat1的表達能夠抑制軟骨細胞的增殖。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達實驗中，構(gòu)建了Malat1過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-Malat1），同時設(shè)置了空質(zhì)粒對照組（pcDNA3.1）。將軟骨細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，按照Lipofectamine3000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作。將細胞分為對照組（不做任何處理）、pcDNA3.1組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）和pcDNA3.1-Malat1組（轉(zhuǎn)染Malat1過表達質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染6h后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，操作步驟同siRNA干擾實驗。結(jié)果如圖6所示，在24h時，pcDNA3.1-Malat1組的細胞增殖率與對照組和pcDNA3.1組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；48h時，pcDNA3.1-Malat1組的細胞增殖率顯著高于對照組和pcDNA3.1組（P<0.01）；72h時，pcDNA3.1-Malat1組的細胞增殖率進一步升高，與對照組和pcDNA3.1組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。這表明過表達Malat1能夠促進軟骨細胞的增殖，且隨著時間的延長，促進作用更加明顯。同樣，為了驗證過表達Malat1對軟骨細胞增殖的影響，我們進行了EdU摻入實驗。在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Malat1或pcDNA3.148h后，按照EdU試劑盒說明書進行操作，步驟同siRNA干擾實驗中的EdU摻入實驗。結(jié)果如圖7所示，pcDNA3.1-Malat1組的EdU陽性細胞比例顯著高于對照組和pcDNA3.1組（P<0.01），進一步證實了過表達Malat1能夠促進軟骨細胞的增殖。綜上所述，通過siRNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達實驗，結(jié)合CCK-8實驗和EdU摻入實驗的檢測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)Malat1的表達變化對軟骨細胞的增殖具有顯著影響。干擾Malat1的表達能夠抑制軟骨細胞的增殖，而過表達Malat1則能夠促進軟骨細胞的增殖。這一結(jié)果為深入理解Malat1在軟骨細胞生物學(xué)行為中的作用提供了重要的實驗依據(jù)，也為進一步研究Malat1在軟骨發(fā)育和相關(guān)疾病中的機制奠定了基礎(chǔ)。5.2Malat1對軟骨細胞分化和凋亡的影響在明確Malat1表達變化對軟骨細胞增殖有顯著影響后，進一步探究其對軟骨細胞分化和凋亡的作用。通過檢測軟骨細胞分化相關(guān)標志物以及凋亡相關(guān)指標，深入分析Malat1在軟骨細胞生物學(xué)行為中的調(diào)控機制。首先，檢測軟骨細胞分化相關(guān)標志物的表達。選用Ⅱ型膠原蛋白（COL2A1）和SOX9作為軟骨細胞分化的關(guān)鍵標志物。COL2A1是軟骨細胞特異性的膠原蛋白，在軟骨基質(zhì)中含量豐富，其表達水平直接反映了軟骨細胞的分化程度。SOX9則是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在軟骨細胞分化過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用，能夠促進COL2A1等軟骨特異性基因的表達。在Malat1干擾實驗中，轉(zhuǎn)染針對Malat1的siRNA（si-Malat1）48h后，收集細胞，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測COL2A1和SOX9基因的表達水平。結(jié)果顯示，與對照組（不做任何處理）和陰性對照siRNA組（si-NC）相比，si-Malat1組中COL2A1和SOX9基因的表達量顯著降低（P<0.01）。進一步采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測COL2A1和SOX9蛋白的表達水平，結(jié)果與基因表達水平一致，si-Malat1組中COL2A1和SOX9蛋白的表達量明顯減少（P<0.01），表明干擾Malat1的表達會抑制軟骨細胞的分化。在Malat1過表達實驗中，轉(zhuǎn)染Malat1過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-Malat1）48h后，進行同樣的檢測。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組和空質(zhì)粒對照組（pcDNA3.1）相比，pcDNA3.1-Malat1組中COL2A1和SOX9基因的表達量顯著升高（P<0.01）。Westernblot檢測結(jié)果也表明，pcDNA3.1-Malat1組中COL2A1和SOX9蛋白的表達量明顯增加（P<0.01），說明過表達Malat1能夠促進軟骨細胞的分化。接著，分析Malat1對軟骨細胞凋亡的影響。檢測凋亡相關(guān)指標，包括caspase活性和AnnexinV染色。caspase是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，其中caspase-3的激活是細胞凋亡進入不可逆階段的重要標志。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸具有高度親和力的蛋白質(zhì)，在細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，AnnexinV可以與之結(jié)合，通過熒光標記的AnnexinV染色，可利用流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞。在Malat1干擾實驗中，轉(zhuǎn)染si-Malat148h后，采用caspase-3活性檢測試劑盒檢測細胞中caspase-3的活性。結(jié)果顯示，si-Malat1組中caspase-3的活性顯著高于對照組和si-NC組（P<0.01）。同時，運用流式細胞術(shù)進行AnnexinV-FITC/PI雙染，檢測細胞凋亡率。結(jié)果表明，si-Malat1組的早期凋亡細胞（AnnexinV陽性/PI陰性）和晚期凋亡細胞（AnnexinV陽性/PI陽性）比例顯著高于對照組和si-NC組（P<0.01），說明干擾Malat1的表達會促進軟骨細胞的凋亡。在Malat1過表達實驗中，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Malat148h后，進行相同的檢測。caspase-3活性檢測結(jié)果顯示，pcDNA3.1-Malat1組中caspase-3的活性顯著低于對照組和pcDNA3.1組（P<0.01）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，pcDNA3.1-Malat1組的早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞比例顯著低于對照組和pcDNA3.1組（P<0.01），表明過表達Malat1能夠抑制軟骨細胞的凋亡。綜上所述，Malat1的表達變化對軟骨細胞的分化和凋亡具有重要影響。干擾Malat1的表達會抑制軟骨細胞的分化，促進軟骨細胞的凋亡；而過表達Malat1則能夠促進軟骨細胞的分化，抑制軟骨細胞的凋亡。這一結(jié)果進一步揭示了Malat1在軟骨細胞生物學(xué)行為中的關(guān)鍵調(diào)控作用，為深入理解軟骨發(fā)育和相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供了重要的實驗依據(jù)。5.3Malat1在軟骨細胞外基質(zhì)合成中的作用為深入探究Malat1在軟骨細胞外基質(zhì)合成中的作用，本研究聚焦于檢測軟骨細胞外基質(zhì)成分aggrecan和collagenII的合成與分泌情況，以此分析Malat1對軟骨細胞外基質(zhì)合成的影響，并探討其在軟骨組織穩(wěn)態(tài)維持中的作用。首先，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測軟骨細胞中aggrecan和collagenII蛋白的表達水平。將處于對數(shù)期的軟骨細胞分為對照組、Malat1干擾組（轉(zhuǎn)染針對Malat1的siRNA）和Malat1過表達組（轉(zhuǎn)染Malat1過表達質(zhì)粒）。培養(yǎng)48h后，收集細胞，提取總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入兔抗鼠aggrecan多克隆抗體（1:1000稀釋）和兔抗鼠collagenII多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h，再次洗膜后，用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算aggrecan和collagenII蛋白的相對表達量。結(jié)果顯示，與對照組相比，Malat1干擾組中aggrecan和collagenII蛋白的相對表達量顯著降低（P<0.01）；而Malat1過表達組中，aggrecan和collagenII蛋白的相對表達量顯著升高（P<0.01），表明Malat1的表達變化對軟骨細胞外基質(zhì)中aggrecan和collagenII蛋白的合成有顯著影響。接著，運用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細胞培養(yǎng)上清液中aggrecan和collagenII的分泌水平。將上述分組的軟骨細胞培養(yǎng)于6孔板中，培養(yǎng)72h后，收集細胞培養(yǎng)上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作，將包被有抗aggrecan或抗collagenII抗體的酶標板加入不同稀釋度的標準品和樣品，37℃孵育1h。洗板后，加入生物素標記的檢測抗體，37℃孵育30min。再次洗板，加入HRP標記的鏈霉親和素，37℃孵育15min。最后，加入TMB底物顯色，用酶標儀在450nm波長處檢測吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品中aggrecan和collagenII的含量。結(jié)果表明，Malat1干擾組培養(yǎng)上清液中aggrecan和collagenII的含量明顯低于對照組（P<0.01）；Malat1過表達組培養(yǎng)上清液中aggrecan和collagenII的含量顯著高于對照組（P<0.01），進一步證實Malat1能夠調(diào)控軟骨細胞外基質(zhì)成分的分泌。為了更直觀地觀察Malat1對軟骨細胞外基質(zhì)合成的影響，進行免疫熒光染色實驗。將軟骨細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，分組處理后，用4%多聚甲醛固定15min。0.5%TritonX-100透化10min，5%BSA封閉30min，分別加入兔抗鼠aggrecan多克隆抗體和兔抗鼠collagenII多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS洗3次，加入AlexaFluor488標記