禽沙門氏菌病主要病原菌的比較基因組分析及其特異性抗原的搜尋研究一．研究目的沙門氏菌病是一種人畜共患病，禽沙門氏菌病是由腸桿菌科、沙門氏菌屬中沙門氏菌引起的禽類疾病總稱。家禽感染沙門氏菌后，生產(chǎn)性能會(huì)下降，如死淘率提高，產(chǎn)蛋率下降，受精率和孵化率下降，生長(zhǎng)速度變緩等。我國(guó)禽沙門氏菌病的發(fā)病較高，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病。故本項(xiàng)目利用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析不同型禽沙門氏菌株的基因組，并構(gòu)建可以反映各個(gè)菌株系統(tǒng)發(fā)育和水平基因轉(zhuǎn)移的全基因組進(jìn)化樹(shù)，之后篩選出各個(gè)菌株特有的或同源性較低的基因，從這些基因編碼的蛋白中預(yù)測(cè)篩選出可能具有較強(qiáng)免疫原性的外膜蛋白，預(yù)測(cè)其抗原決定簇，為日后禽沙門氏菌病的檢測(cè)和預(yù)防做鋪墊，對(duì)有針對(duì)性的采取相應(yīng)的凈化流程、減少禽傷寒的損失、有效的預(yù)防和截?cái)嗲輦膫鞑ゾ哂锌茖W(xué)指導(dǎo)意義。同時(shí)，基因組比較分析的結(jié)果還可以用于分析這幾種禽沙門氏菌的系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程。由于親緣關(guān)系十分接近，傳統(tǒng)的16S進(jìn)化樹(shù)無(wú)法準(zhǔn)確反映實(shí)際的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，故本項(xiàng)目計(jì)劃利用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析不同型禽沙門氏菌株的基因組，并構(gòu)建可以反映各個(gè)菌株系統(tǒng)發(fā)育和水平基因轉(zhuǎn)移的基因組進(jìn)化樹(shù)，之后篩選出各個(gè)菌株特有的或同源性較低的基因，從這些基因編碼的蛋白中預(yù)測(cè)篩選出可能具有較強(qiáng)免疫原性的外膜蛋白，預(yù)測(cè)其抗原決定簇，為日后禽沙門氏菌病的檢測(cè)和預(yù)防做鋪墊，對(duì)有針對(duì)性的采取相應(yīng)的凈化流程、減少禽傷寒的損失、有效的預(yù)防和截?cái)嗲輦膫鞑ゾ哂锌茖W(xué)指導(dǎo)意義。二．研究背景：沙門氏菌病是一種人畜共患病，家禽感染沙門氏菌后，生產(chǎn)性能會(huì)下降，如死淘率提高，產(chǎn)蛋率下降，受精率和孵化率下降，生長(zhǎng)速度變緩等。沙門氏菌還能通過(guò)垂直傳播感染雛雞，當(dāng)人食用被沙門氏菌污染的雞蛋或雞肉后可能會(huì)發(fā)生細(xì)菌性食物中毒。我國(guó)禽沙門氏菌病的發(fā)病較高，20世紀(jì)90年代種雞場(chǎng)陽(yáng)性率平均值為12％。近三年來(lái)，雞白痢發(fā)病數(shù)量占禽發(fā)病總數(shù)的1/3左右，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病。根據(jù)我國(guó)疫控中心的數(shù)據(jù)顯示，2016年，曾祖代蛋雞、祖代蛋雞、祖代肉雞，雞白痢和禽傷寒抗體的陽(yáng)性率分別高達(dá)25%、25%、35%。我國(guó)雞白痢發(fā)病多（占禽發(fā)病數(shù)量的1/3）、流行范圍廣泛（29?。?；中小規(guī)模（100只以下和101-1000頭之間）和散養(yǎng)戶發(fā)病率更高。禽類沙門氏菌感染對(duì)我國(guó)禽類生產(chǎn)造成重大損失，對(duì)人民健康也造成了很大威脅。食品安全是人類面臨的大問(wèn)題，沙門氏菌又是極其重要的一類。1885年沙門氏等在霍亂流行時(shí)分離到豬霍亂沙門氏菌，故定名為沙門氏菌屬。沙門氏菌屬有的專對(duì)人類致病，有的只對(duì)動(dòng)物致病，也有對(duì)人和動(dòng)物都致病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對(duì)人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。因沙門氏菌病經(jīng)糞口途徑傳播，故攝入污染了沙門氏菌的食物或飲料是唯一的感染方式。沙門氏菌在自然界有廣泛的宿主，少數(shù)沙門氏菌對(duì)宿主有選擇性，絕大多數(shù)對(duì)人和動(dòng)物均適應(yīng)，可寄居在哺乳類、爬行類、鳥(niǎo)類、昆蟲(chóng)及人的胃腸道中，種類繁多的家養(yǎng)和野生動(dòng)物的感染率在1%~20%以上。故各種家禽、家畜在喂養(yǎng)、屠宰、運(yùn)輸、包裝等加工處理過(guò)程中均有污染的機(jī)會(huì)。如家禽、家畜屠宰時(shí)的衛(wèi)生條件差，腸腔的沙門氏菌就可污染肉類。此外，肉類等也可在貯藏、市場(chǎng)出售、廚房加工等過(guò)程中通過(guò)各種用具或直接互相污染，其中在零售市場(chǎng)購(gòu)買的生肉有1%~58%污染了沙門菌。蛋類或蛋制品的污染來(lái)源，可以是禽類卵巢或輸尿管，也可以由糞便、肥料、泥土中的沙門氏菌穿過(guò)完整蛋殼進(jìn)入蛋內(nèi)。一般在許多由蛋混合制成的蛋粉或其他制品中，感染率相當(dāng)高:乳類及其制品如冰淇淋、袋裝熟食等也會(huì)受到沙門氏菌的污染。以上各種動(dòng)物源性食物是引起沙門氏菌感染的最常見(jiàn)媒介物。以動(dòng)物臟器為原料的某些生物制劑，如酶、激素、膽鹽、食用染料等偶爾也會(huì)引起感染。發(fā)展中國(guó)家常常有水源污染造成的暴發(fā)流行，污水灌溉、生熟不分是散發(fā)或家庭集團(tuán)內(nèi)流行最常見(jiàn)的原因。人與人的直接傳播常以護(hù)理人員的手、醫(yī)療器械為媒介，為醫(yī)院內(nèi)感染或幼托機(jī)構(gòu)中暴發(fā)流行的主要原因。三．研究方法：1.分離收集沙門氏菌的相關(guān)菌株基因組數(shù)據(jù)。從NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)下載多種沙門氏菌的全基因組數(shù)據(jù)。2.對(duì)多個(gè)禽沙門氏菌株基因組中的所有蛋白進(jìn)行同源性比較，篩選出各個(gè)菌株特有的或同源性較低的基因。3.用于分析的沙門氏菌株（見(jiàn)下表）。4.不同種屬及亞種沙門菌基因組比較。5.構(gòu)建28株完全測(cè)序沙門菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。四．研究結(jié)果：1.28株完全測(cè)序沙門菌基因數(shù)目與基因組大小頻數(shù)分布圖上圖為已測(cè)序的28株菌的基因數(shù)與基因組大小的頻數(shù)分布圖，從圖中可以看的腸道沙門閣-般基因數(shù)量為4600-4700.基因組大小一般在4.8-5.0Mb之間。2.沙門菌致病島在不同種屬及亞種菌株中的分布已完成全基因組測(cè)序的28個(gè)沙門菌中SamorellarentericaTyphiCT18基因組最大，為5,133.713bp.SalmoneilabongoriNCTC12419基因組最小，為4.460.105.而編碼基因最多的足SalmonellarentericoParalyphiB,SPB7，為5772個(gè)，編碼基因最少的還是SalmonellabongoriNCTC12419。3.28株完全測(cè)序沙門菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)五．討論：沙門菌是寄居在人類動(dòng)物腸道內(nèi)生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭陰性桿菌。它是一種腸道致病菌，常常因?yàn)檎`食不潔食物引起，感染者出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉。是人類食物中毒的主要病原之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，1985年以來(lái)，在世界范圍內(nèi)，由沙門氏菌引起的已確診的人類患病人數(shù)顯著增加，在一些歐洲國(guó)家已增加五倍以上。在我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)，由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中，70%~80%是由沙門氏菌引起，而在引起沙門氏菌中毒的食品中，90%以上是肉類等動(dòng)物性產(chǎn)品。動(dòng)物性產(chǎn)品中含有多種豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，非常適宜于沙門氏菌的生長(zhǎng)繁殖，人們一旦攝入了含有大量沙門氏菌(10E5~10E6個(gè)/g)的動(dòng)物性產(chǎn)由沙門氏菌引起的疾病主要分為兩大類:一類是傷寒和副傷寒，另一類是急性腸胃炎。其中鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等是污染動(dòng)物性產(chǎn)品，進(jìn)而引起人類沙門氏菌食物中毒的主要致病菌。沙門氏菌污染主要來(lái)源于患病的人和動(dòng)物及其帶菌者，主要由其糞便、尿、乳汁以及流產(chǎn)胎兒、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和飼料等，其中飼料和水源的污染是導(dǎo)致沙門氏菌傳染的主要原因。各種飼料中均可發(fā)現(xiàn)沙門氏菌，尤其是動(dòng)物性飼料(如魚(yú)粉)常見(jiàn)。禽畜感染沙門氏菌可引起相應(yīng)的傳染病，如豬霍亂、雞白痢等。一般情況下畜禽腸道帶菌率比較高，當(dāng)動(dòng)物因患病、衰弱、營(yíng)養(yǎng)不良、疲勞以致抵抗力降低時(shí)，腸道中的沙門氏菌即可經(jīng)腸系膜淋巴結(jié)和組織進(jìn)入血液引起全身感染，甚至死亡。例如，豬霍亂沙門氏菌可引起仔豬副傷寒，急性病例出現(xiàn)敗血癥變化，死亡率相當(dāng)高。慢性病例產(chǎn)生壞死性腸炎，影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育。雞白痢沙門氏菌，主要侵害雛雞，引起敗血癥，可造成大批死亡。在成年母雞則主要引起孵巢炎，可在卵黃內(nèi)帶菌而傳給幼雛。后續(xù)將從基因組水平對(duì)不同血清型的禽沙門氏菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。針對(duì)親緣關(guān)系十分接近的禽沙門氏菌，傳統(tǒng)的單一基因進(jìn)化樹(shù)無(wú)法準(zhǔn)確反映各個(gè)菌株間的進(jìn)化和水平基因轉(zhuǎn)移。后續(xù)將采用自主研發(fā)的程序?qū)⑷蚪M上千個(gè)基因進(jìn)化樹(shù)綜合構(gòu)建為可以準(zhǔn)確反映各個(gè)菌株系統(tǒng)發(fā)育和水平基因轉(zhuǎn)移的超級(jí)進(jìn)化樹(shù)。深化對(duì)不同血清型沙門氏菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和毒力、耐藥性的傳播等的研究。后續(xù)將利用生物信息學(xué)方法高通量預(yù)測(cè)專一性抗原的抗原決定簇，并采用抗原決定簇肽段替代全蛋白作為檢測(cè)抗原。此方法將極大地降低生產(chǎn)成本，顯著地提高抗原的免疫原性?；瘜W(xué)合成的肽段的純度、一致性、穩(wěn)定性完全可以保證，也便于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定。之后對(duì)篩選出的各個(gè)菌株特有的或同源性較低的基因編碼的蛋白預(yù)測(cè)篩選出可能具有較強(qiáng)免疫原性的外膜蛋白。由于直接將蛋白用于免疫檢測(cè)診斷容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，降低檢測(cè)的特異性和靈敏度，也將提高研發(fā)和生產(chǎn)成本，因此鑒定到的特異性抗原蛋白將利用軟件預(yù)測(cè)其抗原決定簇，但生物信息學(xué)篩選出的蛋白將會(huì)很多，而一個(gè)蛋白通常有多個(gè)抗原決定簇。我們將裂解沙門氏菌細(xì)胞，利用超速離心的方法分離得到不同的外膜組分。對(duì)分離的得到的外膜蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，尋找各個(gè)菌株的特異性蛋白，并用IEDB

Analysis等軟件預(yù)測(cè)其抗原決定簇肽段序列。六．展望沙門氏菌病是一種人畜共患病，家禽感染沙門氏菌后，生產(chǎn)性能會(huì)下降，如死淘率提高，產(chǎn)蛋率下降，受精率和孵化率下降，生長(zhǎng)速度變緩等。本項(xiàng)目為日后禽沙門氏菌病的檢測(cè)和預(yù)防做鋪墊，對(duì)有針對(duì)性的采取相應(yīng)的凈化流程、減少禽傷寒的損失、有效的預(yù)防和截?cái)嗲輦膫鞑ゾ哂锌茖W(xué)指導(dǎo)意義。同時(shí)，研究結(jié)果將為我們了解不同血清型沙門氏菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和毒力、耐藥性的傳播等等具有重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。從基因組水平對(duì)不同血清型的禽沙門氏菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。針對(duì)親緣關(guān)系十分接近的禽沙門氏菌，傳統(tǒng)的單一基因進(jìn)化樹(shù)無(wú)法準(zhǔn)確反映各個(gè)菌株間的進(jìn)化和水平基因轉(zhuǎn)移。本項(xiàng)目將全基因組上千個(gè)基因進(jìn)化樹(shù)綜合構(gòu)建為可以準(zhǔn)確反映各個(gè)菌株系統(tǒng)發(fā)育和水平基因轉(zhuǎn)移的進(jìn)化樹(shù)。深化對(duì)不同血清型沙門氏菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和毒力、耐藥性的傳播等的研究。利用比較基因組、比較蛋白質(zhì)組等研究方法篩選鑒定不同禽類傷寒病原體的特異性抗原蛋白，并進(jìn)一步得到專一、高效、準(zhǔn)確的特異性免疫檢測(cè)抗原肽段。并通過(guò)產(chǎn)品轉(zhuǎn)化，使得通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色、試紙等方法就能快速的鑒定禽類感染了哪種傷寒病原體。從而能有針對(duì)性的采取相應(yīng)的凈化流程，減少禽傷寒的損失，并有效的預(yù)防和截?cái)嗲輦膫鞑?。降低禽類養(yǎng)殖的成本，保證禽蛋食品的安全。參考文獻(xiàn)[1]馮杰.嗜鹽古生菌Natrinemasp.J7-2全基因組分析及其分泌蛋白質(zhì)組初步研究[D].武漢大學(xué),2012.[2]蘇遠(yuǎn)科,王志宏,郭曉燕,呂斐,崔常勇.16SrRNA序列分析在沙門氏菌鑒定分型中的應(yīng)用[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2017,8(11):4153-4160.[3]秦娜,楊金寶.禽沙門氏菌病的流行情況與防控措施[J].現(xiàn)代畜牧科技,2018(12):97.

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