細(xì)菌內(nèi)毒素檢測操作規(guī)程與注意事項一、引言細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外層的一種結(jié)構(gòu)成分，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖。當(dāng)細(xì)菌死亡或崩解時，內(nèi)毒素可釋放出來，進入人體或動物體內(nèi)會引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等一系列病理生理反應(yīng)。因此，對藥品、醫(yī)療器械、生物制品及某些食品等進行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，是確保其安全性的重要質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。本規(guī)程旨在規(guī)范細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的操作流程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和重復(fù)性。二、檢測原理目前，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測最常用的方法是鱟試驗法，其原理基于鱟血變形細(xì)胞裂解物（LAL）與內(nèi)毒素接觸時會發(fā)生一系列酶促反應(yīng)，最終形成凝膠或產(chǎn)生濁度/色度變化。根據(jù)反應(yīng)終點的不同，鱟試驗法主要分為凝膠法、濁度法（包括動態(tài)濁度法和終點濁度法）和顯色基質(zhì)法（包括動態(tài)顯色法和終點顯色法）。本規(guī)程將重點闡述凝膠法和光度測定法（濁度法與顯色基質(zhì)法）的通用操作要點。三、主要試劑與材料1.鱟試劑（LALReagent）：根據(jù)檢測方法選擇相應(yīng)類型的鱟試劑（凝膠法鱟試劑、動態(tài)濁度法鱟試劑、終點濁度法鱟試劑、動態(tài)顯色法鱟試劑、終點顯色法鱟試劑），應(yīng)注明其靈敏度（λ）。2.細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）：用于鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及陽性對照。3.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BETWater）：應(yīng)符合內(nèi)毒素檢查用水的要求，即內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.015EU/ml（用于凝膠法時）或更低（根據(jù)所用鱟試劑靈敏度確定）。4.供試品（TestSample）：待檢測的藥品、醫(yī)療器械浸提液或其他樣品。5.稀釋液/中和劑（如需要）：用于供試品的稀釋或?qū)赡艽嬖诘母蓴_物質(zhì)進行中和。6.無菌無熱原試管、移液吸頭、容量瓶等：所有與試劑和供試品接觸的器皿均需經(jīng)無熱原處理。四、儀器設(shè)備1.恒溫培養(yǎng)器：用于凝膠法的孵育，應(yīng)能精確控制溫度（如37℃±1℃），且具有良好的溫度均勻性。2.微量移液器：不同量程，確保精度符合要求，定期校準(zhǔn)。3.內(nèi)毒素測定儀：用于光度測定法（濁度法和顯色基質(zhì)法），應(yīng)能精確控制溫度、檢測光密度或吸光度變化，并具備數(shù)據(jù)記錄和分析功能。4.天平：用于稱量。5.旋渦混合器：用于溶液的混勻。6.玻璃器皿干燥滅菌箱或其他無熱原處理設(shè)備：如干熱滅菌器。7.生物安全柜：在處理可能具有生物危害的樣品或進行無菌操作時使用。五、操作規(guī)程（一）實驗前準(zhǔn)備1.試劑平衡：將鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、檢查用水及供試品（如為冷藏保存）從冰箱取出，放置至室溫（一般為15-25℃）。注意，不同鱟試劑對平衡時間要求可能不同，應(yīng)參照產(chǎn)品說明書。2.器皿準(zhǔn)備：確認(rèn)所有使用的試管、吸頭、容量瓶等均為無菌無熱原。玻璃器皿通常經(jīng)180℃干烤2小時以上或250℃干烤30分鐘以上進行除熱原處理。一次性使用的塑料器皿應(yīng)選擇明確標(biāo)注無熱原的產(chǎn)品。3.供試品處理：*了解供試品特性：查閱供試品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或相關(guān)資料，了解其理化性質(zhì)（如pH值、滲透壓、是否含防腐劑、抗生素等），評估可能存在的干擾因素。*稀釋：根據(jù)供試品預(yù)計內(nèi)毒素含量和鱟試劑靈敏度，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水或指定的稀釋液將供試品稀釋至適當(dāng)濃度。稀釋倍數(shù)應(yīng)通過預(yù)試驗或干擾試驗確定，確保供試品在該濃度下無干擾作用。*調(diào)節(jié)pH值（必要時）：鱟試劑反應(yīng)的最適pH值通常在6.0-8.0之間。若供試品pH值超出此范圍，應(yīng)使用無熱原的酸或堿溶液（如鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液）或緩沖液調(diào)節(jié)pH至適宜范圍。*滅活（必要時）：對于可能含有抗菌成分的供試品，可采用適當(dāng)方法（如稀釋法、中和法、熱處理等）進行滅活處理，但需確保該處理不破壞內(nèi)毒素且不引入新的干擾。4.鱟試劑靈敏度復(fù)核（定期或更換批次時）：按照鱟試劑說明書或藥典要求，使用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品對鱟試劑的標(biāo)示靈敏度進行復(fù)核，確保其符合規(guī)定。5.干擾試驗（首次檢測某供試品或供試品工藝/配方改變時）：通過干擾試驗確定供試品在何種稀釋倍數(shù)下對內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)無干擾，該稀釋倍數(shù)即為最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）。供試品的稀釋不得超過MVD。（二）供試品內(nèi)毒素檢測A.凝膠法1.加樣：*取鱟試劑安瓿或反應(yīng)管，按說明書加入規(guī)定體積的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解鱟試劑（若為凍干品），輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。*設(shè)立以下各管，每個濃度至少做2支平行管：*陰性對照管（NC）：鱟試劑溶液+檢查用水。*陽性對照管（PC）：鱟試劑溶液+2λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。*供試品陽性對照管（PPC）：鱟試劑溶液+供試品溶液（按確定的稀釋倍數(shù)）+2λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。*供試品管（TS）：鱟試劑溶液+供試品溶液（按確定的稀釋倍數(shù)）。*加樣體積應(yīng)按照鱟試劑說明書要求（通常為0.1ml或0.2ml體系）。加樣時應(yīng)避免氣泡產(chǎn)生，加樣后輕輕混勻。2.孵育：立即將加樣后的試管（若為凝膠法專用試管，注意保持垂直）放入已預(yù)熱至規(guī)定溫度（通常為37℃±1℃）的恒溫培養(yǎng)器中孵育。凝膠法的孵育時間通常為60分鐘±2分鐘（或按鱟試劑說明書規(guī)定）。孵育期間應(yīng)避免震動試管。3.結(jié)果觀察：孵育結(jié)束后，小心取出試管，避免劇烈震動。凝膠法結(jié)果判斷：將試管輕輕傾斜（約180°），觀察內(nèi)容物是否形成堅實的凝膠。凝膠不變形、不從管壁滑落者為陽性（+）；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、傾斜時變形并從管壁滑落者為陰性（-）。光度法結(jié)果則由儀器根據(jù)預(yù)設(shè)參數(shù)自動判讀。B.光度測定法（濁度法/顯色基質(zhì)法）1.試劑準(zhǔn)備：根據(jù)所用鱟試劑說明書，精確復(fù)溶鱟試劑（及顯色基質(zhì)，如為顯色法）。2.加樣：在儀器配套的反應(yīng)杯中，按規(guī)定順序和體積加入復(fù)溶的鱟試劑、供試品溶液（或系列稀釋的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、陰性對照、陽性對照、供試品陽性對照等）。對于動態(tài)法，通常將鱟試劑與樣品混合后立即放入儀器；對于終點法，可能需要先進行一定時間的預(yù)孵育。具體操作嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書進行。3.儀器設(shè)置：開啟內(nèi)毒素測定儀，設(shè)置孵育溫度（通常為37℃±1℃）、檢測波長（濁度法通常在____nm，顯色法根據(jù)顯色底物選擇，如405nm或____nm）、檢測時間間隔、反應(yīng)總時間等參數(shù)。4.測定：將加樣完畢的反應(yīng)杯放入內(nèi)毒素測定儀中，啟動測定程序，儀器將自動進行孵育并實時監(jiān)測反應(yīng)體系的濁度變化（濁度法）或顏色變化（顯色法）。5.結(jié)果計算：儀器根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（由內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度的反應(yīng)時間或反應(yīng)速率/終點吸光度值繪制）自動計算出供試品的內(nèi)毒素濃度。（三）結(jié)果判定與報告1.陰性對照（NC）：凝膠法應(yīng)為陰性（-）；光度法結(jié)果應(yīng)小于最低檢測限或符合規(guī)定。2.陽性對照（PC）：凝膠法應(yīng)為陽性（+）；光度法結(jié)果應(yīng)在其標(biāo)示濃度的可接受范圍內(nèi)。3.供試品陽性對照（PPC）：凝膠法應(yīng)為陽性（+）；光度法結(jié)果應(yīng)顯示加入的內(nèi)毒素活性得到有效檢測，表明供試品在該濃度下無干擾。若PPC結(jié)果不符合要求，則供試品存在干擾，需重新處理供試品或調(diào)整稀釋倍數(shù)后重試。4.供試品管（TS）：*凝膠法：若供試品管為陰性（-），判供試品內(nèi)毒素含量符合規(guī)定；若為陽性（+），判供試品內(nèi)毒素含量不符合規(guī)定。*光度法：若供試品的內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值（L），則判符合規(guī)定；若大于或等于L，則判不符合規(guī)定。限值L通常根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)或公式L=K/M計算（K為每千克體重每小時最大可接受內(nèi)毒素劑量，M為供試品每千克體重每小時的最大使用劑量）。5.報告：根據(jù)結(jié)果判定，出具明確的檢測報告，包括供試品名稱、批號、檢測日期、所用方法、鱟試劑批號及靈敏度、結(jié)果（符合規(guī)定/不符合規(guī)定，或具體內(nèi)毒素濃度值）、檢測人、復(fù)核人等信息。六、注意事項1.環(huán)境控制：實驗應(yīng)在潔凈、無明顯污染源的環(huán)境中進行。最好在Class100級的潔凈工作臺或生物安全柜內(nèi)操作，以防止外源性內(nèi)毒素污染。操作人員應(yīng)穿戴無菌無熱原的手套、口罩、實驗服。2.“無熱原”概念：整個實驗過程均需嚴(yán)格遵守“無熱原操作”原則。避免手直接接觸潔凈器皿的內(nèi)壁和管口。移液器吸頭應(yīng)無菌無熱原，且為一次性使用。3.試劑質(zhì)量與儲存：鱟試劑對熱敏感，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書規(guī)定的條件（通常為2-8℃）避光儲存。使用前檢查試劑批號、有效期及外觀，如有異常不得使用。復(fù)溶后的鱟試劑應(yīng)盡快使用，避免長時間放置。4.加樣準(zhǔn)確性：微量移液器的準(zhǔn)確使用是保證實驗結(jié)果精確性的關(guān)鍵。應(yīng)選擇合適量程的移液器，吸液和放液操作規(guī)范，避免產(chǎn)生氣泡。定期對移液器進行校準(zhǔn)。5.混勻操作：內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液與鱟試劑混合時，應(yīng)確?；靹虺浞?，但避免劇烈旋渦導(dǎo)致氣泡產(chǎn)生，尤其是凝膠法。6.溫度控制：無論是凝膠法的恒溫培養(yǎng)器還是光度法儀器的孵育模塊，其溫度的準(zhǔn)確性和均勻性至關(guān)重要，應(yīng)定期進行驗證。7.干擾試驗的重要性：供試品本身可能存在抑制或增強鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的物質(zhì)，因此干擾試驗是確保檢測結(jié)果可靠的前提。對于新的供試品、供試品生產(chǎn)工藝變更或配方變更后，均需進行干擾試驗。8.供試品處理：供試品的稀釋、pH調(diào)節(jié)、滅活等處理步驟應(yīng)科學(xué)合理，確保不破壞內(nèi)毒素活性，也不引入新的干擾。9.結(jié)果判斷的客觀性：凝膠法結(jié)果判斷具有一定主觀性，建議由兩人以上同時觀察或采用雙盲法觀察。對于臨界結(jié)果，應(yīng)進行復(fù)試。10.實驗記錄：詳細(xì)記錄所有實驗數(shù)據(jù)，包括試劑信息、儀器參數(shù)、操作步驟、觀察結(jié)果、計算過程等，確保實驗的可追溯性。11.廢棄物處理：實驗結(jié)束后，所有污染的廢棄物（如用過的吸頭、試管、反應(yīng)杯等）應(yīng)按照生物安全規(guī)定進行無害化處理。12.質(zhì)量控制：定期進行鱟試劑靈敏度復(fù)核、儀器性能驗證、陽性對照和陰性對照的設(shè)置，確保整個檢測系統(tǒng)處于受控狀態(tài)。七、數(shù)據(jù)記錄與保存所有實驗原始數(shù)據(jù)、計算過程、結(jié)果報告、儀器打印圖譜等均應(yīng)妥善保