1、結核病實驗室診斷，主要內容，結核病分子藥物敏感性，4，1。結核病疫情，全球結核病疫情迅速惡化，人口大規(guī)模流動，結核病并發(fā)艾滋病感染日益嚴重，中國是僅次于印度的世界第二大結核病國家，結核病感染率為44.5%，每年新增活動性肺結核患者130萬人，死亡13萬人。在2011年世界衛(wèi)生組織結核病控制報告中，中國是世界上耐藥結核病高負擔的27個國家之一。2013年，世界衛(wèi)生組織宣布全球出現(xiàn)耐多藥結核病緊急情況，世界上的結核病患者在接受治療前已經(jīng)感染了他人！早期快速診斷和治療已成為制約結核病控制的關鍵：不超過50%的患者有細菌學診斷依據(jù)，這是當前結核病研究的重點，新的抗結核藥物(50%)，新的快速診斷技術(

2、40%)，新的結核病疫苗(10%)，7/45，結核病診斷方法的最新研究，JID 2012:205(補編2)由德國醫(yī)生科赫在1882年發(fā)現(xiàn)。結核分枝桿菌屬于菌核病、放線菌、分枝桿菌科和分枝桿菌。分枝桿菌復合體包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，人結核分枝桿菌是人類的主要致病菌。2020/6/24，GDTB，8，結核分枝桿菌，主要生物學特性有：1。細胞壁含有大量脂質；2.由它引起的疾病是慢性的，并伴有肉芽腫；3.抗酸染色陽性；生長特征是：生長緩慢；在人工培養(yǎng)基中繁殖第一代大約需要15 20小時；未感染的老鼠會被靜脈感染。實驗室檢查方法的歷史，19世紀80年代結核桿菌的發(fā)現(xiàn)，1900年代澤赫爾-尼森染色

3、法，1900年代曼圖試驗(TST用結核菌素)，1920年代彼得朗納尼培養(yǎng)基純化蛋白衍生物(PPD)，1930年代列文斯坦-詹森培養(yǎng)基，1940年代杜博斯瓊脂，1950年代小川奈那培養(yǎng)基，1950年代中溪7h9，1990年代納at，2000年代埃利斯波特，2010年代LPA，2020年代基因專家？結核病實驗室診斷，細菌學，涂片：低敏感性，傳統(tǒng)固體培養(yǎng)：長時間，23個月，分子生物學，結核-脫氧核糖核酸結核-核糖核酸，血清/免疫學，IGRA:有望取代TST，但無法區(qū)分活動性結核和潛伏感染，血清學：抗原純度和特異性差，液體培養(yǎng)和藥物敏感性試驗：細菌學診斷、羅氏培養(yǎng)/藥敏試驗、目前我國最常用的結核病實驗

4、室診斷技術、涂片干燥和固定、初染、脫色、復染、顯微鏡檢查、登記/報告、顯微鏡檢查等。光學顯微鏡、熒光顯微鏡、顯微鏡下形態(tài)染色、顯微鏡下熒光染色、發(fā)光二極管熒光顯微鏡、發(fā)光二極管熒光顯微鏡、超亮發(fā)光二極管價格低廉，價格接近現(xiàn)有光學顯微鏡，使用壽命長(約15-20，000小時)，省電，可用電池電源可靠性更好，無需空調設備，無需暗室，診斷性能優(yōu)于標準熒光顯微鏡，減少了操作人員的工作量。 普通熒光顯微鏡和發(fā)光二極管熒光顯微鏡的性能比較(不同實驗室的結果進行匯總和平均)、培養(yǎng)/藥物敏感性試驗、陰性培養(yǎng)、陽性培養(yǎng)、BACTEC MGIT 960/320指示系統(tǒng)，MGIT /3D公司生產(chǎn)的液體培養(yǎng)基比固體培

5、養(yǎng)快(平均10-12天，而不是20-24天)，比固體培養(yǎng)基更靈敏，可以自動解釋。 或者使用標準指示管和操作手冊進行解釋也加快了藥物敏感性試驗的速度。NaOH氫氧化鈉用于痰治療的局限性和常見菌群的離心污染是非常常見的。檢測非結核分枝桿菌(通常不致病)比固體培養(yǎng)更常見。在診斷前鑒定所有陽性培養(yǎng)物比固體培養(yǎng)基更昂貴。血清學診斷，其技術優(yōu)勢：是疾病早期診斷的理想方法。結果表明，血清學診斷的主要方法有：酶聯(lián)免疫吸附試驗、斑點免疫金滲濾試驗、免疫印跡法等。世衛(wèi)組織評估了來自不同國家的19種試劑盒產(chǎn)品。結果表明，與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒的靈敏度為1%60%，特異性為53 99。原因：由于檢測方法、試劑、抗原

6、和抗體不同，檢測結果差異較大，缺乏可比性。世衛(wèi)組織認為，現(xiàn)有血清學診斷試劑的敏感性和特異性需要進一步提高，不建議在臨床實踐中將其用作快速診斷方法。1世界衛(wèi)生組織。診斷評估系列第2:號，基于實驗室對19種市售結核病快速診斷試驗的評估。2008年，世界衛(wèi)生組織對結核病抗體的評估。2011年，世衛(wèi)組織正式宣布：由于目前市售的血清學試劑在結核病檢測中存在較大差異，且假陽性和假陰性的檢測結果非常高，不建議使用血清學方法作為結核分枝桿菌1號的診斷實驗。1世衛(wèi)組織結核病診斷商業(yè)血清診斷試驗http:/whqlibdoc . who . int/publications/2011/9789241502054

7、_ eng.pdf不能早期診斷！容易漏診和誤診！根據(jù)血清學試驗的評價，結核病感染者體內存在特異性效應T淋巴細胞，當效應T淋巴細胞再次被結核病抗原刺激時，會分泌多種細胞因子(IFN-)。因此，效應性T淋巴細胞的檢測可用于結核病或潛伏性結核病感染的診斷。由于其存活時間短和特異性強，效應性T細胞可用作生物體是否被感染的指標，而與臨床癥狀無關。目前，美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭和日本等20多個國家已將基于IGRA的產(chǎn)品寫入結核病診斷和治療指南。目前，在進口IGRA使用的商業(yè)試劑有兩種：1)澳大利亞Cellestis公司生產(chǎn)的試管定量結核金(QFT-吉特)，2) T-SPOT。結核

8、，蛋白質水平分子診斷，英國牛津免疫技術公司：-干擾素釋放試驗(IGRA)，-干擾素釋放試驗(IGRA)，-干擾素陰性，-干擾素陽性，斑點試驗。結核病原則。結核病采用專利特異性抗原(ESAT-6/CFP-10)通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測受試者體內是否存在結核病有效的T淋巴細胞，從而判斷受試者目前是否感染了結核分枝桿菌結核分枝桿菌特異性抗原：早期分泌抗原Rar Get 6 (ESAT-6)，培養(yǎng)過濾蛋白10 (CFP 10)，結核分枝桿菌特異性抗原，結核分枝桿菌基因組RD1區(qū)相同操縱子編碼的蛋白質，所有卡介苗都失去基因序列，大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌沒有RD1區(qū)。ESAT-6和CFP-10抗原，結核分枝桿菌

9、特異性抗原，蘇塞克斯，海，堪薩斯州，戈登，牛，非洲，斑點。結核病臨床表現(xiàn)指標中，特異性僅對結核分枝桿菌復合物敏感。與大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗無交叉反應。美國食品和藥物管理局數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)。國內臨床資料：特異性94.1%(478/508)。敏感性基本上不受低免疫/抑制的影響。肺結核患者的檢出率很高。美國食品和藥物管理局數(shù)據(jù)：敏感性95.6%(175/183)國內臨床數(shù)據(jù)：敏感性95.3%(624/655)，敏感性，特異性，斑點試驗。結核病實驗步驟，采集外周血單個核細胞，用BD CPT管或菲科爾提取物、結核病特異性抗原(ESAT-6/CFP 10)刺激結核病特異性效應t

10、淋巴細胞分泌-干擾素，效應t淋巴細胞分泌的-干擾素與預先用膜板包被的抗-干擾素抗體結合，固定在細胞周圍，一點=一個效應t細胞，加入顯色液，觀察結果，孵育過夜，洗滌平板，加入酶標二抗，實驗效果圖， 檢測特異性的提高有助于區(qū)分臨床上由卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床上無效藥物檢測靈敏度的提高，有利于臨床上結核病的早期發(fā)現(xiàn)和治療，避免疾病的傳播和擴散，并能在48小時內快速產(chǎn)生結果。 方法學的局限性不能區(qū)分活動性結核和潛伏感染，不能提示臨床患者的病理變化。需要結合臨床判斷。目前，無法根據(jù)斑點數(shù)判斷患者是活動性肺結核還是隱性感染費用昂貴(800元/次)。對實驗結果和陰性結果的解釋

11、表明，患者體內沒有結核分枝桿菌特異性效應T細胞。假陰性結果：不同感染階段；少數(shù)免疫系統(tǒng)功能障礙/疾?。粚嶒灢僮鳟惓?。陽性結果表明，患者體內存在結核分枝桿菌特異性效應T細胞，患者體內存在結核感染。然而，是否為活動性肺結核應結合臨床癥狀和其他檢測指標進行綜合判斷。假陽性結果：當四種環(huán)境分枝桿菌感染時：堪薩斯分枝桿菌、蘇氏分枝桿菌、海洋分枝桿菌、戈登分枝桿菌，它們是各國潛伏感染風險人群的篩查指南，15個多中心研究(樣本量為26 680)顯示，在4年隨訪期間，陽性個體的發(fā)病率為448例/1000人/年。2011年9月的研究結果表明，IGRA陰性兒童(小于5歲)不能排除結核病。感染。迪斯。J.30，81

12、7818，2011)。兒童結核病治療仍然逃避科學自然醫(yī)學卷：17，第：116011頁2011年10月。結核DNA檢測：1。它能穩(wěn)定地檢測10個拷貝的結核分枝桿菌核酸，靈敏度高，特異性強。2.結核病的早期、快速和準確診斷。痰、肺和支氣管灌洗液結核血播散性結核和各種器官腦脊液中樞神經(jīng)系統(tǒng)結核宮頸拭子和尿道拭子泌尿生殖道結核3。熒光定量聚合酶鏈反應檢測結核分枝桿菌的陽性率明顯高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。4.結核分支桿菌DNA濃度可用于判斷療效：痰標本中結核分支桿菌數(shù)量逐漸減少，結核分支桿菌DNA拷貝數(shù)逐漸減少。根據(jù)病原體DNA濃度，為藥物治療和療效觀察提供參考。分子生物學診斷、實時熒光定量聚

13、合酶鏈反應和環(huán)介導等溫擴增(LAMP)的特點是針對目標基因的6個區(qū)域設計了4個特異性引物，核酸擴增反應可以用鏈置換DNA聚合酶在63-65保溫30-60分鐘完成環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術，2小時全過程，目視檢查過程，檢查方法描述，結果判斷，在陰性對照反應管的液體顏色為橙色，陽性對照反應管的液體顏色為綠色的情況下：如果待測樣品的反應管的液體顏色為綠色，可以報告樣品的結核分枝桿菌檢測結果為陽性；如果待測樣品反應管中的液體顏色為橙色，則可以報告該樣品的結核分枝桿菌檢測結果為陰性；如果陰性和陽性對照反應管的結果與上述條件不一致，則測試結果無效，應重新測試。核糖核酸作為臨床分子診斷靶點的優(yōu)勢：核糖核

14、酸拷貝數(shù)脫氧核糖核酸拷貝數(shù)更具臨床意義。強毒病原體核糖核酸轉錄活性核糖核酸遠遠少于穩(wěn)定病原體死亡的脫氧核糖核酸，核糖核酸迅速降解。1.交叉污染更少。2.更好的恢復指數(shù)，結核核糖核酸，衛(wèi)星技術原理和操作過程。4.結核病的分子藥物敏感性。HAIN技術、脫氧核糖核酸條帶、t-spot、xpert MTB/Rif、脫氧核糖核酸微陣列、探針熔解曲線技術、原理：利用線性探針技術(LiPA)，擴增產(chǎn)物與預先固化在膜上的特定探針雜交，通過顯色反應判斷結果。試驗標本：痰涂片陽性標本/結核桿菌陽性標本，固體或液體培養(yǎng)菌株， Hain技術，GT-Blot 48自動雜交儀，所需設備：GTQ聚合酶鏈反應-96擴增儀，Mikro 220離心機，恒溫器，超聲波振蕩器，TARGET，MTBDRplus法，原理：rpoB、katG和inhA的聚合酶鏈反應擴增檢測，rpoB野生型探針： WT1-WT8 rpoB耐藥突變探針：mut1-:d516v，h526y，h526d 使用NaOH氫氧化鈉處理痰液樣品進行DNA提取，2)聚合酶鏈反應擴增，3)雜交擴增產(chǎn)物與固化在膜上的特異性探針的雜交，4)結果解釋，mtbdrplus反應帶(演