1、基因工程,只 有 想 不 到 的,沒 有 辦 不 到 的,基因工程不是發(fā)現(xiàn)，而是創(chuàng)造。,第一節(jié) 基因工程概述,基因工程又稱為重組DNA技術(shù)，指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞并使重組基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)。,基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。,DNA重組技術(shù),生物體外,基因,DNA分子（基因）水平,人類需要的基因產(chǎn)物,剪切,拼接,導(dǎo)入,表達(dá),基因重組,基因工程的誕生和發(fā)展,證明DNA是遺傳物質(zhì),

2、發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),破譯遺傳密碼,限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),DNA連接酶的發(fā)現(xiàn),逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒等載體的發(fā)現(xiàn),基因工程 的誕生,1944，艾弗里,1953，沃森和克里克,1963，尼倫貝格,1970，阿爾伯、內(nèi)森斯、史密斯,基因工程的誕生,1973年，美國科學(xué)家科恩（S.N.Cohen）等將兩種不同來源的DNA分子進(jìn)行體外重組,并首次實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá),創(chuàng)立了定向改造生物的新技術(shù)基因工程。,1973年，科恩和博耶將兩個不同的質(zhì)粒（一個是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌，當(dāng)該重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種

3、大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。,培養(yǎng)平皿,大腸桿菌,基因工程大事記,1973年，體外重組的基因首次實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的表達(dá) 1977年，生長激素抑制素在大腸桿菌中成功表達(dá) 1978年，人胰島素在大腸桿菌中成功合成 1979年，人生長激素在大腸桿菌中得以表達(dá) 1980年，人干擾素在大腸桿菌中成功表達(dá) 1982年，巨型小鼠培育成功,巨型小鼠和熒光小鼠分別植入了“大鼠生長激素基因”和“水母熒光基因”。,基因工程的實(shí)施至少要有四個必要條件,供體基因,受體細(xì)胞,載體,工具酶,基因工程的工具酶與載體,分子手術(shù)刀限制性核酸內(nèi)切酶。 分子針線（分子縫合針） DNA連接酶。 基因的運(yùn)輸工具（分子運(yùn)輸車）載體。,

4、限制性核酸內(nèi)切酶,限制性內(nèi)切酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。,即每種限制性內(nèi)切酶只能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)上切割DNA分子。,特點(diǎn)：,特異性。,舉例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶,限制性內(nèi)切酶作用示意圖,磷酸二酯鍵,平(口)末端,回文序列,要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？,要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？,會產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分

5、子了。,A A T G A A T T C G A T G A T T C C G T A A T G A A T T C G A,T T A C T T A A G C T A C T A A G G C A T T A C T T A A G G C,DNA連接酶（DNA ligase）,連接的部位：,用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要連接幾個磷酸二酯鍵？,磷酸二酯鍵，不是氫鍵。,磷酸二酯鍵,連接酶的種類,E.coli DNA 連接酶 T4 DNA 連接酶,30,外源基因(如大鼠生長激素基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如小鼠受精卵)？,導(dǎo)入過程需要運(yùn)輸工具載體。,載體的作用有哪些？,作用一

6、：作為運(yùn)載工具，將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。 作用二：利用載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對外源基因進(jìn)行大量復(fù)制。,作為載體必須具備哪些條件？,1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。 2）具多個限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。 3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。 如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。,載體,常用的載體主要有兩類： 1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒 2）噬菌體或某些動植物病毒,質(zhì)粒的特點(diǎn),細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子； 質(zhì)粒是基因工程中最早應(yīng)用也是最常用的載體； 存在于許多細(xì)菌及酵母菌等生物中； 質(zhì)粒的存在對宿主細(xì)胞的生存無影響； 質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。,最常用的質(zhì)粒

7、是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素等標(biāo)記基因。,最簡單的質(zhì)粒載體必需包括3部分： 復(fù)制區(qū)（含復(fù)制原點(diǎn)） 目的基因插入點(diǎn) 遺傳標(biāo)記基因,1.下列有關(guān)基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述， 錯誤的是 （ ） A.一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫 氧核苷酸序列 B.限制性核酸內(nèi)切酶的活性受溫度的影響 C.限制性核酸內(nèi)切酶能識別和切割RNA D.限制性核酸內(nèi)切酶可從原核生物中提取,C,反饋練習(xí),2.下列關(guān)于DNA連接酶作用的敘述，正確的是（ ） A.將單個核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯鍵 B.將斷開的兩個DNA片段的骨架連接起來，重新形成磷酸二酯鍵 C.連接兩條DNA鏈上堿基

8、之間的氫鍵 D.只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來，而不能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接,B,3.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對應(yīng) 的內(nèi)容，正確的組合是 （ ）,C,4,5,42,基因工程的一般步驟,獲得目的基因（目的基因的獲?。?制備重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建） 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 (將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞) 外源基因陽性克隆的鑒定和篩選 （篩選出獲得目的基因的受體細(xì)胞、培養(yǎng)重組細(xì)胞） 5. 目的基因的表達(dá)（目的基因的檢測和鑒定）,第一步：獲取目的基因,方法：,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱

9、為基因文庫（gene library）,基因組文庫 cDNA文庫,1.從基因文庫中獲取目的基因。,基因文庫的構(gòu)建模式圖,通過對 受體菌的 培養(yǎng)而 儲存基因,2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,PCR（polymerase chain reaction）:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).是以DNA變性、復(fù)制的某些特性為原理設(shè)計的.1988，K.Mulllis莫里斯發(fā)明。 前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設(shè)計引物。,3.通過化學(xué)方法直接人工合成,高溫變性,低溫退火(復(fù)性),中溫延伸,第二步： 制備重組DNA分子 （基因表達(dá)載體的構(gòu)建）,核心,限制性核酸內(nèi)切酶,需要哪兩種工具？,DNA連接酶,總結(jié)：表達(dá)載體需

10、由哪幾部分組成,復(fù)制原點(diǎn) 啟動子 目的基因 終止子 標(biāo)記基因,第三步：轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 （將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞）,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為轉(zhuǎn)化（ruansformation）,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖,普通番茄為什么不耐貯藏？ 說出抗軟化番茄的培育過程。,將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞的方法,顯微注射法,1982年，美國，帕米特（R.Palmiter）超級小鼠,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞方法,宿主細(xì)胞（大腸桿菌）,感受態(tài)細(xì)胞（大

11、腸桿菌）,Ca2+,基因工程中常用的宿主細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及哺乳動物細(xì)胞等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,擴(kuò)增,第四步：目的基因的檢測與鑒定,首先： 其次： 最后： 還要：,要檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入目的基因,DNA分子雜交技術(shù) 分子探針,檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA,檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì),個體生物學(xué)水平的鑒定,DNA分子雜交技術(shù),基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。 滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測出來的標(biāo)記物。,基因探針的標(biāo)記和工作程序

12、作為探針的核酸樣品必須進(jìn)行標(biāo)記才能被檢測。常用放射性同位素有32P、5S、125I及3H等標(biāo)記。 標(biāo)記好的探針即可用于和待測樣品DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后通過放射自顯影來檢測。,第五步：目的基因的表達(dá),使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。,1.下列有關(guān)基因工程技術(shù)的敘述，正確的是（ ） A.重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制性核酸內(nèi)切 酶、連接酶和載體 B.所有的限制性核酸內(nèi)切酶都只能識別同一種特 定的核苷酸序列 C.選用細(xì)菌作為重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞是因?yàn)榧?xì)菌 繁殖快 D.只要目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞就能實(shí)現(xiàn)表達(dá),反饋練習(xí),2,3（2010江蘇高考，27題，8分）下表中列出了幾種限制酶識

13、別序列及其切割位點(diǎn)，圖l、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請回答下列問題：,（1）一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma 切割前后，分別含有 個游離的磷酸基團(tuán)。,0、2,（2）若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的Sma酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越 。 （3）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Sma切割，原因是 。 （4）與只使用EcoR I相比較，使用BamH 和Hind 兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止 。 （5）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入 酶。 （6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了 。 （7）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋

14、白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達(dá)的初步檢測。,高,Sma破壞質(zhì)粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因,質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化,DNA連接,鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞,蔗糖為唯一含碳營養(yǎng)物質(zhì),基因工程的應(yīng)用 基因工程技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。,（1）在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 基因工程被用于大量生產(chǎn)過去難以得到或幾乎不可能得到的蛋白質(zhì)肽類藥物。,基因工程疫苗 乙型肝炎是危害我國人民健康的嚴(yán)重疾病，我國乙肝病毒攜帶者1億 1千萬人，其中40左右的慢性肝炎可能發(fā)展成為肝硬化和原發(fā)肝癌。以往乙肝疫苗是

15、從人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不僅有巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而且有巨大的社會效益?；蚬こ桃腋我呙缡俏覈脚鷾?zhǔn)投放市場的第一種高技術(shù)疫苗，在20多項指標(biāo)上達(dá)到國際先進(jìn)水平，獲國家科技進(jìn)步一等獎。繼乙肝疫苗之后，我國又研制成功了痢疾、霍亂等數(shù)種基因工程疫苗，并經(jīng)國家批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。,基因工程藥物 干擾素是一種廣譜的抗病毒和抗腫瘤高技術(shù)藥物，對防治病毒性肝炎和惡性腫瘤有重要的作用。現(xiàn)已有了3個品種的基因工程干擾素獲得國家新藥證書，開始大批量生產(chǎn)。除此之外，我 國還研制成功了肝癌導(dǎo)向藥物（生物炸彈）、系列惡性腫瘤輔助治療藥物等十余種基因工程藥物，有些已獲試生產(chǎn)文號或進(jìn)入中試開發(fā)階段。,胰島

16、素,1000 磅牛胰 10 克胰島素,200 升發(fā)酵液 10 克胰島素,干擾素,1200 升人血 1 升發(fā)酵液,23 萬美元 / 病人 200300 美元 / 病人,用于提高奶酪產(chǎn)量 生產(chǎn)奶酪的凝乳酶傳統(tǒng)上來自哺乳小牛的胃。現(xiàn)在可以通過基因工程辦法，用酵母生產(chǎn)凝乳酶，大量用于奶酪制造。,哺乳小牛 凝乳酶基因,胃 轉(zhuǎn)入啤酒酵母,凝乳酶 凝乳酶,制造奶酪,（2）轉(zhuǎn)基因動物和植物 轉(zhuǎn)基因動物首先在小鼠獲得成功。現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已用于牛、羊，使得從 牛/羊 奶中可以生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物。稱為“乳腺反應(yīng)器”工程。 轉(zhuǎn)基因植物亦已在大田中廣為播,把大鼠生長因子轉(zhuǎn)入小鼠,得到巨大型的轉(zhuǎn)基因小鼠。,核移植，就是利

17、用一個動物體細(xì)胞的細(xì)胞核（供體核）來取代受精或未受精卵中的細(xì)胞核，形成一個重建的“合子”。 克隆原意是無性繁殖。克隆動物就是不經(jīng)過生殖細(xì)胞的受精過程而直接由體細(xì)胞獲得新的動物個體，這個新個體是原核供體動物的拷貝。 多莉(Dolly)：1996.7.52003.2.14,277次乳腺細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)；獲得29個發(fā)育為8細(xì)胞的“胚”；13頭代孕母親； 1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。,幾點(diǎn)說明,任何一個高等動物的細(xì)胞或個體都有兩套獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)：細(xì)胞核遺傳系統(tǒng)和細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)（線粒體和葉綠體DNA）。 細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)與細(xì)胞核遺傳系統(tǒng)有著密切的關(guān)系，但線粒體和葉綠體DNA上的基因是

18、細(xì)胞核的染色體上所沒有的，因此，細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)的功能不能由細(xì)胞核遺傳系統(tǒng)來代行。 由于動物的精子不為后代提供細(xì)胞質(zhì)，所以高等動物的線粒體是通過母系的細(xì)胞質(zhì)來遺傳的，即其后代的所有線粒體都來自于母親，與父親無關(guān)。,（1）多莉并不是與母體完全一樣的克隆,多莉的細(xì)胞核來自芬蘭白面母羊，但線粒體DNA分析確認(rèn)其線粒體來自蘇格蘭黑面母羊，由于線粒體在細(xì)胞生命活動中具有極其重要的功能，與許多生理活動密切相關(guān)，因此多莉在生理上與其母體也會有明顯的差異。 多莉的誕生顯示了用生物技術(shù)復(fù)制與母體完全一樣個體的可能性：如果受體細(xì)胞的去核卵與體細(xì)胞是來自于同一個體，則所得復(fù)制體的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核里的基因都與母體是完全一

19、樣的，這樣的克隆才是母體真實(shí)的復(fù)制品。 女性有可能用自身的體細(xì)胞和去核卵細(xì)胞克隆出與自己遺傳組成和生理特征完全一樣的個體；而克隆技術(shù)不可能用男性的體細(xì)胞復(fù)制出與原來個體在遺傳上完全相同的克隆。,動物克隆和轉(zhuǎn)基因研究 在“神舟”五號成功著陸的同一天，包括兩頭轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛在內(nèi)的10頭體細(xì)胞克隆牛現(xiàn)身山東梁山縣。我國轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)及體細(xì)胞克隆技術(shù)的研究與應(yīng)用達(dá)到國際前沿水平。 體細(xì)胞克隆?！皹吠蕖保捎诔晒Φ剞D(zhuǎn)入了綠色熒光蛋白基因，成為我國首例轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛，標(biāo)志著我國在轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)方面的新突破。,轉(zhuǎn)基因植物獲得新的性狀,轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)品市場銷售額：（世界市場） 1995年

20、0.75億美元 1998年 15億美元（4年增長20倍） 2000年 30億美元 2010年 將達(dá)到200億美元,中國已經(jīng)批準(zhǔn)進(jìn)入大田的轉(zhuǎn)基因植物,馬鈴薯：抗病毒、抗逆、高營養(yǎng)品質(zhì) 水稻：抗病毒、抗蟲、抗除草劑 棉花：抗蟲 玉米：抗蟲 大豆：抗除草劑 小麥：抗除草劑、高營養(yǎng)品質(zhì) 番茄：抗病、耐儲存 甜椒：抗病,辣椒：抗病毒 煙草：抗病毒、抗蟲 番木瓜：抗病毒 矮牽牛：改變花色 楊樹：抗蟲 微生物：提高固氮效率,我國基因工程部分研究進(jìn)展,轉(zhuǎn)基因抗病蟲植物 我國科學(xué)家將抗蟲基因?qū)朊藁?，獲得了抗蟲植株，對棉蛉蟲的抗蟲效果十分顯著?？裹S矮病、赤霉病、白粉病轉(zhuǎn)基因小麥和抗青枯病馬鈴薯也已研究成功，開始田間加代繁殖。,生產(chǎn)部件,（3）工程菌在環(huán)境工程中應(yīng)用 美國 GE 公司構(gòu)造成功具有巨大烴類分解能力的工程菌，并獲專利，用于清除石油污染。,噴灑工程菌清除石油污染,無冰晶細(xì)菌幫助草莓抗霜凍,（4）工業(yè)領(lǐng)域,環(huán)保工業(yè) 能降解工業(yè)廢品、農(nóng)藥殘留等基因工程菌的構(gòu)建 酶制劑工業(yè) 耐熱、耐壓、耐鹽、耐溶劑的酶基因轉(zhuǎn)化構(gòu)建的工程菌 食品工業(yè) 改善食品品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因作物 化學(xué)與能源工業(yè) 生產(chǎn)乙醇、甘油、丙酮等的轉(zhuǎn)基因生物,