1、精選,1,細胞自噬機制 主講人：晏劍虹,精選,克里斯汀德迪夫（Christian deDuve）,比利時科學家Christian de Duve在上世紀50年代通過電鏡觀察到自噬體（autophagosome）結構，并且在 1963 年溶酶體國際會議（CIBA Foundation Symposium on Lysosomes）上首先提出了“自噬”這種說法。因此Christian de Duve被公認為自噬研究的鼻祖。Christian de Duve 也因發(fā)現(xiàn)溶酶體，于1974年獲得諾貝爾獎,精選,大隅良典,2016年，因“在細胞自噬機制方面的發(fā)現(xiàn)”而獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。大隅教授的貢獻

2、在于，他找到了酵母這種簡單又與人體細胞相似的實驗模型，將復雜的問題化難為易了。,精選,大隅良典,宮崎駿,精選,在酵母菌體內(左側)存在一個巨大的細胞器，名為液泡，其功能與人以及其他哺乳動物體內細胞內的溶酶體相類似。于是他培養(yǎng)了經過改造，缺乏液泡膜降解酶的酵母菌并通過饑餓的方法激活細胞的自噬機制。此時，當這些酵母菌遭受饑餓時，吞噬小體開始在液泡內部大量聚集(右圖)。大隅良典的實驗證明酵母菌內部存在自噬現(xiàn)象。此后，大隅良典教授對數(shù)以千計的酵母菌變異樣本進行了核對(右側)，并從中找到了據(jù)信與自噬作用密切相關的15組基因。,精選,凋亡與自噬,表中可以看出，在過去的十年之中，幾乎每個生命科學家都知道“凋

3、亡”這個概念并且有意無意將自己的研究工作與之掛鉤。自噬（autophagy）是繼凋亡（apoptosis）后，當前生命科學最熱的研究領域，Pubmed記錄的文獻數(shù)量在最近4年呈爆炸式增長，其中2006年以前相關文獻大約1500條。2007年是自噬研究有歷史意義的一年，召開了第一次自噬國際會議，與會人員構成自噬學術圈的奠基者，并且在各自領域宣傳和研究一些基本概念。2007年到2010年9月短短三年文獻發(fā)表量達到大約4400條。我們堅信在未來十年“自噬”也將會成為另一個“萬金油”和生命科學的“閃亮新星”。,精選,在大隅良典發(fā)現(xiàn)細胞自噬的關鍵機制之后，研究局面豁然開朗，相關論文發(fā)表量驟然上升。,精選

4、,細胞自噬的定義,細胞自噬(autophagy)是真核生物中進化保守的對細胞內物質進行周轉的重要過程。該過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹后，送入溶酶體(動物）或液泡（酵母和植物）中進行降解并得以循環(huán)利用。,精選,細胞自噬基本過程,精選,自噬基本過程： 1.自噬前體的形成 2.自噬體的形成 3.自噬溶酶體的融合 4.自噬體的溶解,內涵體,自噬內涵體,溶酶體,自噬溶酶體,自噬前體,自噬體,精選,細胞自噬分類（根據(jù)進入溶酶體途徑不同）,巨自噬 微自噬 分子伴侶介導的自噬,精選,巨自噬,內外刺激誘導下，細胞通過自噬基因調控組裝自噬前體。自噬體包裹細胞質,細胞器或細菌等形成自噬體，

5、在微管作用下，自噬體與溶酶體靠近，自噬體外層膜與溶酶體膜融合，包有內層膜的自噬體進入溶酶體，形成自噬溶酶體。繼而，自噬體內膜被溶酶體酶降解，繼而內容物被降解，營養(yǎng)成分被細胞重新利用。,精選,微自噬,主要集中于酵母。當受到饑餓等刺激時，溶酶體膜局部凹陷，吞噬細胞質或微體，形成自噬體。自噬體脫離溶酶體膜，進入溶酶體腔，由溶酶體酶降解，降解物質被細胞再利用。,精選,分子伴侶介導的自噬（CMA）,分子伴侶介導的自噬（CMA）：胞質內蛋白結合到分子伴侶后被轉運到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化。CMA 的底物是可溶的蛋白質分子，在清除蛋白質時有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性。 分子伴侶：一類在序列上沒有相

6、關性但有共同功能的蛋白質，它們在細胞內幫助其他含多肽的結構完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構成這些蛋白質結構執(zhí)行功能的組份,精選,自噬的特性,1）自噬是細胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎對細胞不利。事實上，細胞正常情況下很少發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素的存在。這些誘發(fā)因素很多，也是研究的熱門。既有來自于細胞外的（如外界中的營養(yǎng)成分、缺血缺氧、生長因子的濃度等），也有細胞內的（代謝壓力、衰老或破損的細胞器、折疊錯誤或聚集的蛋白質等）。由于這些因素的經常性存在，因此，細胞保持了一種很低的、基礎的自噬活性以維持自穩(wěn)。 2）自噬過程很快，被誘導后8min即可觀察到自噬

7、體（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶體（autolysosome）基本降解消失。這有利于細胞快速適應惡劣環(huán)境。 3）自噬的可誘導特性：表現(xiàn)在2個方面，第一是自噬相關蛋白的快速合成，這是準備階段。第二是自噬體的快速大量形成，這是執(zhí)行階段。 4）批量降解：這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區(qū)別 5）“捕獲”胞漿成分的非特異性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特異性不是首先考慮的，這與自噬的應急特性是相適應的。 6）自噬的保守性：由于自噬有利于細胞的存活，因此無論是物種間、還是各細胞類型之間（包括腫瘤細胞），自噬都普遍被保留下來（誰不喜歡留一手呢？）。,精選,微管相關蛋白輕鏈3（MAP-L

8、C3）,12135-1-AP,微管相關蛋白輕鏈3（MAP-LC3），簡稱LC3，參與了自噬的形成，并被證明了是哺乳動物細胞中常見的自噬小體標記蛋白之一。Western blot可能會檢測到LC3的兩種形式，這是由于自噬形成時，胞漿型LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(PE)結合轉變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），這兩種形式在正常細胞中都是存在的，而發(fā)生自噬的細胞中LC3-II會有明顯的增加。,精選,精選,自噬小體的增多有兩種可能,一是形成增加即自噬被誘導； 另外一種是自噬體成熟受抑即自噬體不能和溶酶體結合。 自噬誘導劑 1）Bredeldin A /

9、Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激 2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶） 3）Earles平衡鹽溶液：制造饑餓 4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑 5）Rapamycin：mTOR抑制劑 6）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑,精選,自噬的抑制劑,根據(jù)自噬形成的過程，自噬的抑制也分為不同的階段，包括自噬的起始

10、階段，自噬泡和溶酶體融合階段，以及溶酶體內的降解階段。目前常用的一些抑制藥物如下： （1）對自噬體形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制劑（如3-MA），這些藥物均可干擾或阻斷自噬體形成。 （2）對自噬體與溶酶體融合的抑制：對自噬體與溶酶體融合過程進行阻斷也能起著抑制自噬的作用，這些藥物有巴伐洛霉素A1、長春堿、諾考達唑等。 （3）對溶酶體降解的抑制：蛋白酶抑制劑，如E64d、Pepstatin A等,精選,自噬體的檢測,（1）以透射電子顯微鏡下超微結構的形態(tài)學檢測。 （2）自噬體膜標志性蛋白質的檢測。 （3）單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。 （4）檢測長壽蛋白的批量降解 （5）CellTr

11、ackerTM Green染色,精選,細胞自噬功能,（1）細胞自噬通過防御環(huán)境變化和應激代謝反應調控來維持細胞內部 的穩(wěn)態(tài)。 （2）細胞自噬具有自我“清理”功能，可以處理細胞內的廢物，降解 錯誤折疊的 蛋白質多聚體，減少DNA的損傷和染色體的不穩(wěn)定性， 防止異常蛋白質累積，還能降解功能 失常的線粒體、高爾基體等 細胞器，對蛋白質和細胞器進行質量控制 ，并且通過降解底物來為細胞生存提供原材料或ATP （3）細胞自噬甚至可以清除細胞內的病原體，保護細胞免受損傷，對于對抗癌癥、衰老、神經退行性病變、感染等都有著重要的意義。 （4）細胞自噬是程序性細胞死亡的一種，在某些情況下，若細胞無法 繼續(xù)維持自身

12、的生存，細胞自噬會誘導細胞主動性死亡。,精選,細胞自噬與腫瘤的治療,精選,自噬與腫瘤的關系,與凋亡（在腫瘤細胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被優(yōu)先保留的。無論是腫瘤細胞還是正常細胞，保持一種基礎、低水平的自噬活性是至關重要的。因為細胞中隨時產生的“垃圾”（破損或衰老的細胞器、長壽命蛋白質、錯誤合成或折疊錯誤的蛋白質等等）都需要及時清除，而這主要靠自噬來完成，因此，自噬具有維持細胞自穩(wěn)的功能；如果將自噬相關基因突變失活，如神經元會發(fā)生大量聚集蛋白，并出現(xiàn)神經元退化。同時，自噬的產物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質又可為細胞提供一定的能量和合成底物，可以說，自噬就是一個“備用倉庫”。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就會餓死。更重要的是，自噬活性可在代謝應激（饑餓、生長因子缺乏、射線、化療等）時大大增強 ，表現(xiàn)為胞漿中迅速涌現(xiàn)大量自噬體，這一現(xiàn)象被稱為“自噬潮”（autophagic flux），廣泛用于自噬形成的監(jiān)測。自噬潮為細胞度過危機提供了緊急的營養(yǎng)和能量支持，有利于細胞的存活。,精選,自噬可為腫瘤細胞帶來幾大好處,1）腫瘤細胞本身就具有高代謝的特點，對營養(yǎng)和能