1、Diagnosis of Genetic Disease,第17章 遺傳病的診斷,教學(xué)要求,1遺傳病的臨床診斷：病史采集；癥狀和體征；系譜分析。 2細(xì)胞遺傳學(xué)檢查：染色體檢查，F(xiàn)ISH技術(shù)；性染色質(zhì)檢查。 3生化檢查：代謝產(chǎn)物分析、酶和蛋白質(zhì)分析。 4基因診斷：基因診斷的定義和特點(diǎn)；基因診斷的方法：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、Southern印跡雜交、聚合酶鏈反應(yīng)分析（已知點(diǎn)突變的檢測(cè)、未知點(diǎn)突變的檢測(cè)、基因缺失的檢測(cè)、RCR-RFLP）、DNA測(cè)序、DNA芯片、熒光原位雜交等的原理、操作和應(yīng)用。,產(chǎn)前診斷 (prenatal diagnosis) 植入前診斷 (preimplantation

2、diagnosis) 癥狀前診斷 (presymptomatic diagnosis) 現(xiàn)癥病人診斷 (symptomatic diagnosis),臨床診斷,實(shí)驗(yàn)診斷,病史采集,癥狀和體征,遺傳病系譜分析,細(xì)胞遺傳學(xué)檢查,生化檢查,基因診斷,第一節(jié) 遺傳病的臨床診斷,病史采集,一、病史采集,家族史：有無(wú)同種病史； 婚姻史：婚齡、婚次、配偶健康情況及是否近親結(jié)婚； 生育史：生育年齡、生育子女?dāng)?shù)目及健康狀況，有無(wú)流產(chǎn)、死產(chǎn)和早產(chǎn)史 。,除應(yīng)了解一般病史外，還應(yīng)著重采集與遺傳病家族聚集現(xiàn)象有關(guān)的以下項(xiàng)目：,二、癥狀和體征,遺傳病有和其它疾病相同的癥狀和體征，往往又有其本身特異性癥侯群，為診斷提供初

3、步線(xiàn)索。,如：,智力發(fā)育不全伴有特殊腐臭尿液,苯丙酮尿癥,智力發(fā)育不全伴有白內(nèi)障，肝硬化,半乳糖血癥,智力低下伴有眼距寬、眼裂小、外眼角上斜,先天愚型,二、癥狀和體征,白化病,并 指,多 指,軟骨發(fā)育不全,二、癥狀和體征,除了解現(xiàn)在的癥狀和體征外，還應(yīng)注意了解身體發(fā)育快慢、智力增進(jìn)情況、性器官及第二性征發(fā)育狀態(tài)等。皮膚紋理特征的檢查也可作為遺傳病的輔助診斷指標(biāo)。,三、系譜分析,記錄遺傳病家族史最好的方法是繪制系譜。,系統(tǒng)性、完整性和可靠性 不規(guī)則顯性、延遲顯性、從性顯性等特殊現(xiàn)象 新的基因突變 顯性與隱性概念的相對(duì)性,注意問(wèn)題,同一遺傳病采用的觀(guān)察指標(biāo)不同而得出不同的遺傳方式，如鐮狀細(xì)胞貧血和

4、鐮狀細(xì)胞癥狀。,四、遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)資源應(yīng)用,OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man ),四、遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)資源應(yīng)用,OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man ),第二節(jié) 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查,染色體檢查,取材：視檢查對(duì)象和目的而有所不同，通常主要取自外周血、皮膚、骨髓、胸、腹水、絨毛、羊水中胎兒脫落細(xì)胞和臍血等各種組織。 體外細(xì)胞培養(yǎng) 制片：秋水仙素處理，收獲細(xì)胞、低滲、固定、滴片等過(guò)程，制備染色體標(biāo)本。 顯帶 核型分析,一、染色體檢查, 不明原因的智力發(fā)育不全、生長(zhǎng)遲緩者； 先天性畸形（包括兩性?xún)?nèi)外生殖畸形）； 性征發(fā)育異常

5、及生育異常： 原發(fā)性閉經(jīng)和女性不孕癥； 無(wú)精子癥和男性不育癥； 有反復(fù)多次早期流產(chǎn)史的婦女及其丈夫； 家族史：家族中有染色體異?；蛳忍旎蔚膫€(gè)體。 有較長(zhǎng)時(shí)間、較大劑量射線(xiàn)或致畸致突變物質(zhì)接觸者； 惡性腫瘤，尤其是惡性血液病患者。,染色體檢查（核型分析）指征,二、性染色質(zhì)檢查,X染色質(zhì)和Y染色質(zhì) 適應(yīng)癥：兩性畸形或性染色體數(shù)目異常疾病的診斷，但仍需染色體檢查確認(rèn)。,第三節(jié) 生物化學(xué)檢查,1、代謝產(chǎn)物分析 2、酶和蛋白質(zhì)分析 材料主要來(lái)源于血液和特定的組織、細(xì)胞，如肝細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、腎、腸粘膜細(xì)胞等。 產(chǎn)前診斷中常采集絨毛、羊水、臍帶血和皮膚。 新生兒的篩查最常用的標(biāo)本是血和尿。,例：,2

6、0,1978年，美國(guó)科學(xué)院院士美籍華裔科學(xué)家YW Kan(簡(jiǎn)悅威 )和Dozy應(yīng)用液相DNA分子雜交成功地進(jìn)行了鐮狀細(xì)胞貧血癥的基因診斷，標(biāo)志著檢驗(yàn)診斷進(jìn)入基因診斷時(shí)代。,第四節(jié) 基因診斷(gene diagnosis),第四節(jié) 基因診斷(gene diagnosis),基因診斷：利用分子生物學(xué)技術(shù)，從DNA/RNA水平檢測(cè)分析致病基因的存在、變異和表達(dá)狀態(tài)從而對(duì)疾病作出診斷的技術(shù)。,一、基因診斷定義和特點(diǎn),A、特異性強(qiáng),B、靈敏度高,特點(diǎn),C、應(yīng)用范圍廣,D、早期診斷,基因診斷概述,人類(lèi)基因組計(jì)劃 基因結(jié)構(gòu) 后基因組計(jì)劃 基因功能,基因診斷的兩個(gè)支點(diǎn)：,基因診斷的一般流程,前提條件：先證者要

7、有明確的臨床診斷,醫(yī)學(xué)遺傳咨詢(xún)門(mén)診,相關(guān)臨床科室 醫(yī)生診斷,簽署基因診斷知情同意書(shū),抽取外周血2-3ml,基因檢測(cè),咨詢(xún)臨床醫(yī)生,對(duì)基因檢測(cè)結(jié)果的理解,找到功能性突變：支持臨床診斷 未找到功能性突變：不否定臨床診斷,遺傳病基因診斷的分類(lèi),臨癥診斷家系先證者或患者 癥狀前診斷家系高危個(gè)體 產(chǎn)前診斷家系高危胎兒,二、基因診斷基本方法,1Southern印跡雜交,2聚合酶鏈反應(yīng)分析,3DNA 測(cè)序,5熒光原位雜交,4. DNA 芯片,分子印跡雜交(Southern blotting)的基本方法：DNA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段DNA轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜標(biāo)記探針雜交顯影確定探針

8、互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。,1Southern印跡雜交,2聚合酶鏈反應(yīng)分析,PCR原理示意圖,變性退火延伸,聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）：體外酶促擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。,（1）產(chǎn)物探針檢測(cè) ASO探針,等位特異性的寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide，ASO)探針: 當(dāng)某一致病基因的突變位點(diǎn)的性質(zhì)以及突變位點(diǎn)兩側(cè)的堿基序列都明確的情形下，可以合成ASO探針。,AS

9、O探針檢測(cè)鐮狀細(xì)胞突變基因的示意圖,/ /S S/S,已知點(diǎn)突變,（2）產(chǎn)物構(gòu)象變化檢測(cè)-SSCP,DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphisms,SSCP)：相同長(zhǎng)度的單鏈DNA可因堿基序列不同產(chǎn)生構(gòu)象差異，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)為遷移率差別。 提取DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性電泳 根據(jù)單鏈條帶位置的改變判斷該個(gè)體是否存在突變。 并不是所有的堿基突變都會(huì)導(dǎo)致SSCP，因此該方法不能鑒別所有突變。,SSCP電泳檢測(cè)示意圖,未知點(diǎn)突變,基因缺失時(shí)可導(dǎo)致靶DNA模板的缺失，使用特異性引物擴(kuò)增時(shí)得不到相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此可以直接檢測(cè)缺失。

10、,（3）PCR產(chǎn)物有無(wú)檢測(cè),正?；?異?；?目的基因,引物,PCR,產(chǎn)物 （電泳）,基因缺失或點(diǎn)突變,RFLP連鎖分析法 （restriction fragment length polymorphism，RFLP） 由于堿基變異可能導(dǎo)致限制酶切點(diǎn)消失或新的酶切位點(diǎn)出現(xiàn)，引起不同個(gè)體DNA在用同一限制酶切割時(shí)，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段，稱(chēng) RFLP。,（4）產(chǎn)物酶切檢測(cè)-RFLP,基因缺失或點(diǎn)突變,RFLP的主要步驟: DNA酶切Southern印記雜交分析 DNAPCR 酶切電泳分析,RFLP主要有以下兩種類(lèi)型： 點(diǎn)多態(tài)性 序列多態(tài)性,正常人（HbA）和鐮狀細(xì)胞貧血患者 （HbS）珠蛋白

11、基因的結(jié)構(gòu)差異,正常人（HbA）和鐮狀細(xì)胞細(xì)胞 貧血患者（HbS）珠蛋白基因 Dde限制酶切點(diǎn)示意圖,珠蛋白基因Dde限制酶切片段電泳結(jié)果,例1:鐮狀細(xì)胞貧血,人類(lèi)珠蛋白基因簇,例2,a地中海貧血缺失基因檢測(cè),PCR-RFLP檢測(cè)基因缺失和插入的示意圖,案例9-2基因診斷分析(P99),地貧的基因缺失的RFLP基因診斷,2,正常對(duì)照,aa/aa,1,1,aa/a-,aa/-,a-/-,人類(lèi)珠蛋白基因簇,例2,a地中海貧血缺失基因檢測(cè),3DNA 測(cè)序,DNA測(cè)序即測(cè)定DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)中堿基的順序。 包含特定位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物再作DNA測(cè)序，比較正?；蚺c突變的序列，可檢測(cè)出突變的堿基類(lèi)型和位點(diǎn)。,

12、DNA自動(dòng)測(cè)序儀生成的序列,DNA自動(dòng)測(cè)序儀采用4種不同顏色的熒光分別標(biāo)記4種雙脫氧核苷酸，基本實(shí)現(xiàn)了測(cè)序自動(dòng)化。,概念：基因芯片技術(shù)是DNA雜交探針與半導(dǎo)體工業(yè)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。將各種探針固定于支持物上后與帶有熒光標(biāo)記的DNA樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)，進(jìn)而獲取被測(cè)樣品中DNA分子的數(shù)量和序列信息。該技術(shù)可用于大規(guī)模篩查由基因突變引起的疾病。,4. DNA 芯片,檢測(cè)原理和步驟： （1）制作芯片：根據(jù)疾病基因中的突變位點(diǎn)區(qū)域的核苷酸序列，合成20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的探針，將其固定于芯片上，芯片上可固定成千上萬(wàn)個(gè)探針。 （2）從被測(cè)對(duì)象的細(xì)胞中提取DNA，用酶切成較小的片段，對(duì)D

13、NA作熒光標(biāo)記，并熔解成單鏈。 （3）將樣品滴加到芯片上并與芯片上的探針雜交，凡是與探針互補(bǔ)的酶切片段會(huì)固定于特定位置上，不能互補(bǔ)的片段會(huì)被洗脫掉。 （4）對(duì)芯片上的熒光作掃描和分析。,Gene screening using a DNA microarray.,非放射性原位雜交方法 用特殊熒光素標(biāo)記DNA探針，在染色體、細(xì)胞和組織切片標(biāo)本上進(jìn)行DNA雜交，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的特定序列存在與否。,6熒光原位雜交（FISH）,案例19-1,羅xx ，女，34歲，曾生育過(guò)一個(gè)智力低下患兒，現(xiàn)再次妊娠，因懼怕再生同病患兒前來(lái)咨詢(xún)。其患兒，男，6歲，智力低下，IQ值42。染色體核型分析為46，XY，-14，+t(14q;21q)。檢查患兒父親的核型正常；而母親是平衡易位攜帶者，核型為45，XX,-14,-21,+t(14q;21q)。 臍血FISH分析結(jié)果如圖。,21q探針對(duì)臍血間期細(xì)胞FISH分析結(jié)果,遺傳疾病的基因診斷方法