基因工程的概念與誕生基因工程，又稱為基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。其核心要義在于，按照人們的主觀意愿，在體外對不同來源的基因（通常是DNA分子）進(jìn)行“剪切”、“拼接”和“重新組合”，然后將這個人工構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入到特定的宿主細(xì)胞內(nèi)，使其能夠在宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物，或者使得受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀。這項(xiàng)技術(shù)的誕生，徹底打破了物種之間的天然生殖隔離，使得人類能夠跨越物種界限，定向地改造生物的遺傳特性，因而也被形象地稱為“遺傳工程”?；蚬こ痰恼Q生并非偶然，它是在一系列重要的理論突破和技術(shù)發(fā)明的基礎(chǔ)上逐步發(fā)展起來的。在理論基礎(chǔ)方面，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的提出，明確了遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和復(fù)制方式，為人們認(rèn)識DNA、操作DNA奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基石；證實(shí)了DNA是遺傳物質(zhì)，闡明了遺傳信息的傳遞方式（中心法則），即DNA通過復(fù)制將遺傳信息傳遞給子代DNA，通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再通過翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這使得人們能夠理解基因的表達(dá)機(jī)制；此外，遺傳密碼的通用性也為基因工程提供了可能，即幾乎所有的生物都使用同一套遺傳密碼，這意味著一種生物的基因可以在另一種生物體內(nèi)被正確解讀和表達(dá)。在技術(shù)支持方面，限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，如同“分子手術(shù)刀”，使得人們能夠在體外精確地切割DNA分子；DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)，則像“分子縫合針”，能夠?qū)⒉煌腄NA片段連接起來，形成重組DNA分子；而基因載體（如質(zhì)粒、噬菌體和病毒等）的發(fā)現(xiàn)和改造，則為重組DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞提供了“分子運(yùn)輸車”。正是這些理論與技術(shù)的雙重突破，共同催生了基因工程這一革命性的生物技術(shù)?；蚬こ痰暮诵墓ぞ呋蚬こ痰牟僮麟x不開一系列關(guān)鍵的工具酶和載體，它們是實(shí)現(xiàn)基因“剪切”、“拼接”與“運(yùn)輸”的核心保障。限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）限制酶主要來源于原核生物，其天然功能是原核生物抵御外來入侵的噬菌體DNA，從而保護(hù)自身遺傳物質(zhì)的一種防御機(jī)制。限制酶能夠識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列，這種序列通常具有回文結(jié)構(gòu)，即從序列的兩端向中間讀取，堿基序列是相同的。識別序列的長度大多為4-8個核苷酸對。一旦識別到特定序列，限制酶就會在特定的位點(diǎn)上切割DNA分子的磷酸二酯鍵。根據(jù)切割方式的不同，限制酶切割后會產(chǎn)生兩種末端：一種是切割位點(diǎn)在識別序列的中軸線兩側(cè)，形成的末端帶有幾個伸出的核苷酸，稱為黏性末端；另一種是切割位點(diǎn)在識別序列的中軸線處，形成的末端是平整的，稱為平末端。在基因工程中，人們正是利用限制酶的這種特異性切割能力，來獲取目的基因和切割載體，以便后續(xù)的連接操作。DNA連接酶DNA連接酶的作用是將兩個DNA片段連接起來，形成一個完整的DNA分子。它的作用位點(diǎn)是DNA分子骨架上的磷酸二酯鍵，這一點(diǎn)與限制酶的作用位點(diǎn)恰好相反，限制酶是切斷磷酸二酯鍵，而連接酶是形成磷酸二酯鍵。在基因工程中，常用的DNA連接酶主要有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的E·coliDNA連接酶，另一種是從T4噬菌體中分離得到的T4DNA連接酶。E·coliDNA連接酶主要用于連接黏性末端，而T4DNA連接酶不僅能連接黏性末端，也能連接平末端，不過連接平末端的效率相對較低。DNA連接酶在基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程中起著至關(guān)重要的“縫合”作用，它將目的基因與載體通過磷酸二酯鍵牢固地連接在一起?；蜻M(jìn)入受體細(xì)胞的載體（運(yùn)載體）單獨(dú)的目的基因片段很難直接進(jìn)入受體細(xì)胞并在其中穩(wěn)定存在和表達(dá)，因此需要一個“分子運(yùn)輸車”——載體。作為載體，需要具備以下幾個基本條件：首先，能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或者整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，隨染色體DNA一同復(fù)制，以保證目的基因能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳；其次，具有一個或多個限制酶的切割位點(diǎn)，這些位點(diǎn)應(yīng)該是獨(dú)特的，并且位于不影響載體自身復(fù)制功能的區(qū)域，以便目的基因能夠插入其中；再次，具有某些標(biāo)記基因，這些標(biāo)記基因通常是一些抗性基因（如抗氨芐青霉素基因、抗四環(huán)素基因等）或能夠產(chǎn)生特定顏色反應(yīng)的基因（如熒光標(biāo)記基因），便于對含有目的基因的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定；最后，載體的分子量應(yīng)盡可能小，以便于操作，并且在導(dǎo)入受體細(xì)胞時應(yīng)具有較高的轉(zhuǎn)化效率，同時對受體細(xì)胞無害。在基因工程中，常用的載體種類主要有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子，主要存在于細(xì)菌和酵母菌等微生物細(xì)胞中。由于其分子小、易操作、能自主復(fù)制且?guī)в袠?biāo)記基因等特點(diǎn)，質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蚧蚬こ痰幕静僮鞒绦蚩梢愿爬樗膫€主要步驟：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定。這四個步驟環(huán)環(huán)相扣，缺一不可。目的基因的獲取目的基因是指人們所需要的特定基因，它可以是編碼某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子。獲取目的基因是基因工程操作的第一步，也是關(guān)鍵的一步。目前常用的方法主要有以下幾種：從基因文庫中獲取目的基因是一種傳統(tǒng)但有效的方法。基因文庫是指將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因?；蛭膸炀拖褚粋€儲存著海量基因資源的“圖書館”?；蛭膸彀ɑ蚪M文庫和部分基因文庫（如cDNA文庫）?；蚪M文庫包含了一種生物所有的基因；而cDNA文庫則是以某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄過程合成cDNA（互補(bǔ)DNA），再與載體連接后導(dǎo)入受體菌形成的，它只包含了該生物在特定時期表達(dá)的部分基因。從基因文庫中篩選目的基因，可以根據(jù)目的基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來進(jìn)行。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因是目前應(yīng)用非常廣泛的一種方法。PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是一項(xiàng)在生物體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。其原理是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過程，在體外通過控制溫度等條件，使DNA在DNA聚合酶的催化下進(jìn)行指數(shù)級擴(kuò)增。進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要模板DNA（含有目的基因）、一對與目的基因兩端序列互補(bǔ)的引物、四種脫氧核苷酸（dNTP）以及熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq酶）等條件。PCR技術(shù)能夠快速、高效地獲取大量的目的基因片段，尤其適用于目的基因序列已知的情況。如果目的基因的核苷酸序列是已知的，并且比較短小，也可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。這種方法準(zhǔn)確性高，但成本也相對較高，適用于合成一些小片段的基因?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟。僅僅將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞是不夠的，還需要讓目的基因能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在、復(fù)制并能夠表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。因此，必須構(gòu)建一個合適的基因表達(dá)載體。一個基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因外，還必須包含啟動子、終止子以及標(biāo)記基因等關(guān)鍵組件。啟動子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。終止子位于基因的尾端，作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來。標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。構(gòu)建基因表達(dá)載體的大致過程是：用同一種限制酶（或能產(chǎn)生相同末端的限制酶）分別切割載體和含有目的基因的DNA片段，使其產(chǎn)生相同的黏性末端（或平末端），然后在DNA連接酶的作用下，將目的基因片段插入到載體的特定位置，形成一個重組DNA分子，即基因表達(dá)載體。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將構(gòu)建好的基因表達(dá)載體（重組DNA分子）導(dǎo)入受體細(xì)胞，是實(shí)現(xiàn)目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的前提。受體細(xì)胞可以是植物細(xì)胞、動物細(xì)胞或微生物細(xì)胞（如大腸桿菌、酵母菌等）。根據(jù)受體細(xì)胞的類型不同，所采用的導(dǎo)入方法也有所差異。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法等。農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，它能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，并將其Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移DNA）轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。利用農(nóng)桿菌的這一特性，科學(xué)家們將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域，通過農(nóng)桿菌的感染，就可以將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，并使其整合到植物細(xì)胞的染色體DNA中，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定遺傳?；驑尫ǎㄎ椶Z擊法）是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的重組DNA分子高速射入受體細(xì)胞中，適用于單子葉植物等?；ǚ酃芡ǖ婪▌t是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，將含有目的基因的DNA溶液滴加在柱頭上，使目的基因通過花粉管進(jìn)入胚囊，并導(dǎo)入受精卵或其細(xì)胞中，最終整合到受體細(xì)胞的基因組中。將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞，最常用的方法是顯微注射技術(shù)。這種方法是在顯微鏡下，用一根極細(xì)的玻璃針（顯微注射針）將重組DNA分子直接注射到受精卵的細(xì)胞核內(nèi)。此外，還有滅活的病毒介導(dǎo)法等。將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞，常用感受態(tài)細(xì)胞法。由于微生物（如大腸桿菌）細(xì)胞膜的通透性較低，需要先用Ca2?處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。然后將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。大腸桿菌因其繁殖快、易培養(yǎng)、遺傳背景清楚等特點(diǎn)，常被用作受體細(xì)胞。目的基因的檢測與鑒定目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否能夠穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能確定。這一步驟是對基因工程操作結(jié)果的檢驗(yàn)，確保整個工程的成功。檢測與鑒定可以從不同的水平進(jìn)行。首先，要進(jìn)行分子水平的檢測，這是最直接、最關(guān)鍵的檢測。第一步是檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，常用的方法是DNA分子雜交技術(shù)（Southernblotting）。其基本原理是將轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA提取出來，用限制性酶切割后進(jìn)行電泳分離，再將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后與用放射性同位素或其他標(biāo)記物標(biāo)記的目的基因探針進(jìn)行雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中。第二步是檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，常用的方法是分子雜交技術(shù)中的Northernblotting。該方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄等步驟獲得cDNA，或者直接將mRNA進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，與標(biāo)記的目的基因探針進(jìn)行雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則表明目的基因已轉(zhuǎn)錄出mRNA。第三步是檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，常用的方法是抗原-抗體雜交技術(shù)（Westernblotting）。其原理是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測，如果出現(xiàn)雜交帶，說明目的基因已成功表達(dá)出蛋白質(zhì)。其次，除了分子水平的檢測，還需要進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定。這是在個體水平上，通過觀察轉(zhuǎn)基因生物是否表現(xiàn)出目的基因所控制的性狀，來確定目的基因是否真正發(fā)揮了功能。例如，若目的基因是抗蟲基因，就需要進(jìn)行抗蟲接種實(shí)驗(yàn)，觀察轉(zhuǎn)基因植株是否能有效抵抗害蟲的侵害；若目的基因是抗病基因，則需要進(jìn)行抗病性鑒定等。個體水平的鑒定是對基因表達(dá)最終效果的檢驗(yàn)。通過以上一系列的檢測與鑒定步驟，才能最終確認(rèn)基因工程是否獲得了成功的轉(zhuǎn)基因生物。基因工程的應(yīng)用與發(fā)展前景基因工程自誕生以來，在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的發(fā)展前景。在醫(yī)藥衛(wèi)生方面，基因工程藥物（如人胰島素、干擾素、生長激素、疫苗等）的研制成功，為疾病的預(yù)防和治療帶來了革命性的變化；基因診斷和基因治療也為攻克遺傳性疾病和疑難雜癥提供了新的思路和方法。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，通過基因工程技術(shù)培育的抗蟲、抗病、抗逆（如抗除草劑、抗鹽堿、抗干旱）、改良品質(zhì)（如延熟保鮮、增加營養(yǎng)成分）的轉(zhuǎn)基因作物，極大地提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，減少了農(nóng)藥的使用，保護(hù)了生態(tài)環(huán)境。在環(huán)境保護(hù)方面，基因工程技術(shù)可以