1、a,1,植物DNA的提取與純化 DNA extraction,實(shí)驗(yàn)一,a,2,實(shí)驗(yàn)原理,植物DNA的分離是分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和育種學(xué)等植物科學(xué)研究的基礎(chǔ)要求。對DNA提取一般有三個要求：,1. DNA的純度可以滿足下游操作的要求,2. DNA必須完整,3. DNA應(yīng)當(dāng)有足夠的量,構(gòu)建基因組文庫，初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。 RFLP和PCR分析，DNA長度可短至50kb，在該長度以上，可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下)，并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段(一般2kb以下)。,如果對植物進(jìn)行大規(guī)模篩選，操作程序應(yīng)當(dāng)快捷，簡便，價格低廉，并盡

2、可能避免使用有毒試劑。,a,3,核酸的理化性質(zhì) RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時，先把DNP抽提出來，再把蛋白質(zhì)和糖去除，同時除去RNA及無機(jī)離子等，從中分離D

3、NA 。,a,4,核酸的提取方法 提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，對它們進(jìn)行稍加修改就可以應(yīng)用于DNA的微量提取。兩種方法均采用去污劑裂解細(xì)胞并保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸內(nèi)切酶降解。 具體方法簡單說來就是利用液氮對植物組織進(jìn)行研磨，從而破碎細(xì)胞。細(xì)胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀。,a,5,實(shí)驗(yàn)材料和試劑,實(shí)驗(yàn)材料：新鮮植物組織。,100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 50mmol/L EDTA 500 mmol/L NaCl 1.5% SD

4、S,DNA提取緩沖液,實(shí)驗(yàn)所需試劑：,24:1/氯仿:戊醇 其它試劑：液氮、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇。,2CTAB buffer 100mM Tris pH8.0 1.4M NaCl 20 mM EDTA pH8.0 2% CTAB 0.2% 巰基乙醇 酚/氯仿（1:1） 氯仿：50 ml 無水乙醇,a,6,實(shí)驗(yàn)儀器,a,7,實(shí)驗(yàn)步驟： 取新鮮葉片約3g, 剪碎, 加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)移至2ml離心管中； 2. 在65預(yù)熱的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite, 混勻并調(diào)pH至8.0； 3. 在管中加入適量提取液，60水浴保溫約30min，不時顛倒混勻； 4. 冷卻至室溫后

5、加入等體積氯仿/異戊醇，用力搖勻后，放置搖床上搖動15min左右； 5. 室溫下10000rpm離心15min，小心吸上清于新的離心管中，加入兩倍體積的冷酒精，-20 放置1h或過夜； 6. 挑出DNA置于新的管中，挑出有困難時可以低速離心后倒去上清。加入適量70%酒精，搖動洗滌10min，重復(fù)洗滌2-3次； 7. 吹干DNA，加入適量TE在65溶解，完全溶解后離心去除雜質(zhì)； 加入RNase（10mg/mL）, 室溫處理0.5-1h, 除去RNA，4或-20貯存。 如需純化DNA，再加入適量TE，氯仿/異戊醇多次抽提后吸取上清，加入3ml/L NaAc和兩倍體積的乙醇， -20 放置1h或過夜； 吹干沉淀后，加入適量TE， 65溶解， 4或-20貯存。,a,8,1. 植物葉子約3g, 剪碎置預(yù)冷研缽中,加入液氮充分研磨，注意不能干磨,混合球磨儀,a,9,3. 60水浴保溫30-60min,a,10,加入等體積氯仿，用力搖勻,a,11,6. 再次10000rpm離心5min； 將上清小心吸入新的離心管中；,a,12,DNA樣品在1% Agarose膠上電泳（例圖）,a,13,實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),微量移液槍的使用一定要規(guī)范，吸取氯仿等有機(jī)試劑要注意不要將試劑