1、25.06.2020,1,歡迎各位同學(xué) 批評(píng)指正！,25.06.2020,2,馬放,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的未知種群 檢測(cè)與功能解析,25.06.2020,3,主要內(nèi)容,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn) 現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述 rDNA序列同源性微生物鑒定及其種群組成分析中的應(yīng)用 PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用 核酸探針雜交技術(shù)的應(yīng)用 DNA指紋圖譜技術(shù),25.06.2020,4,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),利用傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)獲得單一的微生物包括純種分離和培養(yǎng)兩個(gè)過(guò)程。純種分離的方法很多，可歸納為兩大類(lèi)：一類(lèi)是單細(xì)胞或單孢子分離；一類(lèi)是單菌落分離。,25.06.2020,5,微生物與農(nóng)業(yè)

2、 微生物與工業(yè) 微生物與醫(yī)學(xué) 微生物與環(huán)境保護(hù) 微生物與能源開(kāi)發(fā),傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀 微生物與人類(lèi)社會(huì),25.06.2020,6,在分子生物學(xué)誕生的20多年時(shí)間里，人們運(yùn)用基因工程的幾大基本技術(shù)：凝膠電泳技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)、DNA序列分析技術(shù)及基因定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)及環(huán)境保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用微生物進(jìn)行基因改造，實(shí)現(xiàn)了人為改造或修飾生物遺傳特性并創(chuàng)造生物新性狀的夢(mèng)想。,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀 微生物與現(xiàn)代分子生物學(xué),25.06.2020,7,基因改造后的工程菌,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的

3、挑戰(zhàn),25.06.2020,8,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是可以利用16S rRNA技術(shù)鑒定純培養(yǎng)物種的歸屬，大大豐富了我們所獲得的環(huán)境微生物種類(lèi)及遺傳多樣性。從分子水平上對(duì)微生物進(jìn)行基因研究，為探索微生物個(gè)體以及群體間作用的奧秘提供了新的線索和思路。,25.06.2020,9,純培養(yǎng)技術(shù)使得研究者擺脫了多種微生物共存的復(fù)雜局面，從而能夠不受干擾地對(duì)單一菌落進(jìn)行研究，確保了人類(lèi)對(duì)微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和遺傳特性的認(rèn)識(shí)。但是，隨著研究的不斷進(jìn)行，這一技術(shù)暴露出巨大的局限性平板計(jì)數(shù)異常 (Plate Countanomaly)，即環(huán)境中微生物實(shí)際數(shù)量同平板菌落計(jì)

4、數(shù)之間存在巨大差異。,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),25.06.2020,10,造成平板計(jì)數(shù)異常的原因： 由于實(shí)驗(yàn)室難以再現(xiàn)微生物的自然生存條件 大種群微生物易形成優(yōu)勢(shì)種進(jìn)而抑制了小種群的生長(zhǎng),傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),因此，利用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)總是重復(fù)篩選到相同的微生物，而多數(shù)難以被常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法培養(yǎng)的微生物被稱(chēng)為未培養(yǎng)微生物或不可培養(yǎng)微生物 (Uncultured Microorganism) 。,25.06.2020,11,微生物的自然多樣性 結(jié)構(gòu)多樣性 代謝多樣性 行為多樣性 進(jìn)化多樣性 生態(tài)多樣性,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),25.06.2020,12,傳統(tǒng)環(huán)境微生

5、物分析方法面臨的挑戰(zhàn),科學(xué)家根據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)證據(jù)推測(cè)微生物種類(lèi)數(shù)目應(yīng)該在105-106。 采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)對(duì)不同生境微生物可培養(yǎng)性的驗(yàn)證來(lái)看，海水中可培養(yǎng)的微生物約占0.001%-0.1%，淡水約占0.25%，土壤約占0.3%，活性污泥約占1%-15%左右。 許多實(shí)驗(yàn)室證實(shí)，有些微生物處于一種活的但不可培養(yǎng) (Viable but Nonculturable，VBNC) 的狀態(tài)。 據(jù)報(bào)道，至少有16個(gè)屬的30種細(xì)菌屬于此類(lèi)微生物。,因此，純培養(yǎng)技術(shù)的局限性已經(jīng)成為研究微生物自然生態(tài)和多樣性的主要瓶頸，這迫使我們不得不重新審視傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)。,25.06.2020,13,The omics

6、 組學(xué)技術(shù),Genome Transcriptome Proteome Metabolome,現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,系統(tǒng)生物學(xué),25.06.2020,14,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,組學(xué)技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)解析方面的應(yīng)用,25.06.2020,15,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展,微生物學(xué)家運(yùn)用非培養(yǎng)方法來(lái)研究自然界中的微生物，即避開(kāi)傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法，利用DNA含有不同的信息內(nèi)容和信息容量這一特性，直接研究細(xì)胞的DNA以獲取自然界微生物的多樣性及群落組成的信息，及從分子生態(tài)學(xué)的角度研究未培養(yǎng)微生物在環(huán)境中的變化。非培養(yǎng)技

7、術(shù)的主要任務(wù)在于：革命性地改變了人們對(duì)原核生物多樣性和自然界微生物群落組成的理解，并提供開(kāi)發(fā)不可培養(yǎng)微生物資源的新途徑。,25.06.2020,16,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,非培養(yǎng)技術(shù)的分類(lèi),25.06.2020,17,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,以群落分析為目的的非培養(yǎng)技術(shù),大尺度的分析群落DNA的非培養(yǎng)法有DNA-DNA復(fù)性和G+C含量分析兩種方法，它們能分別給出所研究微生物群落總的基因多樣性和結(jié)構(gòu)的改變。,DNA指紋技術(shù),大尺度群落分析,變性梯度凝膠電泳 (DGGE) 擴(kuò)增rDNA限制性分析 (ARDRA) 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (T-RFLP) 核糖體基因間序列分析 (

8、RISA),25.06.2020,18,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,以生物材料獲取為目的的非培養(yǎng)技術(shù),1. 基于目標(biāo)瞄定的PCR直接擴(kuò)增法，即不需知道基因的序列，僅根據(jù) 保守序列設(shè)計(jì)引物，就可以直接從環(huán)境DNA中擴(kuò)增到目的基因，該 法方便、簡(jiǎn)單、快速但不易獲得新型基因。,2. 宏基因組技術(shù)，即通過(guò)對(duì)環(huán)境DNA構(gòu)建插入基因組文庫(kù)，并利用活 性或序列篩選的方法以獲取目標(biāo)基因的新技術(shù)。,宏基因組技術(shù)不僅可以將系統(tǒng)發(fā)育信息和未培養(yǎng)群落成員隱含的功能信息以及未被發(fā)現(xiàn)的有意義的新的功能基因聯(lián)系起來(lái)，而且還可用于共生關(guān)系或其他簡(jiǎn)單群落中未培養(yǎng)群落的全基因組測(cè)序，有利于我們重新認(rèn)識(shí)有意義但未被開(kāi)發(fā)的生物學(xué)

9、過(guò)程。,25.06.2020,19,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與局限性,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)越性,(1) 發(fā)現(xiàn)新種 (2) 評(píng)價(jià)具有重要生態(tài)地位的種類(lèi) (3) 古菌的研究 (4) 菌種與環(huán)境功能的關(guān)聯(lián),非培養(yǎng)技術(shù)也有其缺陷和偏差。比如，克隆文庫(kù)測(cè)序不完全，細(xì)胞裂解程度的不同、特定細(xì)胞DNA被優(yōu)先擴(kuò)增以及由PCR的循環(huán)步驟帶來(lái)的一些分析難題影響著克隆文庫(kù)的應(yīng)用。,25.06.2020,20,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用前景,(1) 微生物多樣性程度的測(cè)定 (2) 生態(tài)學(xué)和進(jìn)化 (3) 目標(biāo)基因的獲取 (4) 非培養(yǎng)微生物特征的鑒定 (5) 系

10、統(tǒng)水平理解微生物群落動(dòng)力學(xué),25.06.2020,21,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,研究DNA多態(tài)性的最直接、有效的途徑就是測(cè)定DNA的序列，但測(cè)序是一項(xiàng)極為復(fù)雜和艱難的工作，同時(shí)也需要昂貴的設(shè)備。目前，在針對(duì)微生物研究的DNA指紋技術(shù)中，最常見(jiàn)的靶基因是16S rDNA和核糖體DNA的基因間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)。,細(xì)菌的rRNA 組成,25.06.2020,22,細(xì)菌的23S rDNA、16S rDNA和5S rDNA分別含有約為2900個(gè)、1540個(gè)和120個(gè)呈現(xiàn)不同堿基對(duì)排列的核苷酸。,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,

11、Carl Woese,上世紀(jì)60年代末，Woese開(kāi)始采用寡核苷酸編目法對(duì)生物進(jìn)行分類(lèi)，他通過(guò)比較各類(lèi)生物細(xì)胞的rDNA特征序列，認(rèn)為16S rDNA及其類(lèi)似的rDNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適。,25.06.2020,23,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,rDNA序列的微生物鑒定主要依據(jù)為： rDNA是生物體細(xì)胞中必要的成分，具有功能同源性且最為古老，而且同時(shí)含有保守序列和可變序列，分子大小適合操作，它的序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)等。,25.06.2020,24,用于一些DNA指紋分析方法（如DGGE/TGGE）的引物主要是針對(duì)16S rDNA為靶基因的引物，通過(guò)它的分析可以

12、直接鑒定到屬或種。根據(jù)核糖體16S rDNA結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，在所測(cè)定的區(qū)域中包括了V1、V2、V3、V8共8個(gè)高變區(qū)，尤其是V3這一高變區(qū)，由于其進(jìn)化速度相對(duì)較快，其中所包含的信息足夠用于物種屬及屬以上分類(lèi)單位的比較分析。常用引物包括341F/534R（V3區(qū)）、968F/1401R（V6-V8區(qū)）、63F/534R（V1-V3區(qū)）、341F/926R（V3-V5區(qū)）等。,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,16S rDNA,25.06.2020,25,常用16S rDNA序列引物,注：M=C或A，Y=C、A或T，K=G或T，R=A或G，S=G或C，W=A或T。,25.06.2020,26,

13、1980年，Brosius等利用23S rRNA基因序列測(cè)定的方法推導(dǎo)出大腸桿菌23S rRNA的全部核苷酸排列順序，整個(gè)分子含有2904個(gè)核苷酸。1981年相繼有三個(gè)實(shí)驗(yàn)室提出了大腸桿菌23S rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。目前已經(jīng)獲得了大量有關(guān)23S rRNA基因序列的信息，不同來(lái)源的23S rRNA約有60%70%的結(jié)構(gòu)共同性。大腸桿菌23S rRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)與酵母也有很大相似性。雖然已有大量的大腸桿菌23S rRNA基因序列信息，但是相比于16S rRNA基因序列信息要少得多，因此在微生物分析中還沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,23S rDNA,25.06.2

14、020,27,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,核糖體DNA的基因間隔區(qū) (ITS區(qū)),細(xì)菌的rDNA通常由5S、16S和23S及一些間隔序列組成。近十幾年來(lái)，人們成功的以核糖體大小亞基基因間的間隔序列為對(duì)象，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行更細(xì)致的分類(lèi)和鑒定，并對(duì)細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析。,核糖體DNA的基因間隔區(qū)示意圖,25.06.2020,28,PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用,PCR擴(kuò)增原理示意圖（左）及PCR儀工作原理曲線（右）,DNA指紋技術(shù)通常需要大量的DNA片段，因此，需要一種手段能夠同比例的放大混合DNA樣品的量。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）通過(guò)試管

15、中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)使極少量的基因組DNA或RNA樣品中的特定基因片段在短短幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍。,25.06.2020,29,不同種類(lèi)的PCR方法,25.06.2020,30,巢式PCR技術(shù),巢式PCR原理示意圖,巢式PCR (nested PCR)，是指利用兩套PCR引物 (巢式引物) 對(duì)DNA模板進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。,25.06.2020,31,反向PCR技術(shù),反向PCR的原理示意圖,常規(guī)PCR是擴(kuò)增兩引物之間的DNA片段，反向PCR（reverse PCR）是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段。,25.06.2020,32,原位PCR技術(shù),原位PCR可應(yīng)用于多種類(lèi)型的研

16、究材料（組織切片、離心細(xì)胞、懸浮細(xì)胞等）不同拷貝數(shù)目的序列（病毒的或基因組的DNA或RNA），擴(kuò)增方法可分為單個(gè)或多個(gè)引物對(duì)，檢測(cè)系統(tǒng)也分為直接和間接兩種。,原位PCR的大致流程主要包括： 染色體、細(xì)胞及組織切片樣品的制備 PCR前處理，包括石蠟切片、去石蠟、染色體變性和細(xì)胞穿透 PCR擴(kuò)增，一般采用熱啟動(dòng)PCR，病毒RNA的擴(kuò)增需用反轉(zhuǎn)錄PCR d. 原位雜交及檢測(cè)。,25.06.2020,33,定量PCR技術(shù),定量PCR技術(shù)的方法主要包括：PCR產(chǎn)物的直接定量、有限稀釋法、外對(duì)照PCR定量、內(nèi)對(duì)照PCR定量、競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量以及熒光定量PCR。其中又以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time

17、 Fluorescent Quantitative PCR，RFQ-PCR）的方法應(yīng)用最為廣泛。,25.06.2020,34,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的兩種定量技術(shù)原理,定量PCR技術(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR的動(dòng)態(tài)變化圖（左）和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（右）,25.06.2020,35,反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),反轉(zhuǎn)錄PCR（Reversed Transcript PCR，RT-PCR），是一種將cDNA合成與PCR技術(shù)結(jié)合，用以分析基因表達(dá)的快速、靈敏的方法。,反轉(zhuǎn)錄P CR原理示意圖,25.06.2020,36,熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR技術(shù),熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR

18、，簡(jiǎn)稱(chēng)TAIL-PCR）是一種用來(lái)分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。,TAIL-PCR反應(yīng)流程,25.06.2020,37,核酸探針雜交技術(shù)的應(yīng)用,分子雜交技術(shù) (technique of molecular hybridization) 又稱(chēng)核酸雜交技術(shù)，是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段從分子水平探討組織細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)變化規(guī)律，并闡明細(xì)胞功能調(diào)節(jié)機(jī)制的一種極為重要的方法，在一定程度上具有其他生物檢測(cè)技術(shù)所不能替代的作用。,25.06.2020,38,常規(guī)分子雜交技術(shù)的定義及分類(lèi),25.06.2020,39,菌落原位雜交,菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上

19、，然后將濾膜上的菌落裂解以釋出DNA與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)的方法。,用菌落原位雜交方法進(jìn)行的FAST Plaque TB實(shí)驗(yàn),25.06.2020,40,Southern印跡,Southern印跡雜交的操作流程,25.06.2020,41,熒光原位雜交技術(shù),原位雜交 (In Situ Hybridization，ISH) 技術(shù)是用標(biāo)記的核酸探針，使用非放射檢測(cè)系統(tǒng)或放射自顯影系統(tǒng)，在組織切片、細(xì)胞涂片及染色體制片上等對(duì)核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量研究的一種分子生物學(xué)方法，具有靈敏、特異、直觀等優(yōu)點(diǎn)。,ANAMMOX污泥中浮霉?fàn)罴?xì)菌熒光原位雜交分析,25.06.2020,42,熒光原位雜交技術(shù),熒光

20、原位雜交技術(shù)的基本原理是基于堿基互補(bǔ)的原則，用熒光素標(biāo)記的已知外源DNA或RNA作探針，與待檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA相互補(bǔ)的核酸探針進(jìn)行染色體水平上的原位雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交位點(diǎn)熒光來(lái)顯示特定核苷酸序列的存在、數(shù)目和定位。,FISH技術(shù)具體步驟,25.06.2020,43,熒光原位雜交技術(shù),mFISH技術(shù)的實(shí)驗(yàn)路線圖,25.06.2020,44,熒光原位雜交技術(shù),利用熒光原位雜交技術(shù)觀測(cè)鐵沉積樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu),25.06.2020,45,生物芯片技術(shù),生物芯片是指通過(guò)微加工和微電子技術(shù)在固相基質(zhì)表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞及蛋白質(zhì)、核酸等生物分子進(jìn)行準(zhǔn)確、快速

21、、高通量檢測(cè)。生物芯片的本質(zhì)特征是利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理以及計(jì)算機(jī)技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的樣品檢測(cè)、分析過(guò)程實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、集成化、微型化。,生物芯片各部分高度整合,25.06.2020,46,生物芯片技術(shù),生物芯片新技術(shù)及其優(yōu)點(diǎn),25.06.2020,47,生物芯片技術(shù),基因芯片技術(shù)的原理,25.06.2020,48,生物芯片技術(shù),cDNA微陣列芯片原理圖,25.06.2020,49,生物芯片技術(shù),核酸編程的蛋白質(zhì)芯片制備原理,25.06.2020,50,DNA指紋圖譜技術(shù),DNA指紋技術(shù)包括：,變性梯度凝膠電泳（DGGE） 溫度梯度凝膠電泳（TGGE） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）

22、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP） 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（T-RFLP） 核糖體基因間隔序列分析（RISA） 擴(kuò)增的rDNA限制酶切分析技術(shù)（ARDRA） 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RAPD）,25.06.2020,51,DNA指紋圖譜技術(shù),DNA指紋圖譜的建立過(guò)程示意圖,總DNA提取流程示意圖,25.06.2020,52,匹配指紋技術(shù)的電泳技術(shù),25.06.2020,53,DNA指紋圖譜技術(shù),瓊脂糖凝膠電泳示意圖,25.06.2020,54,DNA指紋圖譜技術(shù),聚丙烯酰胺電泳示意圖,25.06.2020,55,常見(jiàn)DNA指紋技術(shù)的比較,25.06.2020,56,常見(jiàn)DNA指紋技術(shù)

23、的比較,25.06.2020,57,DNA指紋圖譜技術(shù),變性梯度凝膠電泳 (DGGE),DGGE的原理是：在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時(shí)需要不同的變性劑濃度，DNA雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會(huì)急劇下降，因此，將PCR擴(kuò)增得到的等長(zhǎng)DNA片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進(jìn)行電泳，序列不同的DNA片段就會(huì)在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度的急劇下降，以至停留在其相應(yīng)的變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分開(kāi)的條帶，每個(gè)條帶代表一個(gè)特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的條帶，一般可視為具有相同序列的DNA。,25.06.20

24、20,58,DNA指紋圖譜技術(shù),不同偶氮染料脫色菌群的DGGE指紋分析圖譜,25.06.2020,59,溫度梯度凝膠電泳 (TGGE),DNA指紋圖譜技術(shù),TGGE技術(shù)的基本原理與DGGE技術(shù)相似，含有高濃度甲醛和尿素的凝膠溫度梯度呈線性增加，這樣的溫度梯度凝膠可以有效分離PCR產(chǎn)物及目的片段。,大熊貓面部菌群的TGGE圖譜,25.06.2020,60,單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）,DNA指紋圖譜技術(shù),PCR-SSCP技術(shù)是1989年日本關(guān)谷實(shí)驗(yàn)室將PCR反應(yīng)與單鏈DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳相結(jié)合而創(chuàng)立的。,活性污泥體系的SSCP指紋圖譜,25.06.2020,61,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（AFLP）,DNA指紋圖譜技術(shù),擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）是1993年由荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的新方法，它可以檢測(cè)整個(gè)生物基因組的多態(tài)性。,引物組合E7P16230在F2群體檢測(cè)結(jié)果,25.06.2020,62,DNA指紋圖譜技術(shù),末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（T-RFLP）,末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）是RFLP基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，相對(duì)于其它分子生物學(xué)技術(shù)具有分辨率高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特