1、b,1,致病性大腸埃希氏菌及其檢驗(yàn),b,2,大腸埃希氏菌,俗稱大腸桿菌,是人類和動(dòng)物腸道中正常菌群的主要成員,每克糞便中約含109個(gè).大腸埃希氏菌隨糞便排出后,廣泛分布于自然界.水、牛乳及其他食品一旦檢出大腸埃希氏菌，即意味著這些物品直接或間接被糞便污染。,b,3,正常情況下，大腸埃希氏菌不致病，而且還能合成維生素B和維生素K,生產(chǎn)大腸菌素，對機(jī)體有利。但當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或大腸埃希氏菌侵入腸外組織或器官時(shí)，可作為條件致病菌而引起腸道外感染。有些血清型可引起腸道感染。致病性大腸埃希氏菌屬主要分為五大類，首先根據(jù)發(fā)病機(jī)理分為三大類， 1、產(chǎn)毒素型大腸埃希氏菌(ETEC)， 2、侵襲型大腸埃希氏菌(

2、EIEC) 3、腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC) 近來又提出另外兩類 4、出血性大腸埃希氏菌(EHEC) 5、腸粘附性大腸埃希氏菌(EAEC),b,4,致病性大腸埃希氏菌中，一般認(rèn)為能產(chǎn)生耐熱ST)和不耐熱(LT)腸毒素的兩種菌株均可引起人的食物中毒。引起大腸埃希氏菌中毒的主要是一些動(dòng)物性食品，如乳與乳制品、肉類、水產(chǎn)品等，牛和豬是傳播這種病菌、引起中毒的主要原因。,b,5,1996年7月在日本就發(fā)生了大腸桿菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒，10人死亡，其原因與生食蘿卜苗有關(guān)，其中92例并發(fā)出血性腸炎及出血性尿毒癥。2001年，再江蘇、安徽等地爆發(fā)的腸出血性大腸桿菌0157:

3、H7食物中毒，造成177人死亡，中毒人數(shù)超過2萬人。 如仔豬黃、白痢、豬水腫病、牛腹瀉和敗血癥等均可由大腸桿菌引起。,b,6,一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性,形態(tài)與染色 本屬細(xì)菌為革蘭氏陰性兩端鈍圓、中等大小的無芽孢桿菌，絕大多數(shù)周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，周身還有菌毛，不產(chǎn)生莢膜，某些菌株有莢膜。,普通大腸埃希氏菌Escherichia Coli,b,7,培養(yǎng)特性 1)需氧及兼性厭氧菌 2)對營養(yǎng)的要求不高，在普通瓊脂上就生長良好，在15C-45范圍內(nèi)均可生長，但最適生長溫度為37，最適pH為7.2-7.4。 3)在普通瓊脂平板上培養(yǎng)24小時(shí)，可形成圓形、凸起、光滑、濕潤、半透明、邊緣整齊、中等大小的菌落其

4、菌落與沙門氏菌比較相似，但是，大腸桿菌菌落對光(45角折射)觀察可見熒光。 4)在肉湯培養(yǎng)基中生長18-24小時(shí)變?yōu)榫鶆驕?，而后底部出現(xiàn)粘性沉淀物，并伴有臭味。,一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性,b,8,5）在鮮血瓊脂平板上生長，有些菌株可見溶血環(huán)。 6）在遠(yuǎn)藤瓊脂上長成帶金屬光澤的紅色菌落 7）在SS瓊脂平板上多不生長，少數(shù)生長的細(xì)菌，也因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸而形成紅色菌落； 8）在伊紅美蘭瓊脂上形成紫黑色具有金屬光澤的菌落 9）在麥康凱瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)后孤立菌落呈紅色,b,9,埃希氏菌在SS瓊脂平板上形成紅色菌落,b,10,在麥康基培養(yǎng)基上培養(yǎng)的大腸埃希桿菌 大腸埃希桿菌產(chǎn)生粉紅色乳糖發(fā)酵菌落。麥康基培

5、養(yǎng)基是腸道細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基，含膽鹽、乳糖和pH指示劑中性紅。乳糖發(fā)酵菌落產(chǎn)生酸，將指示劑變紅。（麥康基瓊脂，18小時(shí)，37）,b,11,革蘭氏陰性桿菌,b,12,b,13,革蘭氏陽性桿菌,b,14,大腸桿菌掃描電鏡照片,b,15,大腸桿菌透射電鏡照片,b,16,大腸桿菌革蘭氏染色照片,b,17,大腸桿菌平板菌落照片,b,18,一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性,生化特性 1）可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有些不典型的菌株不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵乳糖； 2）不同菌株對蔗糖，衛(wèi)矛醇、水楊苷發(fā)酵結(jié)果不一致; 3）本菌可使賴氨酸脫鞍、不能使苯丙氨酸脫羧。 4）不產(chǎn)生H2S，不液化明膠，不分解尿素;,b,1

6、9,5）、不能在氰化鉀培養(yǎng)基上生長，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性，V-P試驗(yàn)陰性，不利用枸櫞酸鹽。后四項(xiàng)生化特性是典型的大腸埃希氏菌，與此不一致的即為非典型大腸埃希氏菌菌。 IMViC試驗(yàn)：如IMViC試驗(yàn)為+、+、-、-，且乳糖發(fā)酵，表明被檢物已有糞便污染，有發(fā)生腸道傳染病的危險(xiǎn)，這是衛(wèi)生細(xì)菌中常用的檢測指標(biāo)。（I：吲哚形成試驗(yàn)，M：甲基紅試驗(yàn)，Vi：V-P試驗(yàn)，C：枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)）,b,20,I-吲哚（indol）試驗(yàn) 色氨酸吲哚玫瑰吲哚 吲哚試劑,b,21,M-甲基紅（methyl red）實(shí)驗(yàn) 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 甲基紅 - 葡萄糖丙酮酸 甲基紅 +,b,22,V-VP（Voges-Pros

7、kauer）試驗(yàn) 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰紅色化合物+ 胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇,V-VP（Voges-Proskauer）試驗(yàn) 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰紅色化合物+ 胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇,b,23,C-枸櫞酸鹽利用（citrate utilization）試驗(yàn),利用枸櫞酸鹽生長 + 不能利用 -,b,24,一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性,抵抗力 該菌對熱的抵抗力較其他腸道桿菌強(qiáng)，55經(jīng)60分鐘或60加熱15分鐘仍有部分細(xì)菌存活。 在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。對磺胺類、鏈霉素、氯霉素等敏感，青霉素對它的作用弱, 易產(chǎn)生耐藥菌

8、株.,b,25,一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性,致病性：（1）致病因素 侵襲力:大腸桿菌具有抗原和菌毛,抗原有抗吞噬作用,有抵抗抗體和補(bǔ)體的作用,菌毛能幫助細(xì)菌黏附于黏膜表面.有侵襲力的菌株可以侵犯腸道表皮層引起炎癥. 內(nèi)毒素:大腸桿菌細(xì)胞壁具有內(nèi)毒素的活性 腸毒素:有兩種,不耐熱腸毒素(LT),成分可能是蛋白質(zhì),加熱65經(jīng)30min即被破壞. LT與霍亂菌腸毒素作用相似,都是刺激小腸上皮細(xì)胞的腺苷環(huán)化酶,使ATP轉(zhuǎn)變?yōu)镃AMP,促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞的分泌功能,使腸液大量分泌,引起腹瀉;耐熱腸毒素(ST)無免疫性,耐熱,100經(jīng)10-20min不被破壞,也可使腸道細(xì)胞的CAMP水平升高,引起腹瀉.,b,2

9、6,LT與ST的比較,b,27,一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性,致病性：（2）所致疾病 腸外感染：泌尿系統(tǒng)感染最常見病原菌。還可引起膽囊炎、肺炎、新生兒或嬰兒腦膜炎。 腹瀉：產(chǎn)毒素大腸桿菌是嬰兒及旅游者腹瀉的主要原因；致病性大腸桿菌是嬰兒腹瀉的主要原因；侵襲型大腸桿菌主要引起較大兒童和成年人腹瀉。,b,28,一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性,血清學(xué)特性 大腸埃希氏菌的抗原構(gòu)造主要由菌體抗原(O)，鞭毛抗原(H)和莢膜抗原(K)三部分組成。 1）O抗原 成分為細(xì)胞壁上的糖、類脂和蛋白質(zhì)復(fù)合物，也是細(xì)菌的內(nèi)毒素，熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，高壓蒸汽處理2小時(shí)不被破壞。每一血清型只含有一種O抗原，本菌已發(fā)現(xiàn)有167種O抗原，分

10、別以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。 2）H抗原 為蛋白質(zhì)；一種大腸埃希氏菌只有一種H抗原，無鞭毛則無H抗原，H抗原能在80度被破壞，也能被酒精破壞。H抗原共有64種。,b,29,3）K抗原 是細(xì)胞外部的莢膜或菌體表面物質(zhì)，又稱包膜抗原。新分離的大腸埃希氏菌70具有K抗原。根據(jù)K抗原耐熱的敏感性可把K抗原分為A、B、L三類，共有103種，致病性大腸埃希氏菌的抗原主要為B抗原，少數(shù)為L抗原，B抗原與L抗原均可在煮沸后被破壞，A抗原耐熱性強(qiáng)，可耐受煮沸1小時(shí)而不被破壞。， O抗原可將大腸埃希氏菌分成若干血清群，再根據(jù)K抗原和H抗原進(jìn)一步分為若干個(gè)血清型或亞型，根據(jù)大腸埃希氏菌抗原的鑒定結(jié)果，寫出其抗原式如O111

11、：K58(B)H12，一般認(rèn)為H抗原與致病性無關(guān)，因此，一般不需要進(jìn)行H抗原的鑒定。,b,30,二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)應(yīng)按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法(微生物學(xué)部分)(GB4896-84)的有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行檢驗(yàn)。其檢驗(yàn)程序如圖52。,b,31,二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),（一）、增菌培養(yǎng) 1、以無菌操作的方法稱取樣品25g，加入225ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，可用滅菌砂在研缽中磨碎或以均質(zhì)器打碎樣品。 2、取適量接種于乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，測定大腸菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于361培養(yǎng)6小時(shí)。挑取一環(huán)，接種于一管30ml腸道菌增菌肉湯中，42增菌培養(yǎng)

12、18小時(shí)。,b,32,二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),（二）、分離培養(yǎng) 1、將乳糖膽鹽發(fā)酵陽性管液與增菌液分別劃線接種于麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板上。 2、于361培養(yǎng)1824小時(shí)觀察菌落對于污染嚴(yán)重的食品可直接按劃線法接種，不經(jīng)過增菌過程。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時(shí)也要注意乳糖不發(fā)酵的菌落。,b,33,EMB平板照片及原理,原理：伊紅美藍(lán)瓊脂平板含伊紅和美藍(lán)染料，在此亦作為指示劑。大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)，故可染上酸性染料伊紅，又因伊紅與美蘭結(jié)合（該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物）使大腸菌群產(chǎn)生帶核心的、有金屬光澤的深紫色的（龍膽紫的紫色）陽性菌落，從菌落表面的反射光中還可看到綠色金屬閃光。在

13、伊紅美蘭平板上的典型菌落呈紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常有金屬光澤。有的由于被檢樣品影響，亦呈現(xiàn)紫色、粉紫、中心灰紫、無黑心、濕潤等，常為大腸桿菌，均應(yīng)注意挑選。,b,34,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的特征,b,35,EMB培養(yǎng)基，上為E.coli，下為傷寒桿菌,b,36,大腸桿菌在麥康凱瓊脂（）的特征,麥康凱瓊脂（）或伊紅美蘭（）瓊脂平板上，置培養(yǎng)小時(shí)，檢查有無疑似大腸桿菌菌落。大腸桿菌在麥康凱平板上的典型菌落呈鮮艷的桃紅、粉紅色.,大腸埃希氏菌在麥康凱瓊脂平板上的特征,b,37,大腸埃希氏菌在麥康凱瓊脂平板上的特征,大腸埃希氏菌在麥康凱瓊脂平板粘稠菌落的特征,b,38,沙門氏菌

14、麥康凱瓊脂平板菌落,不發(fā)酵乳糖,b,39,二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),（三）、生化試驗(yàn) 1、選取在麥康凱或伊紅美蘭平板上發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌落5個(gè)以上，分別接種于三糖鐵(TSI)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI).同時(shí)將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、半固體、尿素瓊脂、氰化鉀肉湯和賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基。經(jīng)36培養(yǎng)18-24小時(shí)。棄去H2S陽性或尿素酶陽性或阿拉伯糖陰性的培養(yǎng)物。 2、TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸,底層產(chǎn)酸, H2S陰性,氰化鉀陰性和尿素酶陰性的培養(yǎng)物為大腸埃希氏菌. TSI底層不產(chǎn)酸或 H2S、氰化鉀、尿素有任何一項(xiàng)為陽性的培養(yǎng)物，均非大腸埃希氏菌。必要時(shí)做氧化酶實(shí)驗(yàn)或革藍(lán)氏染色鏡檢。,b

15、,40,b,41,枸椽酸鹽試驗(yàn)原理及斜面照片,枸椽酸鹽試驗(yàn)： 某些細(xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。大腸桿菌陰性,產(chǎn)氣桿菌陽性.,b,42,枸椽酸鹽試驗(yàn)原理及斜面照片,b,43,大腸桿菌：MR + /VP -,b,44,注關(guān)于大腸桿菌的反應(yīng)的說明 大腸桿菌試驗(yàn)的模式反應(yīng)，在一般情況下應(yīng)為“”或?qū)ⅰ啊币舶ㄔ趦?nèi)，共代表了絕大多數(shù)大腸桿菌（占）的實(shí)際反應(yīng)結(jié)果，因而受到了國際上的廣泛承認(rèn)，并將其列為大腸桿菌的常規(guī)鑒別反應(yīng)公式。但個(gè)別大腸桿菌的反應(yīng)，也可能出現(xiàn)“”和“”等等異常現(xiàn)象。由于這種異常反應(yīng)出現(xiàn)的頻率極

16、少，沒有普遍性的代表意義，因而在分類鑒別和統(tǒng)計(jì)學(xué)上，可以忽略不計(jì)。,b,45,致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),（四）血清學(xué)試驗(yàn) 假定試驗(yàn)： 從平板上選菌落生長稠密處挑取培養(yǎng)物，用致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌多價(jià)O血清和出血性大腸埃希氏菌O157血清做玻片凝集試驗(yàn)。不凝集的培養(yǎng)物可做陰性報(bào)告。當(dāng)與某一種多價(jià)O血清凝集時(shí),再與該多價(jià)血清所包含的單價(jià)血清做實(shí)驗(yàn),如與某一種單價(jià)O血清呈現(xiàn)強(qiáng)烈的凝集反應(yīng),即為假定實(shí)驗(yàn)陽性.不凝集的培養(yǎng)物可做陰性報(bào)告。,b,46,致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),（四）血清學(xué)試驗(yàn) 證實(shí)試驗(yàn)： 制備O抗原懸液,稀釋血清.稀釋血清與抗原懸液在10mm75mm

17、試管內(nèi)等量混合,做試管凝集試驗(yàn). （五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗(yàn) 1、動(dòng)物試驗(yàn) 將經(jīng)過生化證實(shí)試驗(yàn)的大腸埃希氏菌培養(yǎng)物接種肉湯管，于36+1培養(yǎng)24小時(shí)，3000轉(zhuǎn)分離心30分鐘。取上清液用G6濾器過濾后分作兩份，一份加熱6030分鐘，供ST測定用，另一份不加熱，供LT測定用。,b,47,致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),（五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗(yàn) 1、動(dòng)物試驗(yàn) 1）家免結(jié)軋回腸段試驗(yàn)：取體重為2kg的家兔，禁食使腸內(nèi)容物排空。麻醉后剖腹，取出回腸段，按10-15cm為一段，分段結(jié)扎，取一段注射肉湯2mL作為陰性對照，另一段注射已知產(chǎn)毒菌肉湯培養(yǎng)物的上清液2ml作為陽性對照。其他各段分

18、別注射待試菌株肉湯培養(yǎng)物的濾液2mL。將腹壁縫合。 測定LT時(shí)，于注射后18小時(shí)剖腹檢查 測定ST時(shí)，于注射后6-8小時(shí)剖腹檢查 取出腸管分別抽取腸段的積液，測定其容量，并測定腸段的長度。積液量(mL)與腸段長度(cm)之比大于l者為陽性。,b,48,（五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗(yàn) 1、動(dòng)物試驗(yàn) 2）乳鼠灌胃試驗(yàn)：將被檢菌株接種于Honda氏產(chǎn)毒肉湯內(nèi),36度培養(yǎng)24小時(shí),離心,取上清夜,注入1-4日齡乳胃內(nèi),禁食3-4小時(shí),麻醉,取出腸管,稱量腸管(包括積液)質(zhì)量及剩余體質(zhì)量,二者之比大于0.09陽性,0.07-0.09為可疑.,致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),b,49,致病性大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),（五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗(yàn) 2、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn): 將被檢菌按5點(diǎn)環(huán)形接種于Elek氏培養(yǎng)基上，以同樣操作共做兩份，361培養(yǎng)48小時(shí)，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素紙片，36+1經(jīng)56時(shí)，使抗生素滲入瓊脂中，在五點(diǎn)環(huán)形菌苔各5mm處的中央，挖一個(gè)直徑4mm的園并用一滴瓊脂墊底。在一份平板的孔內(nèi)滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔內(nèi)滴加ST毒素30ul。放于36+1經(jīng)1520小時(shí)觀察結(jié)果，在菌