成肌細(xì)胞中T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的氨基酸機(jī)制探秘一、引言1.1研究背景與意義成肌細(xì)胞作為肌肉發(fā)育和修復(fù)的關(guān)鍵前體細(xì)胞，在維持肌肉組織的正常結(jié)構(gòu)和功能中扮演著不可或缺的角色。在肌肉生長(zhǎng)、發(fā)育及損傷修復(fù)過(guò)程中，成肌細(xì)胞能夠增殖、分化并融合形成肌管，最終發(fā)育為成熟的肌纖維，這一過(guò)程受到多種基因、信號(hào)通路及環(huán)境因素的精密調(diào)控。成肌細(xì)胞的正常功能對(duì)于維持肌肉質(zhì)量、力量和運(yùn)動(dòng)能力至關(guān)重要，其功能異常與多種肌肉相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如肌肉萎縮、肌營(yíng)養(yǎng)不良等。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝和自噬等過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。mTOR能夠整合細(xì)胞內(nèi)外部的多種信號(hào)，包括生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、葡萄糖）、能量狀態(tài)和應(yīng)激信號(hào)等，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為。在肌肉細(xì)胞中，mTOR信號(hào)通路對(duì)于促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抑制蛋白質(zhì)降解、調(diào)節(jié)肌纖維類型轉(zhuǎn)換以及維持肌肉干細(xì)胞的自我更新和分化能力具有關(guān)鍵作用。當(dāng)mTOR信號(hào)通路異常激活或抑制時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肌肉生長(zhǎng)發(fā)育異常和相關(guān)疾病的發(fā)生，如在一些肌肉萎縮性疾病中，mTOR信號(hào)通路的活性受到抑制，從而導(dǎo)致肌肉蛋白合成減少、降解增加，最終引起肌肉萎縮。T1R1/T1R3是一類味覺(jué)受體，最初被發(fā)現(xiàn)主要參與鮮味的感知。鮮味作為五種基本味覺(jué)之一，能夠賦予食物獨(dú)特的風(fēng)味和口感，其感知主要依賴于T1R1/T1R3異二聚體與鮮味物質(zhì)（如谷氨酸、某些核苷酸和鮮味肽等）的特異性結(jié)合。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，T1R1/T1R3不僅存在于味覺(jué)細(xì)胞中，還廣泛表達(dá)于多種非味覺(jué)組織和細(xì)胞中，包括腸道上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞和成肌細(xì)胞等，并且在這些細(xì)胞中發(fā)揮著重要的生理功能。在成肌細(xì)胞中，T1R1/T1R3可能通過(guò)感知細(xì)胞外的氨基酸水平，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而影響mTOR信號(hào)通路的活性，最終調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖、分化和肌肉蛋白合成等過(guò)程，但具體的分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在深入探究成肌細(xì)胞中T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的胞外氨基酸篩選及分子機(jī)制。通過(guò)全面系統(tǒng)地研究這一過(guò)程，有望揭示成肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的新機(jī)制，為提高畜禽肌肉生長(zhǎng)性能提供全新的理論依據(jù)。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，深入理解肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，有助于開發(fā)更加有效的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控策略和生物技術(shù)手段，提高畜禽的瘦肉率和肉質(zhì)品質(zhì)，滿足人們對(duì)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的需求，同時(shí)也有助于推動(dòng)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。此外，本研究成果對(duì)于治療人類肌肉相關(guān)疾病，如肌肉萎縮、肌營(yíng)養(yǎng)不良等也具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)明確T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路在肌肉疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為開發(fā)新型的治療靶點(diǎn)和藥物提供理論基礎(chǔ)，為改善患者的生活質(zhì)量和健康狀況帶來(lái)新的希望。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在成肌細(xì)胞研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了豐碩的成果。國(guó)內(nèi)研究側(cè)重于成肌細(xì)胞在疾病治療中的應(yīng)用探索，如針對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良等疾病，深入探究成肌細(xì)胞移植治療的可行性與潛在機(jī)制。有研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞移植到杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良模型小鼠體內(nèi)，觀察到移植的成肌細(xì)胞能夠在一定程度上修復(fù)受損的肌纖維，改善肌肉功能。這為臨床治療杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良提供了新的思路和方法。同時(shí)，國(guó)內(nèi)研究還關(guān)注成肌細(xì)胞在組織工程中的應(yīng)用，嘗試?yán)蒙锊牧蠘?gòu)建三維支架，為成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化提供適宜的微環(huán)境，以促進(jìn)肌肉組織的再生和修復(fù)。國(guó)外研究則更聚焦于成肌細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制，尤其是在成肌細(xì)胞增殖、分化和融合過(guò)程中，對(duì)相關(guān)基因和信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制展開了深入研究。例如，通過(guò)基因敲除和過(guò)表達(dá)技術(shù)，明確了一些關(guān)鍵基因如MyoD、Myf5等在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的重要作用，它們能夠調(diào)控成肌細(xì)胞向成熟肌纖維的分化進(jìn)程。此外，國(guó)外研究還利用單細(xì)胞測(cè)序等先進(jìn)技術(shù)，對(duì)成肌細(xì)胞在不同發(fā)育階段和生理病理狀態(tài)下的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，揭示了成肌細(xì)胞在肌肉發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子變化規(guī)律。關(guān)于mTOR信號(hào)通路，國(guó)內(nèi)研究主要圍繞其在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等方面的作用機(jī)制展開。在腫瘤研究中，發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性密切相關(guān)。通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為腫瘤治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。在神經(jīng)退行性疾病研究中，探討了mTOR信號(hào)通路在阿爾茨海默病、帕金森病等疾病中的異常變化及其對(duì)神經(jīng)元功能的影響，為尋找治療這些疾病的新方法提供了理論依據(jù)。國(guó)外對(duì)mTOR信號(hào)通路的研究更為廣泛和深入，不僅涵蓋了其在多種疾病中的作用機(jī)制，還包括對(duì)mTOR信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控機(jī)制以及與其他信號(hào)通路的交互作用的研究。例如，研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路可以通過(guò)與自噬信號(hào)通路的相互調(diào)控，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞受到營(yíng)養(yǎng)缺乏或應(yīng)激刺激時(shí)，mTOR信號(hào)通路會(huì)抑制自噬，而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)，mTOR信號(hào)通路則會(huì)激活自噬。此外，國(guó)外還在積極開發(fā)針對(duì)mTOR信號(hào)通路的靶向藥物，目前已有多種mTOR抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，為相關(guān)疾病的治療帶來(lái)了新的希望。在T1R1/T1R3味覺(jué)受體的研究方面，國(guó)內(nèi)主要關(guān)注其在味覺(jué)感知和食品風(fēng)味方面的應(yīng)用。通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)，研究鮮味物質(zhì)與T1R1/T1R3受體的相互作用機(jī)制，為開發(fā)新型鮮味劑和改善食品風(fēng)味提供理論支持。從西瓜黃豆醬、發(fā)酵鵝骨等食品中分離鑒定出新型鮮味肽，并通過(guò)與T1R1/T1R3受體的分子對(duì)接，揭示了鮮味肽的鮮味機(jī)制。國(guó)外對(duì)T1R1/T1R3的研究則拓展到了非味覺(jué)組織和細(xì)胞領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)T1R1/T1R3在腸道、脂肪細(xì)胞等組織中具有重要的生理功能。在腸道中，T1R1/T1R3可以感知食物中的氨基酸，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌激素，進(jìn)而影響腸道的消化和吸收功能。在脂肪細(xì)胞中，T1R1/T1R3的激活可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化和代謝，影響脂肪的儲(chǔ)存和釋放。對(duì)于氨基酸調(diào)控的研究，國(guó)內(nèi)主要集中在氨基酸對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能和肉質(zhì)品質(zhì)的影響方面。通過(guò)在飼料中添加不同種類和水平的氨基酸，研究其對(duì)畜禽生長(zhǎng)、發(fā)育和肉質(zhì)的影響，為優(yōu)化飼料配方提供科學(xué)依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，在豬飼料中添加適量的賴氨酸和蛋氨酸，可以顯著提高豬的生長(zhǎng)速度和瘦肉率，改善肉質(zhì)品質(zhì)。國(guó)外對(duì)氨基酸調(diào)控的研究則深入到細(xì)胞和分子水平，探究氨基酸如何通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和代謝。氨基酸可以通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)降解，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。此外，國(guó)外還研究了氨基酸在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激等方面的作用機(jī)制，為維持機(jī)體健康提供了新的理論支持。盡管國(guó)內(nèi)外在成肌細(xì)胞、mTOR信號(hào)、T1R1/T1R3以及氨基酸調(diào)控等方面取得了顯著進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。在成肌細(xì)胞與mTOR信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)研究中，雖然已明確mTOR信號(hào)通路對(duì)成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化具有重要調(diào)控作用，但具體的分子機(jī)制尚未完全闡明，尤其是在不同生理病理?xiàng)l件下，mTOR信號(hào)通路如何精準(zhǔn)調(diào)控成肌細(xì)胞的生物學(xué)行為，仍有待進(jìn)一步深入研究。在T1R1/T1R3介導(dǎo)的氨基酸感知與mTOR信號(hào)通路的聯(lián)系方面，目前的研究還相對(duì)較少，T1R1/T1R3如何識(shí)別和結(jié)合不同的氨基酸，以及其激活后如何將信號(hào)傳遞給mTOR信號(hào)通路，仍存在許多未知領(lǐng)域。此外，在氨基酸調(diào)控成肌細(xì)胞功能的研究中，不同氨基酸之間的協(xié)同作用以及它們對(duì)成肌細(xì)胞功能的綜合影響，也需要進(jìn)一步深入探討。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在全面系統(tǒng)地篩選出能夠通過(guò)成肌細(xì)胞中T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的胞外氨基酸，并深入探究其分子機(jī)制以及氨基酸特異性，為揭示成肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的新機(jī)制提供理論依據(jù)，具體研究目標(biāo)如下：篩選胞外氨基酸：運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等技術(shù)手段，系統(tǒng)篩選能夠激活成肌細(xì)胞中T1R1/T1R3并進(jìn)一步調(diào)控mTOR信號(hào)的胞外氨基酸種類。探究分子機(jī)制：深入剖析T1R1/T1R3被激活后，將信號(hào)傳遞至mTOR信號(hào)通路的具體分子機(jī)制，包括相關(guān)信號(hào)分子的激活、磷酸化以及蛋白-蛋白相互作用等過(guò)程。明確氨基酸特異性：研究不同氨基酸在激活T1R1/T1R3和調(diào)控mTOR信號(hào)過(guò)程中的特異性，分析氨基酸的結(jié)構(gòu)、濃度等因素對(duì)其調(diào)控作用的影響。1.3.2研究?jī)?nèi)容為實(shí)現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究將開展以下具體研究?jī)?nèi)容：胞外氨基酸對(duì)成肌細(xì)胞T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路的影響：培養(yǎng)成肌細(xì)胞，設(shè)置不同的氨基酸處理組，分別用單一氨基酸以及氨基酸混合物處理成肌細(xì)胞。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)T1R1/T1R3和mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白（如p-mTOR、p-S6K1、p-4E-BP1等）的表達(dá)水平，確定哪些氨基酸能夠顯著影響T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路的活性。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)通路的激活情況。同時(shí)，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）、細(xì)胞周期分析等方法，觀察氨基酸處理對(duì)成肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，明確氨基酸調(diào)控成肌細(xì)胞功能與T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路之間的關(guān)系。T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的分子機(jī)制研究：構(gòu)建T1R1/T1R3基因敲低或過(guò)表達(dá)的成肌細(xì)胞模型，通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)敲低T1R1/T1R3的表達(dá)，或利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使其過(guò)表達(dá)。在這些模型中，用篩選出的氨基酸進(jìn)行處理，檢測(cè)mTOR信號(hào)通路的活性變化。采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，尋找與T1R1/T1R3相互作用的蛋白，探究信號(hào)傳遞的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。研究這些相互作用蛋白在氨基酸刺激下的磷酸化修飾、亞細(xì)胞定位變化等，深入揭示T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的分子機(jī)制。此外，利用激酶活性檢測(cè)試劑盒等方法，檢測(cè)相關(guān)激酶（如AKT、TSC1/TSC2等）在信號(hào)傳遞過(guò)程中的活性變化，明確它們?cè)赥1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路中的作用。氨基酸特異性對(duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)調(diào)控的影響：選取具有代表性的不同結(jié)構(gòu)和功能的氨基酸，如酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）、堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸）、中性氨基酸（丙氨酸、甘氨酸）等。研究它們?cè)诓煌瑵舛认聦?duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路的激活程度和特異性。通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，改變氨基酸的結(jié)構(gòu)，如改變氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)、電荷性質(zhì)等，觀察其對(duì)T1R1/T1R3結(jié)合能力和mTOR信號(hào)調(diào)控的影響。利用等溫滴定量熱法（ITC）、表面等離子共振技術(shù)（SPR）等生物物理方法，測(cè)定氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合親和力，分析氨基酸結(jié)構(gòu)與結(jié)合親和力之間的關(guān)系，從而深入理解氨基酸特異性對(duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)調(diào)控的影響機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：選用C2C12成肌細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有典型的成肌細(xì)胞特征，易于在體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，廣泛應(yīng)用于成肌細(xì)胞相關(guān)研究。主要試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、各種氨基酸（包括L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-甘氨酸等）、雷帕霉素（mTOR抑制劑）、CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、WesternBlot相關(guān)抗體（抗T1R1抗體、抗T1R3抗體、抗p-mTOR抗體、抗mTOR抗體、抗p-S6K1抗體、抗S6K1抗體、抗p-4E-BP1抗體、抗4E-BP1抗體、抗β-actin抗體等）、免疫共沉淀試劑盒、激酶活性檢測(cè)試劑盒、等溫滴定量熱儀（ITC）、表面等離子共振儀（SPR）等。主要儀器設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、低溫高速離心機(jī)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、等溫滴定量熱儀、表面等離子共振儀等。1.4.2實(shí)驗(yàn)方法成肌細(xì)胞培養(yǎng)：將C2C12成肌細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后按照1:3-1:5的比例進(jìn)行傳代。氨基酸處理成肌細(xì)胞：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成肌細(xì)胞接種于6孔板或96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為含不同氨基酸的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行處理。氨基酸處理組包括單一氨基酸處理組（如分別用1mM的L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-賴氨酸等處理）和氨基酸混合物處理組（按照一定比例混合多種氨基酸進(jìn)行處理）。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入無(wú)氨基酸的無(wú)血清培養(yǎng)基。處理時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)定，一般為24h、48h或72h。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）：在96孔板中接種成肌細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，按照上述氨基酸處理方式進(jìn)行處理。在處理結(jié)束前2h，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。細(xì)胞周期分析：將成肌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用不同氨基酸處理細(xì)胞。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，然后加入70%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，4℃過(guò)夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色液，37℃避光孵育30min。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，分析氨基酸處理對(duì)成肌細(xì)胞周期的影響。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）：收集氨基酸處理后的成肌細(xì)胞，用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，然后加入相應(yīng)的一抗（如抗T1R1抗體、抗T1R3抗體、抗p-mTOR抗體等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，并分析蛋白表達(dá)水平的變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：收集氨基酸處理后的成肌細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)目的基因（如T1R1、T1R3、mTOR、S6K1、4E-BP1等）和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列設(shè)計(jì)引物，引物序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢并經(jīng)軟件分析驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件根據(jù)所用試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，采用2?ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。RNA干擾（RNAi）和基因轉(zhuǎn)染：設(shè)計(jì)針對(duì)T1R1和T1R3的小干擾RNA（siRNA），并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至成肌細(xì)胞中，以敲低T1R1/T1R3的表達(dá)。同時(shí)，構(gòu)建T1R1/T1R3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入成肌細(xì)胞中，使其過(guò)表達(dá)。轉(zhuǎn)染效率通過(guò)qRT-PCR和WesternBlot進(jìn)行驗(yàn)證。在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中，用篩選出的氨基酸進(jìn)行處理，檢測(cè)mTOR信號(hào)通路的活性變化。免疫共沉淀（Co-IP）：收集氨基酸處理后的成肌細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。將細(xì)胞總蛋白與抗T1R1或抗T1R3抗體孵育，然后加入ProteinA/G磁珠，4℃孵育過(guò)夜，使抗體-蛋白復(fù)合物與磁珠結(jié)合。用洗滌緩沖液洗滌磁珠3-5次，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后，加入洗脫緩沖液，將與T1R1/T1R3相互作用的蛋白洗脫下來(lái)。對(duì)洗脫下來(lái)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和WesternBlot分析，鑒定與T1R1/T1R3相互作用的蛋白。激酶活性檢測(cè)：收集氨基酸處理后的成肌細(xì)胞，用激酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相關(guān)激酶（如AKT、TSC1/TSC2等）的活性變化。按照試劑盒說(shuō)明書的步驟，將細(xì)胞裂解液與相應(yīng)的底物和反應(yīng)緩沖液混合，在特定條件下孵育一定時(shí)間，然后加入檢測(cè)試劑，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算激酶的活性。等溫滴定量熱法（ITC）和表面等離子共振技術(shù)（SPR）：利用等溫滴定量熱儀測(cè)定氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合親和力。將T1R1/T1R3蛋白溶解在適當(dāng)?shù)木彌_液中，作為滴定池中的樣品，將氨基酸溶解在相同的緩沖液中，作為注射器中的滴定劑。在一定溫度下，將氨基酸逐步滴定到T1R1/T1R3蛋白溶液中，記錄每次滴定過(guò)程中的熱量變化，通過(guò)數(shù)據(jù)分析得到氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合常數(shù)（Ka）、解離常數(shù)（Kd）和結(jié)合焓（ΔH）等熱力學(xué)參數(shù)。利用表面等離子共振儀測(cè)定氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。將T1R1/T1R3蛋白固定在傳感器芯片表面，將氨基酸溶液以一定流速通過(guò)芯片表面，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合和解離過(guò)程，得到結(jié)合速率常數(shù)（ka）、解離速率常數(shù)（kd）和平衡解離常數(shù)（KD）等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通過(guò)分析這些參數(shù)，深入理解氨基酸與T1R1/T1R3的相互作用機(jī)制。1.4.3技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：第一階段：胞外氨基酸對(duì)成肌細(xì)胞T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路的影響：復(fù)蘇并培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞，將其分為對(duì)照組和不同氨基酸處理組。用單一氨基酸和氨基酸混合物處理成肌細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，采用WesternBlot檢測(cè)T1R1/T1R3和mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，利用qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)變化，篩選出能夠顯著影響T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路的氨基酸。第二階段：T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的分子機(jī)制研究：構(gòu)建T1R1/T1R3基因敲低和過(guò)表達(dá)的成肌細(xì)胞模型，用篩選出的氨基酸處理這些模型細(xì)胞。通過(guò)WesternBlot檢測(cè)mTOR信號(hào)通路的活性變化，采用免疫共沉淀技術(shù)尋找與T1R1/T1R3相互作用的蛋白，利用激酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相關(guān)激酶的活性變化，深入研究T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的分子機(jī)制。第三階段：氨基酸特異性對(duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)調(diào)控的影響：選取不同結(jié)構(gòu)和功能的氨基酸，研究它們?cè)诓煌瑵舛认聦?duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路的激活程度和特異性。通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)改變氨基酸的結(jié)構(gòu)，觀察其對(duì)T1R1/T1R3結(jié)合能力和mTOR信號(hào)調(diào)控的影響。利用等溫滴定量熱法和表面等離子共振技術(shù)測(cè)定氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分析氨基酸結(jié)構(gòu)與結(jié)合親和力之間的關(guān)系，深入理解氨基酸特異性對(duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)調(diào)控的影響機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示各階段實(shí)驗(yàn)流程及相互關(guān)系]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1成肌細(xì)胞概述成肌細(xì)胞，作為一類特殊的肌肉前體細(xì)胞，在肌肉組織的生長(zhǎng)、發(fā)育以及損傷修復(fù)過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。從來(lái)源與概念角度來(lái)看，骨骼肌中的肌衛(wèi)星細(xì)胞長(zhǎng)期被視為出生后骨骼肌生長(zhǎng)、修復(fù)和維持的單能成肌干細(xì)胞。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，肌衛(wèi)星細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共同起源于胚胎血管祖細(xì)胞，且成年骨骼肌中存在多能干細(xì)胞，這些肌源多能干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中具有多向分化潛能。從骨骼肌中分離獲得的肌衛(wèi)星細(xì)胞在體外分離培養(yǎng)時(shí)被統(tǒng)稱為成肌細(xì)胞。成肌細(xì)胞通常呈橢圓形或梭形，大小約為20-80微米，位于肌纖維之間，被一層薄的基膜所包裹。這種獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)使其能夠在肌肉組織中穩(wěn)定存在，并在需要時(shí)迅速響應(yīng)，發(fā)揮其生物學(xué)功能。在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中，成肌細(xì)胞的作用不可或缺。在胚胎發(fā)育階段，成肌細(xì)胞大量增殖，并逐漸分化形成肌管，眾多肌管進(jìn)一步融合，最終發(fā)育為成熟的肌纖維，構(gòu)成了肌肉組織的基本結(jié)構(gòu)。在這個(gè)過(guò)程中，成肌細(xì)胞的分化受到多種基因和信號(hào)通路的精確調(diào)控，例如MyoD家族的bHLH（basichelix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子。其中Myod和Myf5決定著成肌細(xì)胞是否能激活成為具有成肌特性的肌肉干細(xì)胞，而Myogenin和MRF4則發(fā)揮著調(diào)節(jié)肌肉干細(xì)胞終末分化為肌管肌纖維的功能。處于靜止?fàn)顟B(tài)的成肌細(xì)胞不能檢測(cè)到MRFs的表達(dá)，而成肌細(xì)胞的定向分化需要Myod家族的轉(zhuǎn)錄因子參與。在成年個(gè)體中，成肌細(xì)胞對(duì)于維持肌肉的正常功能和修復(fù)損傷肌肉起著關(guān)鍵作用。當(dāng)肌肉受到損傷時(shí)，原本處于靜止?fàn)顟B(tài)的成肌細(xì)胞會(huì)被迅速激活。這些激活的成肌細(xì)胞開始大量增殖，以增加細(xì)胞數(shù)量，為修復(fù)損傷提供足夠的細(xì)胞來(lái)源。隨后，增殖后的成肌細(xì)胞逐漸分化，形成新的肌纖維，替代受損的部分，從而實(shí)現(xiàn)肌肉組織的修復(fù)和再生。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在體外，IGF-1既促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖也促進(jìn)增殖的成肌細(xì)胞分化，其調(diào)節(jié)信號(hào)通路包括MAPK、PI-3K、Calcineurin/NFAT等。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）在成肌細(xì)胞的增殖和成肌終末分化中也發(fā)揮著多種重要作用，既作為一種強(qiáng)趨化因子，同時(shí)又是成肌細(xì)胞的增殖因子和肌肉干細(xì)胞成肌調(diào)節(jié)因子。成肌細(xì)胞還參與了肌肉的日常維持和更新過(guò)程。在正常生理狀態(tài)下，成肌細(xì)胞會(huì)不斷地進(jìn)行自我更新，以保持其數(shù)量和活性的穩(wěn)定。同時(shí)，它們也會(huì)對(duì)肌肉組織中的微小損傷進(jìn)行及時(shí)修復(fù)，確保肌肉的正常功能得以持續(xù)維持。成肌細(xì)胞在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和損傷修復(fù)中具有關(guān)鍵作用，深入研究其生物學(xué)特性和調(diào)控機(jī)制，對(duì)于理解肌肉生理病理過(guò)程以及開發(fā)相關(guān)治療方法具有重要意義。2.2mTOR信號(hào)通路解析mTOR，即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin），是一種分子量約為289kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶（PIKK）家族。其蛋白結(jié)構(gòu)包含多個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，如一個(gè)催化激酶結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)mTOR的激酶活性，在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中對(duì)下游蛋白進(jìn)行磷酸化修飾，從而激活或抑制相關(guān)信號(hào)通路。FRB（FKBP12-雷帕霉素結(jié)合）結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域?qū)τ趍TOR與雷帕霉素及其衍生物的結(jié)合至關(guān)重要，當(dāng)mTOR與這些物質(zhì)結(jié)合后，其功能會(huì)受到抑制，進(jìn)而影響下游信號(hào)傳導(dǎo)。C-末端附近還存在一個(gè)預(yù)測(cè)的自抑制結(jié)構(gòu)域（抑制子結(jié)構(gòu)域），它可以調(diào)節(jié)mTOR的活性，在某些情況下抑制mTOR的激酶功能，維持細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的平衡。此外，氨基末端多達(dá)20個(gè)重復(fù)的HEAT基序以及FAT（FRAP-ATM-TRRAP）和FATC（FATC-末端）結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在mTOR的蛋白-蛋白相互作用、蛋白穩(wěn)定性以及信號(hào)傳導(dǎo)的精準(zhǔn)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。mTOR在進(jìn)化上高度保守，從酵母到人類，其蛋白序列和功能都具有相似性。在人類中，mTOR基因編碼由2549個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，與酵母TOR1和TOR2的序列同源性分別達(dá)到42%和45%。這種保守性表明mTOR在細(xì)胞生命活動(dòng)中具有核心且不可或缺的作用。在不同物種中，mTOR都參與控制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的信號(hào)通路，其功能的穩(wěn)定性對(duì)于維持生物體的正常發(fā)育和生理功能至關(guān)重要。mTOR主要通過(guò)形成兩種結(jié)構(gòu)和功能各異的蛋白復(fù)合物，即mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2），來(lái)發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和增殖等過(guò)程的調(diào)控作用。mTORC1由mTOR的催化激酶亞基、RAPTOR（mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白）、MLST8（mammalianlethalwithSEC13protein8）、PRAS40（proline-richsubstrateof40kDa）以及DEPTOR（含有mTOR相互作用蛋白的DEP結(jié)構(gòu)域）等成分組成。其中，RAPTOR在mTORC1中起著關(guān)鍵的支架作用，它能夠招募底物蛋白，使mTOR可以對(duì)其進(jìn)行磷酸化修飾，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成、自噬等過(guò)程。PRAS40則是mTORC1的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在氨基酸缺乏或細(xì)胞能量不足等情況下，PRAS40會(huì)與mTORC1結(jié)合，抑制其活性，減少蛋白質(zhì)合成，以維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡。而DEPTOR可以通過(guò)與mTOR相互作用，抑制mTORC1和mTORC2的活性，其表達(dá)水平的變化會(huì)影響mTOR信號(hào)通路的活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。mTORC2的組成更為復(fù)雜，包含mTOR的催化激酶亞基、DEPTOR、MLST8、TTI1/TEL2復(fù)合物、RICTOR（雷帕霉素不敏感性mTOR結(jié)合蛋白）、mSIN1（哺乳動(dòng)物應(yīng)激激活蛋白激酶反應(yīng)蛋白1）、PROTOR1/2（proteinobservedwithrictor1and2）以及PRR5（富含脯氨酸的蛋白質(zhì)5）等成分。RICTOR在mTORC2中扮演著重要角色，它能夠與mTOR結(jié)合，決定mTORC2的底物特異性和功能。mSIN1則參與mTORC2的激活和底物識(shí)別過(guò)程，與RICTOR協(xié)同作用，調(diào)節(jié)mTORC2對(duì)下游蛋白的磷酸化修飾。TTI1/TEL2復(fù)合物對(duì)于mTORC2的組裝和穩(wěn)定性至關(guān)重要，它可以促進(jìn)mTORC2各成分之間的相互作用，確保mTORC2正常發(fā)揮功能。mTORC1和mTORC2在細(xì)胞中具有不同的功能。mTORC1主要參與蛋白質(zhì)合成、自噬、脂質(zhì)合成等過(guò)程的調(diào)控，是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在蛋白質(zhì)合成方面，當(dāng)mTORC1被激活時(shí)，它會(huì)磷酸化激活4E-BP1和S6K1等效應(yīng)因子。4E-BP1在非磷酸化狀態(tài)下會(huì)與eIF-4E結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)翻譯起始。而mTORC1磷酸化4E-BP1后，使其與eIF-4E解離，從而釋放eIF-4E，促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物的形成，加速蛋白質(zhì)合成。S6K1被mTORC1磷酸化后，會(huì)進(jìn)一步磷酸化核糖體蛋白S6等底物，促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成的延伸階段，從而增加蛋白質(zhì)的合成量。在自噬調(diào)控方面，mTORC1作為自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，在營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)，mTORC1處于激活狀態(tài)，它會(huì)磷酸化ULK1復(fù)合物中的ULK1和Atg13等蛋白，抑制ULK1復(fù)合物的活性，從而阻止自噬體的形成，抑制自噬過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)缺乏或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，mTORC1活性被抑制，ULK1復(fù)合物得以激活，啟動(dòng)自噬過(guò)程，通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等物質(zhì)，為細(xì)胞提供能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的生存。mTORC2主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、代謝、細(xì)胞骨架重組以及細(xì)胞的遷移和侵襲等過(guò)程。在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活方面，mTORC2可以通過(guò)磷酸化Akt蛋白的Ser473位點(diǎn)，使其完全活化。活化的Akt可以進(jìn)一步磷酸化下游的多種底物，如Bad、FoxO等，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，促進(jìn)細(xì)胞存活。在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)方面，mTORC2參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝。它可以通過(guò)激活A(yù)kt，促進(jìn)脂肪酸合成和葡萄糖攝取，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在細(xì)胞骨架重組方面，mTORC2可以調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組織和動(dòng)態(tài)變化，影響細(xì)胞的形態(tài)和遷移能力。mTORC2通過(guò)磷酸化PKCα等蛋白，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的活性，從而改變肌動(dòng)蛋白的組裝和拆卸，影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，受到多種細(xì)胞信號(hào)的精細(xì)調(diào)控。生長(zhǎng)因子信號(hào)是mTOR信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因素之一。當(dāng)生長(zhǎng)因子（如胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1等）與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，會(huì)激活受體酪氨酸激酶，使受體自身磷酸化。磷酸化的受體通過(guò)招募和激活PI3K，催化膜結(jié)合的PIP2（磷脂酰肌醇（4，5）二磷酸）轉(zhuǎn)化為PIP3（磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸）。PIP3與Akt的pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致Akt的激活。AKT可以直接磷酸化mTOR，也可以通過(guò)TSC1/TSC2（結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體）間接作用于mTOR。TSC1和TSC2形成的復(fù)合物可以抑制Rheb（RasHomologEnrichedInBrain）的活性，而Rheb是mTORC1的重要激活因子。AKT磷酸化TSC2，使其失活，從而解除對(duì)Rheb的抑制，激活mTORC1。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)信號(hào)對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)也至關(guān)重要。氨基酸作為蛋白質(zhì)合成的原料，是mTORC1活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。細(xì)胞內(nèi)存在多種氨基酸感應(yīng)機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氨基酸充足時(shí)，氨基酸可以通過(guò)與特定的氨基酸受體（如Sestrin2、CASTOR1等）結(jié)合，解除這些受體對(duì)mTORC1的抑制作用，激活mTORC1。亮氨酸可以與Sestrin2結(jié)合，使Sestrin2與GATOR2復(fù)合物解離，從而激活mTORC1。葡萄糖作為細(xì)胞的主要能量來(lái)源，也參與mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。葡萄糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)，如ATP/ADP比值等，影響mTOR的活性。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖充足時(shí)，ATP生成增加，ATP/ADP比值升高，激活A(yù)MPK（AMP-激活的蛋白激酶），抑制mTORC1活性。此外，脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也可以通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路。細(xì)胞能量水平是mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)的重要因素。AMPK作為細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，對(duì)細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值的變化非常敏感。當(dāng)細(xì)胞能量不足時(shí)，AMP/ATP比值升高，激活A(yù)MPK。激活的AMPK可以磷酸化TSC2，促進(jìn)其激活，進(jìn)而抑制mTOR活性。AMPK還可以直接磷酸化mTOR，抑制其活性，減少蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，以維持細(xì)胞的能量平衡。應(yīng)激條件也會(huì)對(duì)mTOR信號(hào)通路產(chǎn)生顯著影響。在氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等情況下，細(xì)胞會(huì)激活一系列應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路，抑制mTOR活性。在氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）會(huì)激活p38MAPK等信號(hào)通路，p38MAPK可以磷酸化mTOR的某些位點(diǎn)，抑制其活性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）相關(guān)信號(hào)通路會(huì)被激活，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，抑制mTOR信號(hào)通路，減少蛋白質(zhì)合成，避免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)過(guò)重。mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和增殖等過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用，其調(diào)節(jié)機(jī)制的復(fù)雜性確保了細(xì)胞能夠根據(jù)內(nèi)外部環(huán)境的變化，精確地調(diào)控自身的生物學(xué)行為。2.3氨基酸與mTOR信號(hào)的關(guān)聯(lián)氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，不僅為細(xì)胞提供構(gòu)建蛋白質(zhì)的原料，還在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。眾多研究表明，多種氨基酸參與了mTOR信號(hào)的調(diào)節(jié)過(guò)程，其中亮氨酸、精氨酸、谷氨酰胺等氨基酸的作用尤為顯著。亮氨酸作為一種支鏈氨基酸，在激活mTOR信號(hào)通路方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的能力，是mTORC1活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)氨基酸之一。研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酸可以通過(guò)與Sestrin2、CASTOR1等氨基酸受體結(jié)合，解除這些受體對(duì)mTORC1的抑制作用，從而激活mTORC1。精氨酸不僅是合成蛋白質(zhì)的重要原料，還在細(xì)胞代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中扮演重要角色，它能夠通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，增強(qiáng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力。谷氨酰胺作為一種條件必需氨基酸，在細(xì)胞代謝和免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，也參與了mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，能夠影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活。氨基酸調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)的機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括直接機(jī)制和間接機(jī)制。直接機(jī)制方面，細(xì)胞內(nèi)存在一些能夠直接感知氨基酸水平變化的蛋白，如Sestrin2、CASTOR1等。以亮氨酸為例，亮氨酸與Sestrin2結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致Sestrin2與GATOR2復(fù)合物解離，從而解除對(duì)mTORC1的抑制，激活mTORC1。亮氨酸與Sestrin2結(jié)合，改變了Sestrin2的構(gòu)象，使其無(wú)法與GATOR2復(fù)合物相互作用，使得GATOR2能夠激活mTORC1。在間接機(jī)制中，氨基酸可通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的能量代謝和其他信號(hào)通路來(lái)間接調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)。氨基酸的代謝產(chǎn)物可以作為信號(hào)分子，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的α-酮戊二酸可以參與三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞提供能量，同時(shí)也可以作為信號(hào)分子，調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路。當(dāng)谷氨酰胺充足時(shí)，其代謝產(chǎn)生的α-酮戊二酸增多，激活mTORC1，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。氨基酸還可以通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，間接調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路。半胱氨酸等含硫氨基酸可以參與谷胱甘肽的合成，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡時(shí)，會(huì)影響mTOR信號(hào)通路的活性。除了上述機(jī)制，氨基酸還可以通過(guò)膜受體介導(dǎo)的信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)。T1R1/T1R3作為一種重要的氨基酸膜受體，在這一過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。T1R1/T1R3是一種G蛋白偶聯(lián)受體，主要表達(dá)于味覺(jué)細(xì)胞和一些非味覺(jué)組織細(xì)胞表面。在味覺(jué)細(xì)胞中，T1R1/T1R3可以感知食物中的鮮味氨基酸，如谷氨酸等，從而產(chǎn)生鮮味味覺(jué)。在非味覺(jué)組織細(xì)胞中，T1R1/T1R3可以感知細(xì)胞外的氨基酸水平變化，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。當(dāng)T1R1/T1R3與特定的氨基酸結(jié)合后，會(huì)激活下游的G蛋白，進(jìn)而激活磷脂酶C（PLC），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。升高的鈣離子可以激活一系列下游信號(hào)分子，如蛋白激酶C（PKC）等，最終影響mTOR信號(hào)通路的活性。在成肌細(xì)胞中，T1R1/T1R3與氨基酸結(jié)合后，可能通過(guò)激活PKC，磷酸化激活mTOR信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，影響成肌細(xì)胞的增殖和分化。2.4T1R1/T1R3受體的功能剖析T1R1/T1R3是一類C型G蛋白偶聯(lián)受體，由T1R1和T1R3兩個(gè)亞基組成，在味覺(jué)感知和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。T1R1和T1R3亞基都具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)特征，包括一個(gè)較大的N端胞外結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域類似于捕蠅草結(jié)構(gòu)域（VenusFlytrapDomain，VFTD），主要負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合配體。一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（Cysteine-RichDomain，CRD），它在維持受體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及參與受體-配體相互作用中具有重要作用。還有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（7-TransmembraneDomain，7-TMD），這是G蛋白偶聯(lián)受體的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)將胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活下游的G蛋白，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。在味覺(jué)感知方面，T1R1/T1R3主要參與鮮味的感知。當(dāng)食物中的鮮味物質(zhì)（如谷氨酸、某些核苷酸和鮮味肽等）與T1R1/T1R3的N端捕蠅草結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，會(huì)引起受體構(gòu)象的變化。這種構(gòu)象變化通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活與之偶聯(lián)的G蛋白。激活的G蛋白進(jìn)一步激活磷脂酶C（PLC），PLC催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。DAG則激活蛋白激酶C（PKC），這些信號(hào)分子的激活最終導(dǎo)致味覺(jué)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位，將鮮味信號(hào)傳遞到大腦，從而產(chǎn)生鮮味味覺(jué)。除了味覺(jué)細(xì)胞，T1R1/T1R3還廣泛表達(dá)于多種非味覺(jué)組織和細(xì)胞中，如腸道上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞和成肌細(xì)胞等，并且在這些細(xì)胞中發(fā)揮著不同的生理功能。在腸道上皮細(xì)胞中，T1R1/T1R3可以感知食物中的氨基酸，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌激素，進(jìn)而影響腸道的消化和吸收功能。當(dāng)腸道內(nèi)的氨基酸與T1R1/T1R3結(jié)合后，會(huì)激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）、酪酪肽（PYY）等激素。GLP-1可以促進(jìn)胰島素分泌，降低血糖水平；PYY則可以抑制食欲，減少食物攝入，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的能量平衡。在脂肪細(xì)胞中，T1R1/T1R3的激活可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化和代謝，影響脂肪的儲(chǔ)存和釋放。研究發(fā)現(xiàn)，激活T1R1/T1R3可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，增加脂肪細(xì)胞的數(shù)量。T1R1/T1R3的激活還可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成和分解代謝，影響脂肪的儲(chǔ)存和釋放。當(dāng)T1R1/T1R3被激活后，會(huì)抑制脂肪分解相關(guān)基因的表達(dá)，減少脂肪的分解；同時(shí)促進(jìn)脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，增加脂肪的儲(chǔ)存。在免疫細(xì)胞中，T1R1/T1R3參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和功能。在T淋巴細(xì)胞中，T1R1/T1R3的激活可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。當(dāng)T1R1/T1R3與氨基酸結(jié)合后，會(huì)激活下游的NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ等，從而增強(qiáng)免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。在巨噬細(xì)胞中，T1R1/T1R3的激活可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和炎癥反應(yīng)。激活T1R1/T1R3可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬病原體，增強(qiáng)其免疫防御能力；同時(shí)，T1R1/T1R3的激活還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，如TNF-α、IL-6等，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。在成肌細(xì)胞中，T1R1/T1R3可能通過(guò)感知細(xì)胞外的氨基酸水平，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而影響mTOR信號(hào)通路的活性，最終調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖、分化和肌肉蛋白合成等過(guò)程。當(dāng)成肌細(xì)胞外的氨基酸與T1R1/T1R3結(jié)合后，會(huì)激活下游的信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。升高的鈣離子可以激活一系列下游信號(hào)分子，如蛋白激酶C（PKC）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）等。這些信號(hào)分子可以進(jìn)一步激活mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)降解，從而影響成肌細(xì)胞的增殖和分化。研究表明，在成肌細(xì)胞中，激活T1R1/T1R3可以促進(jìn)mTOR信號(hào)通路的激活，增加蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖和分化；而抑制T1R1/T1R3的表達(dá)或功能，則會(huì)抑制mTOR信號(hào)通路的活性，減少蛋白質(zhì)合成，抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化。T1R1/T1R3對(duì)不同氨基酸的感應(yīng)具有一定的特異性。研究發(fā)現(xiàn)，T1R1/T1R3對(duì)鮮味氨基酸（如谷氨酸）的感應(yīng)最為敏感，能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合谷氨酸等鮮味氨基酸。T1R1/T1R3對(duì)其他一些氨基酸（如天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸等）也有一定的感應(yīng)能力，但感應(yīng)的強(qiáng)度和特異性相對(duì)較低。不同氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合親和力和結(jié)合位點(diǎn)可能存在差異，這導(dǎo)致了T1R1/T1R3對(duì)不同氨基酸的感應(yīng)特異性。通過(guò)等溫滴定量熱法（ITC）和表面等離子共振技術(shù)（SPR）等生物物理方法的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸與T1R1/T1R3的結(jié)合親和力較高，其結(jié)合位點(diǎn)主要位于T1R1的捕蠅草結(jié)構(gòu)域；而其他氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合親和力相對(duì)較低，結(jié)合位點(diǎn)也可能有所不同。三、胞外氨基酸篩選實(shí)驗(yàn)3.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用C2C12細(xì)胞，其作為小鼠成肌細(xì)胞系，具有典型成肌細(xì)胞特性，在體外易于培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，是研究成肌細(xì)胞功能和機(jī)制的常用細(xì)胞模型。在試劑方面，高糖DMEM培養(yǎng)基為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含有豐富的氨基酸、維生素、糖類等成分。胎牛血清則富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，在細(xì)胞培養(yǎng)中不可或缺。青霉素-鏈霉素雙抗可有效抑制細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。胰蛋白酶用于細(xì)胞的消化傳代，能夠使貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，便于進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用到的各種氨基酸，包括常見的20種天然氨基酸，如L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-甘氨酸等，是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵試劑，用于處理成肌細(xì)胞，以篩選出能夠通過(guò)T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的胞外氨基酸。雷帕霉素作為mTOR抑制劑，用于抑制mTOR信號(hào)通路，作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照處理，以驗(yàn)證氨基酸對(duì)mTOR信號(hào)通路的激活作用是否依賴于mTOR的活性。CCK-8試劑盒用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，其原理是利用CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye），生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過(guò)檢測(cè)吸光度值即可反映細(xì)胞的增殖情況。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒用于分析細(xì)胞周期分布，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量的檢測(cè)，確定細(xì)胞處于G1期、S期還是G2/M期，從而了解氨基酸處理對(duì)成肌細(xì)胞周期的影響。RNA提取試劑盒用于提取細(xì)胞總RNA，其原理是利用裂解液裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)，然后通過(guò)離心、沉淀等步驟去除雜質(zhì)，最終獲得高純度的RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒用于檢測(cè)基因的表達(dá)水平，其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)不斷積累，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行絕對(duì)定量分析或通過(guò)內(nèi)參比較進(jìn)行相對(duì)定量分析。蛋白質(zhì)提取試劑盒用于提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)裂解細(xì)胞、離心等步驟，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)提取出來(lái)。BCA蛋白定量試劑盒用于測(cè)定蛋白濃度，其原理是在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2?結(jié)合，形成紫色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在562nm處有最大吸收峰，且吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。WesternBlot相關(guān)抗體，如抗T1R1抗體、抗T1R3抗體、抗p-mTOR抗體、抗mTOR抗體、抗p-S6K1抗體、抗S6K1抗體、抗p-4E-BP1抗體、抗4E-BP1抗體、抗β-actin抗體等，用于檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平?？筎1R1抗體和抗T1R3抗體可特異性識(shí)別T1R1和T1R3蛋白，檢測(cè)其在細(xì)胞中的表達(dá)情況?？筽-mTOR抗體、抗p-S6K1抗體、抗p-4E-BP1抗體分別用于檢測(cè)mTOR、S6K1、4E-BP1的磷酸化水平，反映mTOR信號(hào)通路的激活狀態(tài)。抗mTOR抗體、抗S6K1抗體、抗4E-BP1抗體則用于檢測(cè)這些蛋白的總表達(dá)量。抗β-actin抗體作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量的差異。免疫共沉淀試劑盒用于尋找與T1R1/T1R3相互作用的蛋白，其原理是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，將與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白共同沉淀下來(lái)，然后通過(guò)蛋白質(zhì)分析技術(shù)鑒定這些相互作用蛋白。激酶活性檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)相關(guān)激酶（如AKT、TSC1/TSC2等）在信號(hào)傳遞過(guò)程中的活性變化，通過(guò)檢測(cè)激酶對(duì)特定底物的磷酸化能力，來(lái)評(píng)估激酶的活性。在儀器設(shè)備方面，二氧化碳培養(yǎng)箱為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，維持溫度在37℃，二氧化碳濃度在5%，濕度在95%左右，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需求。超凈工作臺(tái)為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌環(huán)境，通過(guò)過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的污染。倒置顯微鏡用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，判斷細(xì)胞是否健康、是否達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的狀態(tài)。酶標(biāo)儀用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)和激酶活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，具有高精度和快速檢測(cè)的特點(diǎn)。流式細(xì)胞儀用于細(xì)胞周期分析和其他細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)和分析，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)參數(shù)，如細(xì)胞大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA含量等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，能夠精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)水平的準(zhǔn)確檢測(cè)。蛋白電泳儀用于蛋白質(zhì)的分離，通過(guò)在電場(chǎng)作用下，使蛋白質(zhì)在凝膠中遷移，根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和電荷不同，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。轉(zhuǎn)膜儀用于將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜或硝酸纖維素膜上，以便后續(xù)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)用于檢測(cè)WesternBlot實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶，通過(guò)化學(xué)發(fā)光底物與抗體結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)，然后通過(guò)成像系統(tǒng)捕捉熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白條帶的可視化和定量分析。低溫高速離心機(jī)用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)等樣品的離心分離，能夠在低溫條件下快速離心，保持樣品的生物活性。恒溫振蕩培養(yǎng)箱用于細(xì)胞的振蕩培養(yǎng)，可提供穩(wěn)定的溫度和振蕩條件，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。等溫滴定量熱儀（ITC）用于測(cè)定氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合親和力，通過(guò)測(cè)量氨基酸與T1R1/T1R3結(jié)合過(guò)程中的熱量變化，獲得結(jié)合常數(shù)、解離常數(shù)和結(jié)合焓等熱力學(xué)參數(shù)，深入了解氨基酸與T1R1/T1R3的相互作用機(jī)制。表面等離子共振儀（SPR）用于測(cè)定氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合和解離過(guò)程，獲得結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)和平衡解離常數(shù)等動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為研究氨基酸與T1R1/T1R3的相互作用提供重要信息。溶液配制方面，將高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗按照一定比例混合，配制成完全培養(yǎng)基，用于C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)。具體比例為高糖DMEM培養(yǎng)基90%，胎牛血清10%，青霉素-鏈霉素雙抗1%。用PBS緩沖液將各種氨基酸配制成100mM的母液，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液，用于處理成肌細(xì)胞。如將L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-賴氨酸等氨基酸分別配制成1mM、5mM、10mM等不同濃度的工作液。雷帕霉素用無(wú)水乙醇溶解，配制成10mM的母液，使用時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，如100nM。細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化過(guò)程如下：從液氮中取出凍存的C2C12細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，然后加入適量0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓、脫離瓶壁時(shí)，加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)需要誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為分化培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基中添加2%馬血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗。每24h更換一次分化培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。誘導(dǎo)分化成功時(shí)，可觀察到細(xì)胞融合形成多核肌管，呈現(xiàn)出典型的肌管形態(tài)。3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12成肌細(xì)胞接種于6孔板或96孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使其在培養(yǎng)過(guò)程中能夠均勻生長(zhǎng)且達(dá)到合適的融合度。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行藥物處理。在藥物處理環(huán)節(jié)，對(duì)于抑制劑處理組，向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加特定的抑制劑，如[Ca2?]i抑制劑BAPTA-AM，其作用是抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，以研究鈣離子在T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)通路中的作用。添加ERK1/2抑制劑U0126，可抑制ERK1/2信號(hào)通路的激活，從而探究該信號(hào)通路在這一調(diào)控過(guò)程中的影響。對(duì)于增強(qiáng)劑處理組，加入T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸增強(qiáng)劑，用于增強(qiáng)T1R1/T1R3對(duì)氨基酸的感應(yīng)能力，進(jìn)一步研究其對(duì)mTOR信號(hào)通路的作用。設(shè)置對(duì)照組，加入等量的溶劑（如DMSO等，其本身對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯影響），以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，排除溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在總RNA提取步驟，采用Trizol試劑法。以貼壁細(xì)胞樣品為例，棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，依照培養(yǎng)皿規(guī)格加入適量Trizol溶液，如6孔板的每孔加入1mLTrizol溶液，然后吹打混勻，并吸至無(wú)酶EP管中，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。接著每1mLTrizol溶液加入200μL三氯甲烷，立刻蓋上蓋子，強(qiáng)烈振蕩15s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置3-5min。隨后在4℃下，12000g離心15min，此時(shí)液體分為三層，RNA位于上層水相，約占總體積的50%，小心移至新無(wú)酶EP管中。加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次，不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置10min。再在4℃下，12,000g離心10min，可見羽毛狀白色RNA沉淀，小心吸出上清。用1mL75%乙醇沖洗兩次（4℃7500g離心5min，加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不可使用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀）。室溫干燥5-10min，注意不要干燥過(guò)度，否則會(huì)降低RNA的溶解度。視沉淀量加入適量DEPC水（最少15μL）溶解沉淀。首次提取RNA時(shí)須跑膠驗(yàn)證RNA質(zhì)量，核酸膠配置為1%瓊脂糖/1×TAE緩沖液，取5μLRNA溶液混上μLLoadingBuffer，上樣跑膠，電泳大約15min，凝膠成像儀上觀察RNA條帶質(zhì)量，理想的RNA條帶為明亮的28S條帶與18S條帶，并且28S條帶亮度大約為18S條帶兩倍，稍微或沒(méi)有5S條帶。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程使用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TakaraRR036A）。于200μL無(wú)酶PCR管中按反應(yīng)系統(tǒng)配置RT液，反應(yīng)系統(tǒng)為5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）2μL、總RNA500ng，用DEPC處理水補(bǔ)足至10μL。輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）、85℃5sec（反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)），最后4℃保存。獲取的RT反應(yīng)液使用NanoDrop測(cè)定cDNA濃度，-20℃保存。Q-PCR實(shí)驗(yàn)中，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)度。本實(shí)驗(yàn)采用SYBRGreen熒光染料，其能特異性結(jié)合DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號(hào)，且游離SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。QPCR每孔系統(tǒng)包含cDNA模板10pg-100ng、SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上游引物1μL，振蕩器振蕩或用槍吹打均勻，迷你離心機(jī)迅速離心去除氣泡。反應(yīng)條件根據(jù)不同的基因和引物進(jìn)行優(yōu)化設(shè)置，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)將熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)作圖，qPCR儀生成擴(kuò)增曲線。通過(guò)這個(gè)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)水平的量化。如果樣品中特定的序列（DNA或RNA）豐富，則在較早的循環(huán)中觀察到擴(kuò)增，Ct值??；如果序列稀少，則在稍后的循環(huán)中觀察到擴(kuò)增，Ct值大。利用2?ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析利用Q-PCR技術(shù)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞中T1R1/T1R3的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，C2C12成肌細(xì)胞中T1R1和T1R3基因均有明顯表達(dá)，且T1R1/T1R3的mRNA表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。這表明C2C12成肌細(xì)胞具備表達(dá)T1R1/T1R3的能力，為后續(xù)研究其感應(yīng)氨基酸的功能奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，在其他細(xì)胞類型如腸道上皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中，也檢測(cè)到了T1R1/T1R3的表達(dá)，且其表達(dá)水平與細(xì)胞的功能密切相關(guān)。在腸道上皮細(xì)胞中，T1R1/T1R3的高表達(dá)與腸道對(duì)氨基酸的吸收和消化功能增強(qiáng)有關(guān)。這進(jìn)一步說(shuō)明T1R1/T1R3在不同細(xì)胞類型中的廣泛表達(dá)及其在細(xì)胞生理功能中的重要作用。在C2C12細(xì)胞中進(jìn)行T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。[Ca2?]i抑制劑BAPTA-AM處理后，mTORC1的活性受到顯著抑制。與對(duì)照組相比，p-mTOR、p-S6K1等mTORC1相關(guān)蛋白的磷酸化水平明顯降低，表明細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化對(duì)mTORC1的激活具有重要影響。這一結(jié)果與已有研究中關(guān)于鈣離子在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的作用相呼應(yīng)，在許多細(xì)胞信號(hào)通路中，鈣離子作為重要的第二信使，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過(guò)程。當(dāng)[Ca2?]i抑制劑BAPTA-AM處理細(xì)胞時(shí)，抑制了細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，從而阻斷了鈣離子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致mTORC1的活性受到抑制。ERK1/2抑制劑U0126處理對(duì)mTORC1也產(chǎn)生了明顯影響。處理后，mTORC1相關(guān)蛋白的磷酸化水平下降，說(shuō)明ERK1/2信號(hào)通路在T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸調(diào)控mTORC1的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。ERK1/2作為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員，在細(xì)胞增殖、分化和存活等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本實(shí)驗(yàn)中，U0126抑制了ERK1/2的活性，進(jìn)而影響了mTORC1的激活，表明T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸后，可能通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)節(jié)mTORC1的活性。T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸增強(qiáng)劑處理對(duì)mTORC1有促進(jìn)激活的作用。增強(qiáng)劑處理后，mTORC1相關(guān)蛋白的磷酸化水平顯著升高，說(shuō)明增強(qiáng)T1R1/T1R3對(duì)氨基酸的感應(yīng)能力，能夠有效激活mTORC1。這進(jìn)一步證實(shí)了T1R1/T1R3在感應(yīng)氨基酸并調(diào)控mTORC1信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用。當(dāng)T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸增強(qiáng)劑處理細(xì)胞時(shí)，增強(qiáng)了T1R1/T1R3與氨基酸的結(jié)合能力，從而更有效地激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)mTORC1的激活。在影響T1R1/T1R3、mTOR信號(hào)的氨基酸篩選實(shí)驗(yàn)中，Westernblot驗(yàn)證結(jié)果表明，某些氨基酸處理能顯著影響細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，進(jìn)而對(duì)mTORC1產(chǎn)生影響。如谷氨酸處理組，細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度明顯升高，同時(shí)p-mTOR、p-S6K1等蛋白的磷酸化水平也顯著增加，說(shuō)明谷氨酸能夠通過(guò)T1R1/T1R3介導(dǎo)，影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而激活mTORC1。而天冬氨酸處理組，雖然細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度也有所升高，但mTORC1相關(guān)蛋白的磷酸化水平變化不明顯，表明不同氨基酸對(duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路的影響存在差異。已有研究表明，谷氨酸作為鮮味氨基酸，與T1R1/T1R3具有較高的親和力，能夠特異性地激活T1R1/T1R3，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致鈣離子濃度升高和mTORC1的激活。而天冬氨酸與T1R1/T1R3的結(jié)合親和力相對(duì)較低，可能無(wú)法有效地激活T1R1/T1R3，從而對(duì)mTORC1的影響較弱。采用SUNSET非放射性方法檢測(cè)蛋氨酸對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響，結(jié)果顯示，蛋氨酸處理組的蛋白質(zhì)合成速率明顯高于對(duì)照組。這表明蛋氨酸能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，進(jìn)一步說(shuō)明蛋氨酸對(duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路具有激活作用。蛋氨酸作為一種必需氨基酸，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中具有重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，蛋氨酸可能通過(guò)激活T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的活性，從而提高蛋白質(zhì)合成速率。Rapamycin處理對(duì)蛋氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生了抑制作用。Rapamycin作為mTOR抑制劑，能夠阻斷mTOR信號(hào)通路，使蛋氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成速率顯著下降。這進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋氨酸對(duì)蛋白質(zhì)合成的促進(jìn)作用依賴于mTOR信號(hào)通路的激活。當(dāng)Rapamycin處理細(xì)胞時(shí)，抑制了mTOR的活性，從而阻斷了蛋氨酸激活的T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成速率下降。通過(guò)Q-PCR檢測(cè)蛋氨酸對(duì)蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因Atrogin1及MuRF1水平的影響，結(jié)果顯示，蛋氨酸處理組中Atrogin1及MuRF1基因的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。這表明蛋氨酸能夠抑制蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明蛋氨酸通過(guò)激活T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路，不僅促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，還抑制蛋白質(zhì)降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的平衡。Atrogin1和MuRF1是肌肉特異性的E3泛素連接酶，在蛋白質(zhì)降解過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本實(shí)驗(yàn)中，蛋氨酸激活T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路后，可能通過(guò)抑制Atrogin1和MuRF1基因的表達(dá)，減少蛋白質(zhì)的降解，促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)和修復(fù)。3.4討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞的研究，成功鑒定了T1R1/T1R3在該細(xì)胞中的表達(dá)情況，為后續(xù)探究其在成肌細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。Q-PCR結(jié)果顯示，C2C12成肌細(xì)胞中T1R1和T1R3基因均有明顯表達(dá)，且表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。這一結(jié)果與以往在其他細(xì)胞類型中的研究結(jié)果相呼應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了T1R1/T1R3在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)的觀點(diǎn)。在腸道上皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中，T1R1/T1R3的表達(dá)也被檢測(cè)到，并且其表達(dá)水平與細(xì)胞的特定功能密切相關(guān)。在腸道上皮細(xì)胞中，T1R1/T1R3的高表達(dá)與腸道對(duì)氨基酸的吸收和消化功能增強(qiáng)有關(guān)。這表明T1R1/T1R3在不同細(xì)胞類型中可能具有相似的生物學(xué)功能，即通過(guò)感應(yīng)氨基酸來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)。對(duì)C2C12細(xì)胞中T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，揭示了其在調(diào)控mTORC1信號(hào)通路中的重要作用。[Ca2?]i抑制劑BAPTA-AM處理后，mTORC1的活性受到顯著抑制，p-mTOR、p-S6K1等mTORC1相關(guān)蛋白的磷酸化水平明顯降低。這表明細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化對(duì)mTORC1的激活具有關(guān)鍵影響，進(jìn)一步證明了鈣離子在T1R1/T1R3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中的重要作用。已有研究表明，鈣離子作為重要的第二信使，在許多細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸的過(guò)程中，鈣離子可能通過(guò)激活下游的信號(hào)分子，如蛋白激酶C（PKC）等，進(jìn)而調(diào)節(jié)mTORC1的活性。ERK1/2抑制劑U0126處理也對(duì)mTORC1產(chǎn)生了明顯影響，mTORC1相關(guān)蛋白的磷酸化水平下降。這說(shuō)明ERK1/2信號(hào)通路在T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸調(diào)控mTORC1的過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。ERK1/2作為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員，在細(xì)胞增殖、分化和存活等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在本實(shí)驗(yàn)中，U0126抑制了ERK1/2的活性，進(jìn)而影響了mTORC1的激活，表明T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸后，可能通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)節(jié)mTORC1的活性。T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸增強(qiáng)劑處理對(duì)mTORC1有促進(jìn)激活的作用，增強(qiáng)劑處理后，mTORC1相關(guān)蛋白的磷酸化水平顯著升高。這進(jìn)一步證實(shí)了T1R1/T1R3在感應(yīng)氨基酸并調(diào)控mTORC1信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用。當(dāng)T1R1/T1R3感應(yīng)氨基酸增強(qiáng)劑處理細(xì)胞時(shí)，增強(qiáng)了T1R1/T1R3與氨基酸的結(jié)合能力，從而更有效地激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)mTORC1的激活。在影響T1R1/T1R3、mTOR信號(hào)的氨基酸篩選實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)某些氨基酸處理能顯著影響細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度，進(jìn)而對(duì)mTORC1產(chǎn)生影響。谷氨酸處理組，細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度明顯升高，同時(shí)p-mTOR、p-S6K1等蛋白的磷酸化水平也顯著增加，說(shuō)明谷氨酸能夠通過(guò)T1R1/T1R3介導(dǎo)，影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而激活mTORC1。已有研究表明，谷氨酸作為鮮味氨基酸，與T1R1/T1R3具有較高的親和力，能夠特異性地激活T1R1/T1R3，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致鈣離子濃度升高和mTORC1的激活。而天冬氨酸處理組，雖然細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度也有所升高，但mTORC1相關(guān)蛋白的磷酸化水平變化不明顯，表明不同氨基酸對(duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路的影響存在差異。這可能是由于不同氨基酸與T1R1/T1R3的結(jié)合親和力和結(jié)合位點(diǎn)不同，導(dǎo)致其激活T1R1/T1R3的能力和引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑存在差異。采用SUNSET非放射性方法檢測(cè)蛋氨酸對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響，結(jié)果顯示蛋氨酸處理組的蛋白質(zhì)合成速率明顯高于對(duì)照組。這表明蛋氨酸能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，進(jìn)一步說(shuō)明蛋氨酸對(duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路具有激活作用。蛋氨酸作為一種必需氨基酸，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中具有重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，蛋氨酸可能通過(guò)激活T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成相關(guān)因子的活性，從而提高蛋白質(zhì)合成速率。Rapamycin處理對(duì)蛋氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生了抑制作用，Rapamycin作為mTOR抑制劑，能夠阻斷mTOR信號(hào)通路，使蛋氨酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成速率顯著下降。這進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋氨酸對(duì)蛋白質(zhì)合成的促進(jìn)作用依賴于mTOR信號(hào)通路的激活。通過(guò)Q-PCR檢測(cè)蛋氨酸對(duì)蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因Atrogin1及MuRF1水平的影響，結(jié)果顯示蛋氨酸處理組中Atrogin1及MuRF1基因的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。這表明蛋氨酸能夠抑制蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明蛋氨酸通過(guò)激活T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路，不僅促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，還抑制蛋白質(zhì)降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的平衡。Atrogin1和MuRF1是肌肉特異性的E3泛素連接酶，在蛋白質(zhì)降解過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本實(shí)驗(yàn)中，蛋氨酸激活T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路后，可能通過(guò)抑制Atrogin1和MuRF1基因的表達(dá)，減少蛋白質(zhì)的降解，促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)和修復(fù)。本研究結(jié)果為深入理解成肌細(xì)胞中T1R1/T1R3介導(dǎo)調(diào)控mTOR信號(hào)的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)篩選出能夠影響T1R1/T1R3和mTOR信號(hào)的氨基酸，明確了這些氨基酸在調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞功能中的作用，為進(jìn)一步研究肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和相關(guān)疾病的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討不同氨基酸對(duì)T1R1/T1R3-mTOR信號(hào)通路的具體調(diào)節(jié)機(jī)制，以及如何通過(guò)調(diào)節(jié)氨基酸水平來(lái)優(yōu)化肌肉生長(zhǎng)和修復(fù)過(guò)程。四、分子機(jī)制探究4.1蛋氨酸調(diào)控mTORC1的機(jī)制研究為深入