1、細胞化學(xué)染色,滄州醫(yī)專醫(yī)學(xué)技術(shù)系 侯振江,1,精制課件,細胞化學(xué)染色，是一種以形態(tài)為基礎(chǔ)，結(jié)合運用化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)對血細胞內(nèi)各種化學(xué)成分作定位、定性及半定量分析的方法。 用于研究血細胞生理、病理和化學(xué)結(jié)構(gòu)； 臨床上為某些血液病的診斷、鑒別診斷、療效觀察、預(yù)后監(jiān)測和發(fā)病機制的探討，提供重要依據(jù)。,2,精制課件,血細胞化學(xué)染色的基本要求是在原位顯示細胞成分和結(jié)構(gòu)，反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是有色沉淀物，具有一定的穩(wěn)定性。 血細胞化學(xué)染色可顯示糖原、脂類、酶、蛋白質(zhì)等。,3,精制課件,（一）固定 固定有物理法與化學(xué)法， 物理法為干燥和火焰固定， 化學(xué)法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,血細胞化學(xué)染色流程,4,

2、精制課件,（二）顯示 1、偶氮偶聯(lián)法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，再與重氮鹽結(jié)合引起偶氮偶聯(lián)，使其形成不溶性的偶氮色素，以此證明酶的存在。 2、聯(lián)苯胺法：粒細胞和單核細胞中的過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色的聯(lián)苯胺形成藍色沉淀。,5,精制課件,3、普魯士藍法：細胞內(nèi)、外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成藍色亞鐵氰化鐵沉淀。 4、雪夫反應(yīng)：過碘酸氧化細胞內(nèi)糖類中乙二醇基形成乙醛基，醛基與雪夫試劑作用，使無色品紅形成紅色沉淀。 5、金屬沉著法 其他尚有物理學(xué)方法，如脂溶性染料染色（顯示脂質(zhì)）、熒光顯示、放射自顯影以及體外活體染色亦常用于臨床血液細胞學(xué)診斷。,6,精制課件

3、,（三）細胞化學(xué)定量 粗略估量，以染色反應(yīng)的強弱，受色的深淺，人為地區(qū)別為陰性和各種程度的陽性。 百分法，只能反映細胞陽性率，不能反映受色強弱。 積分法，是常用的半定量法，將等級估量與百分率相結(jié)合它既反映了細胞陽性率的高低，又反映了細胞受色的強弱。,7,精制課件,下面介紹幾種常用的細胞化學(xué)染色方法 這些方法學(xué)在白血病的鑒別診斷上具有重要意義。,8,精制課件,一、過氧化物酶染色（POX）,（一）四甲基聯(lián)苯胺法 【原理】 粒細胞和單核細胞的胞漿內(nèi)的髓過氧化物酶（POX orMPO）分解過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色聯(lián)苯胺氧化成藍色聯(lián)苯胺，后者進一步變成棕色化合物沉著于細胞質(zhì)內(nèi)。,9,精制課件,【試

4、劑】 1%TMB 亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液 1%過氧化氫溶液 稀過氧化氫溶液 瑞氏染色液,10,精制課件,【操作】 1. 取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液10ml，溶液呈淡棕黃色。 2. 在新鮮干燥的血片上，加混合溶液0.5ml, 放置lmin后，再加稀過氧化氫溶液0.7ml，染色6min 。 3. 瑞氏染液復(fù)染1520min 。 4. 油鏡鏡檢。,11,精制課件,【結(jié)果】 細胞質(zhì)內(nèi)有藍黑色顆粒者為陽性。 （） 無顆粒沉著； （） 顆粒細小 ，分布稀疏； （+） 顆粒較粗，局灶分布； （+） 顆粒粗大，分布較密，占胞質(zhì) 1/22/3； （+） 顆粒粗大，呈團塊分布； （+

5、） 全部胞質(zhì)均部滿顆粒，可覆蓋胞核。,12,精制課件,【臨床意義】 （1）粒系： POX主要分布在粒細胞和單核細胞內(nèi)，隨著粒細胞成熟的程度而逐漸增強，中性分葉核粒細胞為強陽性。 嗜酸性粒細胞陽性程度最強，其陽性顆粒比中性粒細胞粗大，有折光。 堿性粒細胞為陰性。,13,精制課件,（2）單核細胞： 原始單核細胞為陰性反應(yīng)， 幼稚單核細胞和成熟單核細胞呈弱陽性反應(yīng)，顆粒細小，彌散分布。,14,精制課件,（3）其他細胞 淋巴細胞、漿細胞、幼紅細胞、組織細 胞、巨核細胞均呈陰性反應(yīng)。 （4）血小板過氧化物酶 主要定位于幼稚型巨核細胞的核膜上，可作為原巨核細胞的一種標志物，有助于FAB M7的識別。,15

6、,精制課件,（5）過氧化物酶染色 主要用于鑒別急性白血病類型， 急性髓細胞白血病多呈陽性反應(yīng)，以M3和M2型反應(yīng)最強，MI和M5型反應(yīng)較弱， 故有助于區(qū)別M3和M5型。 急性淋巴細胞白血病呈POX陰性反應(yīng)，故為急性髓細胞和淋巴細胞白血病鑒別的重要指標。,16,精制課件,AML-M1,17,精制課件,18,精制課件,M1 - POX(+),19,精制課件,20,精制課件,二、蘇丹黑B染色,【原理】 蘇丹黑B (sudan black B , SB )是一種能溶解于脂肪中的色素染料，可使細胞內(nèi)的中性脂肪、磷脂和類固醇著色，即使細胞內(nèi)微細結(jié)構(gòu)的脂類物質(zhì)也能顯示出來。,21,精制課件,【試劑】 1.

7、10%甲醛液。 2. 蘇丹黑B乙醇溶液,22,精制課件,【操作】 1干燥血片或骨髓片在甲醛蒸氣中固定。 2自來水沖洗。 3放人染色液中，37 染色3060min。 4用70%乙醇脫色12min，水洗lmin。. 5瑞氏染液復(fù)染2030min。,23,精制課件,【結(jié)果】 脂類呈黑色或棕黑色顆粒，定位于細胞漿中 （+） 顆粒很小，細小、稀疏，或胞質(zhì)局部面積的1/4有致密的顆粒。 （+）顆粒較少，或胞質(zhì)面積的1/2出現(xiàn)黑色顆粒。 （+）顆粒較密，或胞質(zhì)面積的3/4出現(xiàn)黑色顆粒。 （+） 顆粒極密，顆粒間無間隙。,24,精制課件,【臨床意義】 1. 粒細胞系 早幼粒及以下階段隨著細胞成熟，陽性顆粒逐漸

8、增加。 早期原粒細胞一般為陰性，少數(shù)細小點狀顆粒代表線粒體被染色 晚期原粒細胞可出現(xiàn)陽性顆粒，其顆粒限于胞漿的某一區(qū)域。,25,精制課件,2. 單核細胞系 陽性，顆粒細小，分布彌散，形狀不規(guī)則。原單核細胞為陰性。 3紅細胞系、淋巴細胞系均呈陰性反應(yīng) 4尼曼一匹克細胞和戈謝細胞均為陽性反應(yīng)。,26,精制課件,5蘇丹黑B和過氧化物酶染色臨床意義相似，主要用于急性白血病類型的鑒別。 蘇丹黑B染色較過氧化物酶染色更敏感，但特異性不如過氧化物酶染色（極少數(shù)急性淋巴細胞白血病可為陽性）。,27,精制課件,M1-SBB(+),28,精制課件,M2-SBB(+),29,精制課件,三、過碘酸一雪夫（PAS)染色

9、,【原理】 胞漿內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì)（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）經(jīng)過碘酸（periodic acid）氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗–HO-CHO），與雪夫(Schiff )試劑中的無色品紅結(jié)合，形成紫紅色染料而沉積于胞漿中。該反應(yīng)稱為過碘酸一雪夫(PAS)陽性反應(yīng)。,30,精制課件,【結(jié)果】 （1）粒細胞系： 原粒細胞多呈陰性反應(yīng)，也可弱陽性。 自早幼粒細胞以后隨著細胞的成熟程度，陽性反應(yīng)逐漸增強。 嗜酸粒細胞顆粒本身不著色，但顆粒間的胞質(zhì)呈彌漫性陽性反應(yīng)； 嗜堿粒細胞為陽性反應(yīng)，顆粒紫紅色，大小不一。,31,精制課件,中性粒細胞糖原含量參考標準 （-） 胞

10、質(zhì)無顆粒 （+） 胞質(zhì)呈淡紅色，無顆粒 （+） 胞質(zhì)呈紅色，有少量顆粒 （+） 胞質(zhì)呈暗紅色 ，顆粒較密 （+）胞質(zhì)呈紫紅色，顆粒極密,32,精制課件,過碘酸-Schiff反應(yīng)(PAS),33,精制課件,（2）淋巴細胞系： 大多數(shù)淋巴細胞呈陰 性反應(yīng)， 少數(shù)為（+）的陽性反應(yīng)。 淋巴細胞糖原含量程度參考標準 （-） 胞質(zhì)內(nèi)無顆粒 （+） 胞質(zhì)內(nèi)有顆粒 （+） 有較粗紅色顆粒 （+） 有粗大紅色顆粒 （+） 顆粒粗大并有紅色塊狀,34,精制課件,（3）紅細胞系： 幼紅細胞和紅細胞呈陰性反應(yīng) 紅細胞系列糖原含量程度參考標準 （-） 胞質(zhì)無顆粒 （+） 有少數(shù)紅色顆粒 （+） 有較粗紅色顆?；驈浡t

11、色 （+） 有粗大紅色顆?；蛏罴t色 （+）有粗大紅色塊狀或紫紅色,35,精制課件,（4）巨核細胞： 巨核細胞和血小板染色反應(yīng)均為陽性 巨核細胞糖原含量程度參考標準 （-） 胞質(zhì)無顆粒 （+） 少量糖原包涵體 （+） 中等量糖原包涵體，定位于核膜 出或分散胞質(zhì)中，占胞質(zhì)1/3 （+）大量糖原包涵體分散于胞質(zhì)的1/2 （+）糖原包涵體充滿整個胞質(zhì),36,精制課件,PAS 巨核細胞,巨核細胞包涵體,37,精制課件,（5）單核細胞呈陰性或陽性，顆粒細小，往往位于胞質(zhì)邊緣； 漿細胞大多呈陰性，少數(shù)為紅色顆粒陽性； 組織細胞為陰性反應(yīng)； 巨噬細胞可呈陽性，為紅色顆粒反應(yīng)。,38,精制課件,【臨床意義】 （

12、1）M6與巨幼貧的鑒別 M6的幼紅細胞PAS可呈強陽性，積分明顯增高，巨貧、再障、溶貧時PAS反應(yīng)為陰性。 （2）急性白血病的類型鑒別 ALL，PAS呈大塊狀陽性，也可是陰性，AML為陰性，急性單核細胞白血病時原單核細胞及幼單核細胞PAS陽性，積分增高，陽性顆粒小而多，呈彌散分布。,39,精制課件,ALL-L1,40,精制課件,L1 PAS(+),41,精制課件,AML-M5,42,精制課件,M5 PAS(+),43,精制課件,AML-M6,44,精制課件,AML-M6 PAS(+),45,精制課件,AML-M7,46,精制課件,M7 PAS(+),47,精制課件,（3）巨核細胞和Sternb

13、erg細胞鑒別 巨核細胞PAS強陽性，Sternberg細胞為陰性或弱陽性。 （4）戈謝氏細胞強陽性，尼曼-皮克細胞陰性或弱陽性。 （5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴細胞的糖原積分增高；一般的病毒感染，糖原積分在正常范圍內(nèi)。,48,精制課件,四、中性粒細胞堿性磷酸酶染色,偶氮偶聯(lián)法（Kaplow法） 【原理】中性粒細胞胞漿中的堿性磷酸酶在pH 9.29.8緩沖液中，能水解磷酸萘酚鈉，并釋放出磷酸與萘酚。再以重氮鹽與萘酚偶聯(lián)成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞漿中。,49,精制課件,【結(jié)果】 堅牢藍RR陽性為紫黑色顆粒， 堅牢紫醬GBC陽性為棕紅色沉淀。 “一”陰性反應(yīng)，胞漿中無陽性染色顆粒。 “”胞漿中

14、含有少量顆?；虺蕪浬\紅色（或彌散紫色）。 “2”胞漿中含有中等量顆粒或彌散受色。 “3”胞漿中有豐富的顆?；驈浬⑸钌?，胞核清晰。 “4”有極豐富的粗大顆粒，充滿胞漿，或彌散深色，胞核不清晰。,50,精制課件,中性粒細胞堿性磷酸酶(NAP),偶氮偶聯(lián)法,51,精制課件,NAP積分法 計數(shù)100個成熟中性粒細胞，按其反應(yīng)強度分級，各級百分率與其級數(shù)乘積的總和，即為積分。 例如： NAP反應(yīng)結(jié)果（%） （-） （+） （+） （+） （+） 20 40 20 15 5 積分=（020）+（220）+（315）+（45）=145 參考值：正常人血細胞堿性磷酸酶除成熟中性粒細胞（桿狀核及分葉核）可見陽

15、性外，其他血細胞均為陰性。 中性粒細胞NAP活性積分值一般為1050分，但有時可高達162分。,52,精制課件,【臨床意義】 （1）生理變化： 新生兒NAP增高，成人較兒童減低，老人更低；激烈運動增高； 月經(jīng)期經(jīng)前增高，行經(jīng)后降低，經(jīng)后期恢復(fù)正常； 妊娠期2-3月輕度增高，以后逐漸增高，分娩時達到高峰，產(chǎn)后恢復(fù)正常。,53,精制課件,（2）、病理變化 增高：嚴重化膿性感染、類白血病反應(yīng)、AA、CML加速期、ALL、CLL、惡性淋巴瘤、癌轉(zhuǎn)移、MM、真紅、骨髓纖維化等。 減低：PNH、CML、惡性組織細胞病、MDS。,54,精制課件,（3）疾病鑒別診斷 慢粒與類白的鑒別：CML減低，類白增高。

16、急性白血病的鑒別：AML減低，ALL增高。 PNH與AA鑒別：PNH減低，AA增高。 病原微生物的鑒別：病毒感染減低，細菌感染增高。,55,精制課件,56,精制課件,NAP (+),CML-NAP(-),57,精制課件,五、骨髓鐵染色,【原理】正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細胞中，骨髓中的鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍反應(yīng)，形成藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位，從而反映骨髓中鐵的儲存量?；瘜W(xué)反應(yīng)過程為： 4 Fe3+ 3 K4Fe（CN）6 Fe4Fe（CN）6312 K+ （含鐵物質(zhì)） （亞鐵氰化鉀） （亞鐵氰化鐵）,58,精制課件,【結(jié)果】 （1）細胞外鐵

17、的觀察 ： 細胞外鐵呈藍色的顆粒狀、小株狀或團塊狀。 以油鏡觀察定級標準 （-） 無鐵?？梢姟?（+） 少數(shù)鐵?；蜩F小珠。 （+） 較多鐵粒和鐵小珠。 （+） 很多鐵粒、鐵小珠和少數(shù)小塊。 （+）極多鐵粒、鐵小珠并有很多小塊，密集成堆。 正常范圍：+，“+”占2/3，“+”占1/3。,59,精制課件,細胞外鐵,60,精制課件,（2）細胞內(nèi)鐵觀察： 細胞內(nèi)鐵指有核紅細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍色顆粒，以油鏡計100個中、晚幼紅細胞，記錄胞質(zhì)中含有藍色小顆粒（即鐵粒紅細胞）的比值。并根據(jù)細胞鐵顆粒的數(shù)目、大小、染色深淺和顆粒分布情況，將鐵粒幼紅細胞分為如下四型：,61,精制課件,型：僅含1-2個鐵顆粒。 型：含3-4個鐵顆粒。 型：含6-9個以上鐵顆粒。 型：10個鐵顆粒。 正常范圍：30% 90% ，平均60%， 多見型，少見型，無、型。,62,精制課件,細胞內(nèi)鐵,63,精制課件,（3）環(huán)形鐵粒幼紅細胞： 指含鐵顆粒6個，其中2/3以上鐵顆粒圍繞核周排列成完整環(huán)形或不完整環(huán)形。 正?；蚍氰F粒幼細貧血無環(huán)形鐵粒幼細胞，鐵粒幼細貧血中環(huán)形鐵粒幼細胞6% 。,64,精制課件,環(huán)形鐵粒幼細胞,65,精制課件,【臨床意義】 1缺鐵性貧血時， 骨髓細胞外鐵明顯減少，為“一”“士”，細胞內(nèi)鐵平均5.9%，僅為I型。 經(jīng)有效鐵劑