1、線粒體疾病的分子生物學(xué)檢驗 Molecular diagnosis for mitochondrial related disorders,2,線粒體（Mitochondrion）,1. 真核細胞中的細胞器，二分裂方式進行新陳代謝，平均壽命10天 2. 多數(shù)細胞含幾個到幾千個線粒體 3. 每個線粒體含2-10 線粒體DNA（mtDNA）,3,線粒體功能,Mitochondrial Disease.Chest 2001; 120:634648,ATP,能量代謝,其他功能,儲存鈣離子 調(diào)節(jié)膜電位并控制細胞程序性死亡 細胞增殖與細胞代謝的調(diào)控 合成膽固醇及某些血紅素 產(chǎn)熱,Wikipedia,線粒體

2、病 Mitochondrial disorders,發(fā)現(xiàn)- 1962 年， Lufe 等發(fā)現(xiàn)一位年輕的瑞典婦女伴有異常增高的基礎(chǔ)代謝率，同時伴有線粒體結(jié)構(gòu)的異常和氧化磷酸化功能的異常。直到1988年， Wallace 等報道了首例由線粒體 DNA突變引起的人類疾病，明確了mtDNA 突變可引起人類疾病。 定義- 是遺傳缺陷引起線粒體異常，致使ATP合成障礙、能量來源不足等導(dǎo)致的一組異質(zhì)性病變，又稱為線粒體細胞病。 發(fā)病率- 約為1:5000（約每5000人中1人發(fā)?。?Smeitink 2006,線粒體病 mitochondrial disorders, 是一組高度臨床變異性和遺傳異質(zhì)性的疾病

3、,線粒體蛋白,16,569 bp circular double stranded (mtDNA) 20%,1,500 nuclear genes 80%,structural protein of the OXPHOS complexes protein required for assembly of OXPHOS complexes proteins involved in mtDNA translation proteins involved in mtDNA maintenance proteins involved in mitochondrial fusion and fissi

4、on,Douglas C. Wallace, 18171819,Shoubridge, 2001; Schapira，2000,進一步導(dǎo)致線粒體功能異常：,底物的運輸缺陷； 底物的利用缺陷； 檸檬酸循環(huán)異常； 氧化磷酸化脫偶聯(lián)； 呼吸鏈異常。,發(fā)病特點,核基因突變常染色體隱性、顯性遺傳或X-連鎖遺傳,線粒體基因突變母系遺傳 （突變的mtDNA在母血增加，受累及的后代發(fā)病頻率增加）,mtDNA突變與臨床表型之間關(guān)系復(fù)雜，主要表現(xiàn)為同一種mtDNA突變可以引發(fā)多種不同的疾病表型，而同一種疾病表型又可以由多種不同的mtDNA突變誘導(dǎo)。,遺傳異質(zhì)性,嬰幼兒起病較常見,編碼線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的核基因突變 進

5、行性外眼肌麻痹（PEO）、線粒體神經(jīng)腸胃腦肌病、Leigh氏綜合征 線粒體蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)的核基因突變 2004年Miller等首次報道核基因編碼的線粒體核糖體蛋白亞單位16(MRPS16)純合突變，導(dǎo)致先天畸形伴張力衰竭、四肢水腫、肝轉(zhuǎn)氨酶活性升高并乳酸亞基中毒癥， 該女嬰在出生后3天死亡。,核基因突變,線粒體基因突變,突變的影響： 引起呼吸鏈功能缺陷 氧化磷酸化酶異常 閾值效應(yīng)：組織特異性 突變的 mtDNA 在復(fù)制分離時可能不均等分配 母系遺傳：不同突變后代發(fā)病風(fēng)險不同。 相比A8344G突變，攜帶 A3243G 突變的母系后代更容易發(fā)病。 突變分布：同質(zhì)性各器官組織分布相同 異質(zhì)性不同組

6、織、細胞分布不同,一般特點,母系遺傳 （Maternal Inheritance）,11,同質(zhì)性突變與異質(zhì)性突變,12,線粒體基因 同質(zhì)性（Homoplasmy） 0 或 100% 異質(zhì)性（Heteroplasmy） 0-100%,核基因 純合子（Homozygous） 0 或 100% 雜合子（Heterozygous） 50%,mtDNA同質(zhì)性/異質(zhì)性突變與閾值,13,線粒體基因突變,點突變 目前已報道的mtDNA 點突變將近330種，涉及mtDNA編碼的各個基因，其中結(jié)構(gòu)基因突變177種、tRNA基因突變137種、rRNA基因突變12種、D-Loop區(qū)突變2種 LHON、線粒體腦肌病合并

7、乳酸血征及卒中發(fā)作綜合征、肌陣攣癲癇、破碎紅纖維病、母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征等 重排 重排突變逾數(shù)百 遺傳性痙攣性截癱等 (http：/),線粒體疾病是復(fù)雜性疾病,遺傳方式復(fù)雜 常染色體隱性遺傳（Autosomal Recessive） 常染色體顯性遺傳（Autosomal Dominant） 性連鎖遺傳（Sex linked） 母系遺傳（Maternally inherited） 臨床表型復(fù)雜 累及多系統(tǒng)（Multisystemic involvement） 影響幾乎所有組織器官（Any organ or tissue can be affected）,15,

8、16,線粒體功能涉及眾多的組織器官,線粒體病的共同臨床特點,嬰兒期發(fā)?。?常見于嬰兒伴隨COX陰性肌纖維、腦病和Leigh綜合征。 兒童發(fā)病： 見于MELAS、MERRF、Leigh病、線粒體肌病、線粒體心肌病和KSS。 中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害： 共濟失調(diào)、癲癇、肌張力下降、脊髓病等 周圍神經(jīng)損害： 交感神經(jīng)病出現(xiàn)在MNGIE和Wolfram綜合征 視聽神經(jīng)損害： 視神經(jīng)病出現(xiàn)在Leber病和顯性遺傳視神經(jīng)萎縮1型 聽力喪失出現(xiàn)在KSS 肌肉病 見于線粒體肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹見于KSS和PEO,（高度臨床變異性）,Chinnery et al. Lancet 2000,線粒體疾病的生

9、化診斷,當(dāng)患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢查可以輔助診斷。,代謝產(chǎn)物分析（血液、尿液、腦脊液等） 血液可以正常，但腦脊液多異常，（動脈比靜脈好）；乳酸/丙酮酸比高(50:1)提示呼吸鏈?zhǔn)艿阶钄?。正常不除外線粒體疾病。,酶測定 氧化磷酸化（OXPHOS）系統(tǒng)的酶活性測定。（western、比色法等）方法不穩(wěn)定 一般情況下，血清CK（肌酸激酶）正?；蜉p度升高；升高占30%見于慢性進行性眼外肌麻痹；mtDNA丟失時非常高。,J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292,19,線粒體疾病的生化診斷,當(dāng)患者基因變異不能被確定時，完整的生化檢查可以輔助診斷

10、。,肌肉活檢 線粒體病的肌肉病理改變特點： （1）出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)異常、細胞色素陰性肌纖維或破碎紅纖維（ RRF ）為主要病理改變。 （2）上述病理改變出現(xiàn)的頻率高。 （3）缺乏其他的肌肉病理改變。,J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292,兒童及成人線粒體疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn),A 符合線粒體腦肌病各綜合征的臨床表現(xiàn) 如KSS、CPEO、MELAS、MERRF 等； 多系統(tǒng)不明原因發(fā)病 必須至少三個系統(tǒng)出現(xiàn)臨床癥狀 除先證者外，至少有一個母系家族成員有發(fā)病可能 排除其它代謝和非代謝疾病 B 肌活檢 在骨骼肌中存在2%破碎樣紅肌纖維,主要診斷標(biāo)準(zhǔn),(Ber

11、nier et al, 2002)(3, 5),21,C 有以下一種或多種呼吸鏈酶活性受抑制的表現(xiàn)： 50歲以下肌活檢COX陰性肌纖維2%； 50歲以上肌活檢COX陰性肌纖維5%； 任一組織中呼吸鏈酶活性20%； 任一細胞系中呼吸鏈酶活性30%； 多于兩組織內(nèi)相同呼吸鏈酶活性30%；,主要診斷標(biāo)準(zhǔn),次要診斷標(biāo)準(zhǔn)：,A 癥狀符合線粒體腦肌病的臨床表現(xiàn)； 至少以下一種提示肌肉中線粒體異常的表現(xiàn)： 3050歲肌活檢RRF在1%2%； 30 歲以下肌活檢出現(xiàn)RRF； 電鏡下見廣泛線粒體異常； B 至少一種呼吸鏈功能受抑制的表現(xiàn)： 生化或極譜描記的呼吸鏈復(fù)合物活性在20%30%； 用免疫方法證實呼吸鏈復(fù)

12、合物表達減少；,(Bernier et al, 2002)(3, 5),次要診斷標(biāo)準(zhǔn)：,C 發(fā)現(xiàn)可能相關(guān)的mtDNA 異常； D 一種或多種氧化磷酸化受損的表現(xiàn)： 腦脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高； 若疑為KSS，腦脊液蛋白質(zhì)增高； PET或31P-MRS證實肌肉或腦代謝降低； 最大氧分壓、平均氧分壓或乳酸閾值降低。,(Bernier et al, 2002)(3, 5),符合以上2個主要診斷指標(biāo)或1個主要診斷指標(biāo)及2個次要診斷指標(biāo)的即為確診線粒體病； 符合1個主要診斷指標(biāo)及1個次要診斷指標(biāo)或至少3個次要診斷指標(biāo)的為擬診線粒體??； 符合1個主要診斷指標(biāo)或在符合臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上還具備1

13、個次要診斷指標(biāo)的為疑診線粒體病。,J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292,線粒體病診斷時應(yīng)注意,基因診斷與生化檢查如能量代謝情況、呼吸鏈和酶復(fù)合體活性等相結(jié)合 要區(qū)分病理性突變和正常衰老所致的線粒體基因突變 線粒體基因異常與臨床表現(xiàn)的嚴重程度之間存在量效關(guān)系 散發(fā)與遺傳的相關(guān)性 ，診斷是否遺傳需排除環(huán)境、藥物和衰老等因素,26,第一節(jié) 線粒體基因組與疾病,線粒體基因組及其表達系統(tǒng) 線粒體基因組與細胞核基因組的相互關(guān)系 線粒體基因組變異與疾病,27,人類線粒體基因組,Light strand: 8 tR

14、NA and 1 mRNA (ND6) Heavy strand: 14 tRNA, 2 rRNA, and 12 mRNA Polycistronic with posttranscriptional processing,基因組小, 僅16569 bp 雙鏈環(huán)狀DNA 13 結(jié)構(gòu)基因 / mRNA 22 tRNA 基因 2 rRNA 基因 12S rRNA 基因 16S rRNA 基因 非編碼區(qū) D-loop（約1120bp） L鏈復(fù)制起始區(qū)（約3050bp，tRNAAsn-tRNACys） 高突變率,線粒體基因組及其表達系統(tǒng),The two strands of mtDNA are di

15、fferentiated by their nucleotide content with the guanine rich strand referred to as the heavy strand, and the cytosine rich strand referred to as the light strand. The heavy strand encodes 28 genes, and the light strand encodes 9 genes for a total of 37 genes. Of the 37 genes, 13 are for proteins (

16、polypeptides), 22 are for transfer RNA (tRNA) and two are for the small and large subunits of ribosomal RNA (rRNA).,Transport chain (13 peptides) Many of the genes encode the transport chain:,2 rRNAs Mitochondrial rRNA is encoded by MT-RNR1 (12S rRNA) MT-RNR2 (16S rRNA).,22 tRNAs The following genes

17、 encode tRNA:,Control region D-loop,576,Replication,Human mitochondrial DNA (mtDNA) has three promoters, H1, H2, and L (heavy strand 1, heavy strand 2, and light strand promoters). The H1 promoter transcribes the entire heavy strand and The L promoter transcribes the entire light strand. The H2 prom

18、oter causes the transcription of the two mitochondrial rRNA molecules.,Transcription,The process of transcription initiation in mitochondria involves three types of proteins: the mitochondrial RNA polymerase (POLRMT), 2. mitochondrial transcription factor A (TFAM), 3. mitochondrial transcription fac

19、tors B1 and B2 (TFB1M, TFB2M).,43,第一節(jié) 線粒體基因組與疾病,線粒體基因組及其表達系統(tǒng) 線粒體基因組與細胞核基因組的相互關(guān)系 線粒體基因組變異與疾病,44,核基因組與線粒體基因組的相互作用,核基因組編碼了1500多個線粒體蛋白,線粒體基因組只編碼了13條多肽鏈,“交叉對話（cross-talk）”機制,45,第一節(jié) 線粒體基因組與疾病,線粒體基因組及其表達系統(tǒng) 線粒體基因組與細胞核基因組的相互關(guān)系 線粒體基因組變異與疾病 線粒體基因組變異 堿基突變：點突變。其中結(jié)構(gòu)基因的點突變，與核基因組一樣，包括同義突變和錯義突變 缺失與插入： mtDNA拷貝數(shù)目突變： 線

20、粒體基因組變異與疾病 耳聾，Leber遺傳性視神經(jīng)病變，糖尿病，高血壓，腫瘤,46,在線粒體相關(guān)疾病中常見的DNA點突變,MELAS綜合征（線粒體腦肌病乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作）： A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(UUR)基因） MERRF（肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維）： A8344G (80%), T8356C（在tRNALys基因） Leber視神經(jīng)?。↙HON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因） 耳聾（Deafness）: A1555G, T1494C（在12S rRNA基因） A3243G（在tRNALeu(UUR)基因） 2型糖

21、尿病（Type 2 Diabetes）: A3243G（在tRNALeu(UUR)基因） NARP（共濟失調(diào)伴色素性視網(wǎng)膜炎神經(jīng)?。?T8993G, T8993C（在ATPase 6 基因）,線粒體病的分子診斷,標(biāo)本選擇： 外周血白細胞最常用 毛發(fā) 唾液 尿液 骨骼肌檢測 mtDNA分子診斷的最好標(biāo)本,檢測已知DNA突變的方法： 等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO） 等位基因特異性擴增（ASA） 限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RLFP） 連接酶鏈反應(yīng)（LCR） 基因芯片技術(shù),檢測未知DNA突變的方法： 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP） 變性梯度凝膠電泳（DEEG） 異源雙鏈分析（HA）

22、 DNA序列測序 變性高效液相色譜（DHPLC）,分子診斷方法,49,線粒體疾病中常見的突變,核基因突變（nuclear gene mutations） 氧化磷酸化系統(tǒng)由核基因編碼的蛋白質(zhì), 例如: Surf1, SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc. 呼吸鏈缺陷: 重復(fù)、缺失 線粒體DNA點突變（mtDNA point mutations） LHON, MELAS, MERRF, NARP, etc. mtDNA缺失/重復(fù)（mtDNA Deletions/duplications） eg. KSS, Pearson synd, diabetes 而野生型沒有Apa的酶切位點, 故

23、電泳只能看到長度為553 bp的1 條片段,引物,可以覆蓋整個線粒體DNA基因組,（3組）,PCR產(chǎn)物 富集過程,基因組DNA文庫,高通量捕獲測序,Targeted Next-Generation Sequencing,探針,應(yīng)用技術(shù)平臺 Illumina GAllX,作為新一代分子生物學(xué)綜合技術(shù)平臺，Genome Analyzer測序技術(shù)避免了像傳統(tǒng)測序技術(shù)那樣耗費大量人力、物力進行片段克隆、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提等工作，具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，低運行成本等突出優(yōu)勢，是目前市場占有率最高的第二代高通量基因測序儀。,Next Generation Sequencing (NGS),測序深度（deep）： 是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個基因大小為2M，測序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。,Next Generation Sequencing (NGS),覆蓋度（coverage）： 指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝獲得