2026年生物技術競賽分子生物學基礎實驗操作技術評估一、選擇題（每題2分，共20題，共40分）說明：以下題目涵蓋分子生物學基礎實驗操作的核心技術，結合行業(yè)實際應用場景進行設計。1.在PCR實驗中，DNA聚合酶選擇最關鍵的因素是什么？A.高溫穩(wěn)定性B.抗抑制劑能力C.高效延伸能力D.以上都是2.凝膠電泳分離DNA片段時，通常使用哪種緩沖液？A.TAE緩沖液B.TBE緩沖液C.Tris-EDTA緩沖液D.以上均可3.限制性內切酶識別的序列通常具有什么特點？A.palindromic（回文序列）B.非回文序列C.任意序列D.僅存在于真核生物中4.PCR產物進行測序時，常用的測序方法是什么？A.Sanger測序法B.Illumina測序法C.PyrosequencingD.均可5.RNA提取時，為何需要使用異硫氰酸胍（Guanidineisothiocyanate）？A.沉淀RNAB.抑制RNA酶活性C.破壞細胞結構，釋放RNAD.增強RNA溶解度6.基因克隆中，載體質粒通常需要具備哪些元件？A.復制起始位點（ori）B.選擇性標記基因C.多克隆位點（MCS）D.以上都是7.WesternBlotting實驗中，一抗和二抗的作用是什么？A.一抗識別目標蛋白，二抗增強信號B.一抗固定蛋白，二抗顯色C.一抗封閉非特異性位點，二抗檢測目標D.一抗和二抗均無特異性8.瓊脂糖凝膠電泳中，瓊脂糖濃度越高，分離效果如何？A.分離范圍更廣B.分離片段更小C.分離片段更大D.無明顯影響9.逆轉錄PCR（RT-PCR）適用于檢測什么？A.DNA模板B.RNA模板C.蛋白質模板D.以上均可10.基因編輯技術中，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的核心組件是什么？A.Cas9蛋白B.gRNA（向導RNA）C.基因靶點D.以上都是二、填空題（每空1分，共10空，共10分）說明：以下題目考察分子生物學實驗操作的術語和原理。1.PCR實驗中，引物退火溫度通常根據(jù)______和______計算確定。2.質粒載體通常使用______抗生素進行篩選。3.RNA提取時，使用______試劑可抑制RNA酶活性。4.WesternBlotting中，蛋白質轉移至______膜后進行雜交。5.基因測序中，Sanger法利用______終止子實現(xiàn)分段終止合成。6.限制性內切酶識別的序列通常具有______特性。7.RT-PCR實驗中，逆轉錄酶的作用是將______轉化為cDNA。8.瓊脂糖凝膠電泳中，DNA片段遷移速度與______成正比。9.基因克隆中，連接酶的作用是催化______之間的磷酸二酯鍵形成。10.CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，gRNA通過______識別基因靶點。三、簡答題（每題5分，共4題，共20分）說明：以下題目要求簡述實驗原理或操作步驟。1.簡述PCR實驗的原理及其關鍵步驟。2.解釋凝膠電泳分離DNA片段的原理及影響因素。3.說明RNA提取過程中為何需要使用酸性試劑（如醋酸鋰）。4.簡述WesternBlotting實驗的步驟及各步驟目的。四、操作題（每題10分，共2題，共20分）說明：以下題目結合實際實驗場景，考察操作細節(jié)和問題分析能力。1.某實驗室進行基因克隆實驗，質粒載體已用EcoRI酶切，待克隆的插入片段也用相同酶處理。簡述連接反應的操作步驟及注意事項。2.在進行RT-PCR實驗時，發(fā)現(xiàn)擴增產物條帶模糊或消失。分析可能的原因并提出解決方案。五、論述題（每題15分，共2題，共30分）說明：以下題目要求深入分析實驗原理或應用場景。1.結合中國生物醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，論述PCR技術在疾病診斷中的實際應用及優(yōu)勢。2.比較CRISPR-Cas9與傳統(tǒng)基因編輯技術的優(yōu)劣，并探討其在農業(yè)領域的潛在應用前景。答案與解析一、選擇題答案1.D2.B3.A4.A5.C6.D7.A8.C9.B10.D解析：1.PCR酶需具備高溫穩(wěn)定性、抗抑制劑能力及高效延伸能力，綜合選擇D。2.TBE緩沖液pH范圍更廣，適合復雜樣品電泳，選B。3.限制性內切酶識別回文序列，如EcoRI（GAATTC），選A。4.Sanger法仍為測序金標準，選A。5.異硫氰酸胍破壞細胞結構并變性RNA酶，選C。二、填空題答案1.引物長度，退火溫度2.抗氨芐青霉素（Ampicillin）3.異硫氰酸胍（Guanidineisothiocyanate）4.PVDF或尼龍膜5.dideoxynucleotide（ddNTPs）6.回文序列7.mRNA8.分子大小9.DNA片段末端10.PAM序列鄰近區(qū)域三、簡答題答案1.PCR原理：利用DNA聚合酶在引物作用下特異性擴增目標DNA片段。關鍵步驟：變性（高溫解鏈）、退火（引物結合）、延伸（聚合酶合成）。2.凝膠電泳原理：DNA帶負電，在電場中向正極遷移，片段越小遷移越快。影響因素：凝膠濃度、電壓、DNA長度。3.RNA提取用酸性試劑：醋酸鋰可沉淀RNA，同時抑制RNA酶活性，避免降解。4.WesternBlot步驟：蛋白質電泳分離→轉移至膜→封閉→一抗孵育→二抗孵育→化學發(fā)光顯色。目的：特異性檢測目標蛋白。四、操作題答案1.連接反應步驟：-質粒和插入片段用EcoRI酶切后，用瓊脂糖凝膠電泳驗證酶切效果；-純化酶切產物，測定濃度；-按比例混合載體和插入片段（如3:1摩爾比），加入T4DNA連接酶，37℃連接30min；注意事項：避免過高濃度鹽分、防止RNA酶污染、連接酶需冰凍保存。2.RT-PCR問題分析：-條帶模糊：模板濃度過高/過低、引物二聚體形成；-條帶消失：RNA降解、逆轉錄酶活性不足；解決方案：優(yōu)化引物濃度、增加RNA提取量、更換逆轉錄酶。五、論述題答案1.PCR在疾病診斷中的應用：-快速檢測病原體（如COVID-19核酸檢測）；-腫瘤標志物檢測（如Ki-67基因擴增）；-中國市場優(yōu)勢：基層醫(yī)療PCR設備普及，政