ICS65.020.30

CCSB44

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CAAA×××—2022

梅花鹿胚胎凍存技術(shù)規(guī)范

Specificationforembryocryopreservationofsikadeer

（征求意見(jiàn)稿）

2022-××-××發(fā)布2022-××-××實(shí)施

中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布

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梅花鹿胚胎凍存技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了梅花鹿胚胎凍存生產(chǎn)基本要求、超數(shù)排卵、采胚、檢胚及凍前處理、胚胎

冷凍與貯存。

本文件適用于梅花鹿胚胎的冷凍保存。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T25881牛胚胎

NY/T1900畜禽細(xì)胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范

NY/T1674牛羊胚胎質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4基本要求

4.1人員

4.1.1由鹿保定人員、操作助手、采胚人員、胚胎檢測(cè)人員組成。

4.1.2應(yīng)具有一定的專業(yè)理論基礎(chǔ)或現(xiàn)場(chǎng)工作經(jīng)驗(yàn)，無(wú)人獸共患傳染病。

4.1.3操作中應(yīng)嚴(yán)格消毒，戴手套，穿工作服。

4.1.4應(yīng)事先分工，操作過(guò)程中須密切配合。

4.2操作室

4.2.1應(yīng)有采胚、檢胚、凍胚的功能分區(qū)。

4.2.2應(yīng)安全、通風(fēng)、保溫和衛(wèi)生，設(shè)照明、電源插座和操作臺(tái)，面積以15m2～25m2為

宜。

4.2.3墻壁、地面應(yīng)采用便于消毒、防水的材質(zhì)。

4.2.4操作前應(yīng)采用無(wú)刺激性氣味的消毒液和紫外線燈進(jìn)行消毒殺菌。

4.3藥品器械

4.3.1操作前備齊藥品與器械，具體參見(jiàn)附錄A。

4.3.2接觸胚胎的器皿應(yīng)清潔衛(wèi)生。

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4.3.3消毒后的器械應(yīng)用鋁箔紙或封口紙封好備用。

4.4供體鹿

4.4.1健康無(wú)傳染性疾病。

4.4.2無(wú)繁殖性疾病。

4.4.3生殖器官、機(jī)能正常。

4.4.4體況良好，中上等體況。

4.4.5經(jīng)產(chǎn)，產(chǎn)后120天以上的母鹿。

5超數(shù)排卵

5.1宜9月~12月進(jìn)行。

5.2超數(shù)排卵前應(yīng)補(bǔ)飼20天以上，營(yíng)養(yǎng)應(yīng)全價(jià)均衡，主要補(bǔ)飼VA、VD、VE、Se、Zn等維

生素和微量元素。

5.3程序

5.3.1宜采用CIDR+FSH方案，具體程序參見(jiàn)附錄B。

5.3.2埋栓和取栓。埋置陰道栓CIDR（孕酮含量300mg），埋置當(dāng)天記為第0天，第9

天開(kāi)始注射促卵泡素（FSH），以后每天早晚各注射1次，間隔12小時(shí)，4天8次等量或減

量注射，共注射FSH320mg，第7次注射FSH時(shí)取栓。

5.3.3人工輸精。取栓后采用公鹿試情結(jié)合行為觀察的方法進(jìn)行發(fā)情鑒定，母鹿從接受試

情公鹿爬跨到拒絕爬跨行為變的較安穩(wěn)時(shí)進(jìn)行第1次輸精，間隔6h~8h進(jìn)行第2次輸精。

6采胚

6.1應(yīng)在人工輸精后6天~7天采集胚胎。

采胚操作前應(yīng)按本文件4條款的要求提前準(zhǔn)備器械藥品，沖卵管須檢查氣囊是否漏氣，沖胚

液預(yù)熱到35℃~37℃。

6.2對(duì)采胚鹿進(jìn)行麻醉保定后運(yùn)回采胚室，放于保定架上，呈前低后高呈仰臥保定姿勢(shì)。

6.3宜采用手術(shù)法進(jìn)行胚胎采集。

6.3.1術(shù)部備皮。術(shù)部位于腹部中線距乳房約4cm處，術(shù)前用刀片對(duì)術(shù)部進(jìn)行備皮，用溫

水清洗，5%碘酊和75%酒精消毒。

6.3.2在腹部中線距乳房基部前4cm處做一切口，然后將兩側(cè)子宮角和輸卵管暴露，用腹

腔鏡觀察左右卵巢上的黃體發(fā)生情況并記錄。

6.3.3在一側(cè)子宮角基部用止血鉗穿孔，插入沖胚管，由充氣管注入5mL~10mL空氣，使

氣囊封阻子宮腔；在子宮角和輸卵管結(jié)合部的子宮角端插入套管針，拔出針芯，將裝有PBS

的50mL注射器接到套管針上然后注入35℃~37℃的PBS30mL~50mL，將胚胎從子宮角

的上端沖出，由沖胚管的出液孔收集于培養(yǎng)皿中，放氣后取下沖胚管。

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6.3.4按6.3.3條款方法沖取另一側(cè)子宮角的胚胎。

6.3.5沖胚完成后將子宮角放回體內(nèi)，并用0.9%的生理鹽水進(jìn)行沖洗，并注入2mL石蠟

液以防止生殖道粘連。

6.3.6縫合和消毒。左右子宮角創(chuàng)口各縫1針，腹膜和肌肉層連續(xù)縫合，皮膚結(jié)結(jié)縫合，

用5%碘酊消毒。術(shù)后三天內(nèi)每天注射2次抗生素。

7檢胚及凍前處理

7.1檢前處理

用20G針頭的注射器吸20mL沖胚液從上向下沖洗集卵杯內(nèi)側(cè)的尼龍網(wǎng)4次~5次，清

除杯中的泡沫后待檢。

7.2鏡檢

7.2.1將回收沖胚液的平皿在10倍~20倍體視顯微鏡下，從上到下、從左到右或從外到內(nèi)

Z字形移動(dòng)，用吸胚管將找到的胚胎移入培養(yǎng)皿中的保存液小滴中。

7.2.2再將同一供體母鹿的胚胎從液滴中全部吸出移到新液滴，反復(fù)洗滌胚胎3次~5次。

7.2.3然后將體視鏡放大至50倍以上，進(jìn)行胚胎質(zhì)量鑒定和分級(jí)。

7.3胚胎等級(jí)鑒定

7.3.1胚胎發(fā)育階段分類參見(jiàn)附錄C或NY/T1674。

7.3.2胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)參見(jiàn)附錄D或GB/T25881。

7.3.3胚胎等級(jí)達(dá)到A級(jí)、B級(jí)的可用于冷凍。

7.4胚胎洗滌

用于冷凍的胚胎應(yīng)用保存液洗滌5次，每次洗滌不少于200uL，每組清洗胚胎數(shù)不能

超過(guò)10枚，每次清洗應(yīng)更換吸管，每次清洗胚胎帶入平皿中的液體量不能超過(guò)1%。

8胚胎冷凍

8.1乙二醇冷凍法

8.1.1平衡。將胚胎放入1.5mol/L或1.8mol/L乙二醇冷凍保護(hù)液中，平衡10min。

8.1.2裝管。平衡后應(yīng)迅速將胚胎裝入0.25mL細(xì)管，每支細(xì)管以裝1枚胚胎為宜，裝管

順序應(yīng)按乙二醇液、氣泡、含有胚胎的乙二醇液、氣泡、乙二醇液進(jìn)行，裝管后，用標(biāo)簽塞

插入封口端進(jìn)行封口。

8.1.3標(biāo)記。細(xì)管應(yīng)進(jìn)行明確的標(biāo)記，注明生產(chǎn)單位、生產(chǎn)時(shí)間、品種、供體鹿號(hào)、發(fā)育

階段、等級(jí)、質(zhì)量級(jí)別、數(shù)量等。

8.1.4植冰。將冷凍儀的程序調(diào)到“0”程序時(shí)，等溫度達(dá)到-6℃或-7℃時(shí)將胚胎放入冷

凍儀平衡5min后，用經(jīng)過(guò)液氮冷卻后的鑷子夾住遠(yuǎn)離胚胎端的細(xì)管封口端植冰。

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8.1.5程序冷凍。植冰后，平衡10min，以0.3℃/min~0.5℃/min速率進(jìn)行降溫，達(dá)到

-32℃~-35℃時(shí)，平衡10min，把細(xì)管投入液氮中。

8.2甘油冷凍法

應(yīng)按NY/T1900的規(guī)定執(zhí)行。

9貯存

細(xì)管無(wú)破損，標(biāo)記清晰、完整、準(zhǔn)確后貯存，并進(jìn)行記錄（見(jiàn)附錄E）。

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附錄A

（資料性附錄）

冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品表

A.1冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品表

冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品見(jiàn)表A.1。

A.1冷凍胚胎生產(chǎn)常用器材藥品表

項(xiàng)目序號(hào)器材藥品

1CIDRFSH

2埋栓器麻醉、蘇醒藥

3吹管/吹彈75%酒精

4輸精槍0.9%生理鹽水

超數(shù)排卵

5工作服、乳膠手套

6紫外線消毒燈

7恒溫水浴鍋

8注射器

9保定架Holding胚胎保護(hù)液

10子宮頸擴(kuò)張棒PG氯前列烯醇

11子宮頸粘液吸除器液體石蠟

12沖卵管抗生素

13集卵杯5%碘酊

14過(guò)濾器

沖胚15縫合針（線）

16手術(shù)刀（止血鉗）

17備毛刀片

18創(chuàng)巾

19腹腔鏡

20消毒噴壺

21曲別針

22體視顯微鏡

23培養(yǎng)皿

檢胚

24吸胚管

25移液器

26胚胎冷凍儀1.5mol/L或1.8mol/L乙二醇冷凍保護(hù)液（自配）

27液氮罐1.4mol/L(10%)甘油冷凍保護(hù)液（自配）

280.25mL細(xì)管

胚胎冷凍

29細(xì)管棉塞

30指拇管

31油性號(hào)筆

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附錄B

（資料性附錄）

超數(shù)排卵用藥程序

B.1超數(shù)排卵用藥程序

超數(shù)排卵用藥程序見(jiàn)表B.1。

B.1超數(shù)排卵用藥程序

項(xiàng)目埋栓、取栓輸精

第0天....第9天第10天第11天第12天第13天

時(shí)間

取栓后

公鹿試情

輸精或50

小時(shí)、58

埋栓第7次注射FSH時(shí)取栓

小時(shí)各輸

精1次

早：40IU早：40IU早：40IU

等量法早：40IU

晚：40IU晚：40IU晚：40IU晚：40IU

處理

注射FSH

早：50IU早：45IU早：35IU

遞減法晚：50IU早：30IU

晚：45IU晚：35IU晚：30IU

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附錄C

（資料性）

胚胎發(fā)育階段分類

C.1胚胎發(fā)育階段分類

胚胎發(fā)育階段分類見(jiàn)表C.1。

表C.1胚胎發(fā)育階段分類表

胚胎發(fā)育階段形態(tài)特征

含有16個(gè)細(xì)胞以上，卵裂球緊界限清晰，沒(méi)有形成致密細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)透明帶

早期桑椹胚/EB

內(nèi)的50%~60%空間。

卵裂球進(jìn)一步分裂變小，緊縮為團(tuán)塊狀，看不清卵裂球界限，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)透明帶內(nèi)的

致密桑椹胚/CM

60%~70%空間。

早期囊胚/EM細(xì)胞團(tuán)中出現(xiàn)散在的囊腔，細(xì)胞團(tuán)占據(jù)透明帶內(nèi)的70%~80%空間。

已經(jīng)分化的滋養(yǎng)層和內(nèi)部致密的、顏色發(fā)暗的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和囊胚腔明顯是主要特征。滋

囊胚/BL

養(yǎng)層與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)比較容易區(qū)別。此時(shí)的胚胎細(xì)胞充滿整個(gè)透明帶內(nèi)。

整個(gè)胚胎直徑增大，囊胚腔充分?jǐn)U張，與透明帶之間無(wú)間隙，透明帶變薄，大約是原

擴(kuò)張囊胚/EXB

來(lái)厚度的1/3。

孵化囊胚/HB正處于孵化階段的胚胎透明帶破裂或胚胎細(xì)胞團(tuán)正在脫出或者已脫離透明帶。

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附錄D

（資料性）

胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)

D.1胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)

胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)見(jiàn)表D.1。

表D.1胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)

等級(jí)特征

胚胎發(fā)育階段與胚齡一致，透明帶光滑無(wú)缺陷，胚胎細(xì)胞團(tuán)形態(tài)完整，輪廓清晰，卵

A級(jí)裂球大小均勻，結(jié)構(gòu)緊湊、色澤和透明度適中，無(wú)游離細(xì)胞或很少，變性細(xì)胞比例少

于10%。

胚胎發(fā)育階段與胚齡基本一致，輪廓清晰，胚胎細(xì)胞團(tuán)形態(tài)較完整，卵裂球大小基本

B級(jí)

一致，色澤和細(xì)胞透明度良好，變性及游離細(xì)胞約占10%~30%。

胚胎發(fā)育階段與胚齡不太一致，且胚胎細(xì)胞團(tuán)輪廓不清，色澤和透明度變暗，卵裂球

C級(jí)

較松散，游離，變性及游離細(xì)胞約占30%~50%。

D級(jí)未受精卵，或發(fā)育停滯變性、卵裂球不規(guī)則、少而散。

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附錄E

（資料性）

冷凍胚胎生產(chǎn)記錄

E.1冷凍胚胎生產(chǎn)記錄表

冷凍胚胎生產(chǎn)記錄見(jiàn)表E.1。

表E.1冷凍胚胎生產(chǎn)記錄表

品種制作地點(diǎn)日期

供體號(hào)母畜：公畜：

超排情況黃體數(shù)——左側(cè)：右側(cè)：卵泡數(shù)——左側(cè)：右側(cè)：其他：

可用胚胎數(shù)不可用胚胎數(shù)

未受精

2-8退

總數(shù)等級(jí)EMMCMEBBLEXB總數(shù)

細(xì)胞化

鮮胚數(shù)及A

質(zhì)量評(píng)定

B

C

D

合計(jì)

細(xì)管號(hào)數(shù)量階段級(jí)別小筒號(hào)提漏號(hào)儲(chǔ)存罐號(hào)備注

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草

規(guī)則》的規(guī)定起草。

請(qǐng)注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)提出并歸口。

本文件起草單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)、哈爾濱博蒙生物科技有限公司、黑龍江普惠特

產(chǎn)有限公司、哈爾濱工業(yè)大學(xué)、新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、根

河森林工業(yè)有限公司。

本文件主要起草人：韓歡勝、趙列平、趙曉靜、許艷麗、道楞、郭喜明、王雪、王敏、

孫義樂(lè)、許紅喜、鄭家三、張愛(ài)忠、史文清、柴孟龍、徐馨、王金濤、張金友、王偉、庫(kù)爾

班·吐拉克、韓彥、張震、吳曉宇、孫麗英、蓋廣輝、黃海燕、趙育國(guó)、杜佩澤、尚念鵬。

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梅花鹿胚胎凍存技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了梅花鹿胚胎凍存生產(chǎn)基本要求、超數(shù)排卵、采胚、檢胚及凍前處理、胚胎

冷凍與貯存。

本文件適用于梅花鹿胚胎的冷凍保存。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T25881牛胚胎

NY/T1900畜禽細(xì)胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范

NY/T1674牛羊胚胎質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4基本要求

4.1人員

4.1.1由鹿保定人員、操作助手、采胚人員、胚胎檢測(cè)人員組成。

4.1.2應(yīng)具有一定的專業(yè)理論基礎(chǔ)或現(xiàn)場(chǎng)工作經(jīng)驗(yàn)，無(wú)人獸共患傳染病。

4.1.3操作中應(yīng)嚴(yán)格消毒，戴手套，穿工作服。

4.1.4應(yīng)事先分工，操作過(guò)程中須