1、分子生物學實驗報告一、實驗時間： 2011年11月21日 10:0017:30二、實驗內(nèi)容： 小鼠肝臟RNA的提取純化與鑒定三、實驗目的： 了解總RNA提取的基本原理、應用及操作的注意事項，熟悉掌握組織中總RNA提取方法及其檢測方法。四、實驗原理：在真核生物，由于絕大多數(shù)基因含有內(nèi)含子，因此不能直接由基因組克隆目的基因，提取RNA并逆轉錄形成cDNA或構建cDNA文庫是獲取真核生物表達基因的主要手段，此外，在利用Northern印跡雜交等技術分析基因表達水平時也需要提取RNA。本實驗要求自小鼠肝臟提取RNA，并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，通過紫外分光光度法進行定量。RNA是極易降解的核

2、酸分子，這主要是因為RNA酶分布廣、活性強、且難以失活，痕量的RNA酶就能夠造成嚴重的RNA降解。抑制RNA酶活性的方法很多，但均不能徹底避免RNA酶對RNA的降解。 焦磷酸二乙酯（DEPC）是一種強烈的烷化劑，它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制RNA酶的活性。DEPC是消除外源性RNA酶的主要方法。以0.1%DEPC處理實驗器皿與試劑配制用水，基本可以消除外源RNA酶的污染。但DEPC具有致癌性，在使用時一定要留意。DEPC處理的器皿與水必須經(jīng)高壓滅菌處理，使DEPC分解后方能使用。值得注意的是，DEPC具有很強的反應性，能夠與包括RNA在內(nèi)的多種生物分子以及多種化學試劑作用

3、，因此不能直接用于抑制樣品以及試劑中的RNA酶活性。 在RNA抽提試劑中加入異硫氰酸胍，是抑制樣品來源RNA酶活性的主要方法。作為一種蛋白變性劑，異硫氰酸胍可導致包括RNA酶在內(nèi)的所有酶活性的喪失，因此RNA純化過程中因盡可能去除異硫氰酸胍，以防止其對酶促反應的影響。在使用蛋白質(zhì)變性劑的同時，更重要的是去除樣品中的蛋白質(zhì)，防止內(nèi)源性RNA酶對樣品RNA的降解。逆轉錄反應時，反應體系中不能含有烷化劑或變性劑，此時痕量的RNA酶也可能對RNA產(chǎn)生破壞。在這種情況下，最適宜的方法是加入特異性的RNA酶抑制劑。這類RNA酶抑制劑本身是蛋白質(zhì)，可專一性作用于RNA酶，對RNA的逆轉錄以及體外翻譯等過程均

4、無干擾。 抽提RNA的關鍵在于去除DNA與蛋白質(zhì)，最常用的方法是酸性酚法。苯酚在酸性條件下可溶解DNA而不溶解RNA，同時酚又是蛋白變性劑。利用酸性酚試劑與氯仿的抽提，可一步完成細胞的裂解以及蛋白質(zhì)與RNA的分離。最后利用異丙醇沉淀，即可獲得純化的總RNA。 RNA產(chǎn)物的定量與純度檢測一般是通過紫外分光光度法。高純度的RNA其A260/A280應處于1.6至1.8之間，A260與RNA濃度呈正相關。RNA的完整性可通過電泳檢測。由于RNA為單鏈分子，二級結構復雜，必須首先利用甲醛胺變性RNA，再進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳。細胞總RNA包含了三種主要組分，其中rRNA含量最高，因此在電泳時可觀察

5、到18S和28S rRNA的條帶。如兩條條帶清晰，且亮度之比接近1:2，則表明RNA沒有發(fā)生降解。一般情況下泳道前緣還可觀察到一條較為模糊且亮度較弱的條帶，主要由5S、5.8S rRNA與tRNA 組成。如果RNA嚴重降解，則此條帶亮度會明顯增強，mRNA由于含量較少且長度不均一，一般觀察不到相應的條帶。 本實驗的要求是采用酸性酚法自小鼠肝組織抽提RNA，通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，即經(jīng)電泳因觀察到18S與28S rRNA的清晰條帶，最后通過紫外分光光度法對RNA進行定量與純度檢驗，計算RNA產(chǎn)物的濃度與含量。五、主要實驗試劑與儀器：1、Tissue Ruptor，購自QIA

6、GEN。2、塑料器皿，應用0.1%DEPC浸泡12h，121高壓滅菌15min，干燥即可使用。3、無RNA酶水：用去離子水配制0.1%的DEPC，購自SAGON，37保溫12h，121高壓滅菌15min。4、Trizol試劑：酸性酚試劑，購自Takara公司。5、氯仿6、異丙醇7、75%乙醇，購自國藥集團化學試劑有限公司。8、5甲醛變性電泳緩沖液：MOPS 0.1M（pH 7.0），乙酸鈉 40mM，EDTA 5mM（pH8.0）。9、RNA電泳用加樣緩沖液：50%甘油，1mM EDTA（pH8.0），0.25%溴酚藍。六、實驗方法與步驟：（一） RNA的抽提 1. 引頸處死小鼠，迅速取出肝組

7、織約50100mg于勻漿管，加入Trizol 試劑1ml，充分勻漿，室溫放置10分鐘。2. 12000rpm離心10min，取上清。3. 加入氯仿0.2ml,劇烈震蕩15s,4放置10min,12000rpm離心15min,取上清。氯仿的主要作用是將酚從溶液中萃取出來。離心后溶液分為三相，即上層的水相，下層的有機相以及中間的變性蛋白，小心吸取上層水相，絕不能有中層蛋白混入。4. 加入異丙醇0.5ml,震蕩混勻，4放置10min,12000rpm離心10min,棄上清。加入50%的異丙醇可以導致核酸沉淀，用量應于步驟3上清液的體積相當。5. 1ml 75% 乙醇洗滌沉淀，并8000rpm 離心5

8、min。（若管壁仍有殘留液體，繼續(xù)離心，吸取殘留液體） 乙醇洗滌的目的是去除沉淀中殘留的鹽分。6. 沉淀空氣干燥5min,溶解于70ul DEPC-H2O，留樣2l，其余-70保存?zhèn)溆谩＃ǘ┳贤夥止夤舛确y定純度和含量采用nanodrop儀器測定RNA的純度和含量，打開儀器，做好blank，處理試驗樣品，取1l樣品測定，讀取數(shù)值。(三)RNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測1. 制備瓊脂糖凝膠：將瓊脂糖 1g溶于1TBE 100ml，冷卻至60。 加入至1甲醛變性凝膠電泳緩沖液,加入10mlEB,混合均勻并灌制膠板。由于甲醛具有揮發(fā)性，不能直接加熱，必須對凝膠單獨加熱融化后加入。2. 取2lRN

9、A溶液，加入甲酰胺8l, 65變性5分鐘，迅速冰浴冷卻，點樣。加熱后迅速冷卻的目的是防止RNA復性。3. 150V電泳30分鐘，紫外光下觀察電泳結果。 七、 實驗結果：（1）紫外分光光度法檢測 濃度: 3883.5ng/l A260： 97.088 A280： 47.770 260/280：2.03 260/230：1.11（2）電泳檢測 我的結果 28s18s5s八、討論：（1）經(jīng)nanodrop儀器測定的260/280=2.03，大于2.0，說明已有部分RNA降解了。原因可能有家氯仿萃取離心取上清時吸到了中層的蛋白質(zhì)，取出組織后未立即抽提和保存，作過程中未使用口罩等工具，又需要進行揮發(fā)乙醇

10、等操作，空氣及口中的RNA分解酶會分解RNA導致測量值偏高。260/230=1.11，說明有雜質(zhì)，純度不高，可能有蛋白質(zhì)和胍鹽殘留，胍鹽殘留可能是乙醇洗滌不完全。（2）電泳結果拖帶現(xiàn)象嚴重，可能是RNA嚴重降解，被DNA等污染，也有由于電極緩沖液配置問題，跑膠時，溫度過高，導致效果較差的原因。九、實驗思考題：1、為何無RNA沉淀：勻漿不完全時，基因組DNA分子仍然很大，溶液粘稠。變性的蛋白質(zhì)和基因組DNA一起形成絮狀凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地釋放到溶液中。2、RNA抽提率低的原因：樣品均化或裂解不完全: 勻漿不完全時，RNA分子易被蛋白質(zhì)和基因組DNA復合物包裹，不能被有效釋放。終RNA不完全溶解:未溶解的RNA丟失。3、A260/A280 比率小于1.65或大于2.0表示何意：小于1.65：在分光光度計測量前用水而不是用TE 緩沖液稀釋RNA樣品。低離子強度和低pH溶液會增加280 nm處的光吸收值。 樣品勻漿化時所加