1、潘建平 教授浙大醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系,細胞培養(yǎng)（一）,潘建平： 辦公室: 醫(yī)學(xué)院科研樓C801室 辦公室電話: 88206896 實驗室：科研樓C805807室 Email: ,參考書,司徒鎮(zhèn)強、吳軍正. 細胞培養(yǎng). 世界圖書出版公司，2007 鄂征. 組織培養(yǎng)和分子細胞學(xué)技術(shù). 北京出版社，2001 程寶鸞. 動物細胞培養(yǎng)技術(shù).中山大學(xué)出版社，2006,一、細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識二、細胞培養(yǎng)準備技術(shù)三、細胞培養(yǎng)基本技術(shù)四、細胞培養(yǎng)的污染及控制五、細胞培養(yǎng)常見問題解答,組織（細胞）培養(yǎng)發(fā)展史年鑒,1878 Claude Bernard: 證明一個器官的生理系統(tǒng)在個體死亡以后仍然可以人工維持。 1885

2、 Wilhelm Roux: 在一個生理溶液中維持一塊雞胚的活性并觀察其發(fā)育，從而證實該發(fā)育與雞胚的其他部分無關(guān)。,1887 Ross Harrison: 利用凝固的青蛙淋巴液作為培養(yǎng)基，在體外培養(yǎng)青蛙神經(jīng)嵴，維持其活性達數(shù)星期，并觀察到了神經(jīng)纖維的生長，從而解決了神經(jīng)纖維的來源問題。Ross Harrison被人稱為細胞培養(yǎng)之父。,1910 Burrows: 率先在血漿凝塊中長期培養(yǎng)雞胚細胞。 1911 Lewis: 以海水、血清、胚胎提取物、鹽和蛋白胨為原料配制成了第一個人工的細胞培養(yǎng)液，并觀察到了單層細胞的有限生長。 1916 Rous & Jones: 開創(chuàng)用胰酶來收獲貼壁生長的細胞。

3、 1923-1931 Carrel: 研制T型培養(yǎng)瓶大規(guī)模培養(yǎng)細胞。 1927 Carrel & Rivera: 制造了第一個病毒疫苗牛痘疫苗。,1933 Gey: 發(fā)明了轉(zhuǎn)管培養(yǎng)細胞的技術(shù)。 1948 Fisher: 研制成了第一個化學(xué)成分清楚的細胞培養(yǎng)液CMRL1006。 1952 Gey 和同事: 分離培養(yǎng)了HeLa細胞。 1952 Dulbecco: 發(fā)明了噬斑法，用長滿的單層細胞檢測病毒。,1954 Abercrombie: 觀察到了體外培養(yǎng)細胞接觸抑制的現(xiàn)象。 1961 Hatflick & Moorhead: 發(fā)現(xiàn)人成纖維細胞在一定的代數(shù)之后會死亡。 1965 Ham: 配制了第

4、一個無血清培養(yǎng)液。 1975 Khler & Milstein: 成功得到第一個用于單抗生產(chǎn)的雜交瘤細胞株。,一、細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(一)細胞培養(yǎng)的基本概念(二)細胞培養(yǎng)的應(yīng)用(三)體外培養(yǎng)細胞的種類(四)體外培養(yǎng)細胞的生長方式及類型(五)體外培養(yǎng)細胞的生長過程(六)體外培養(yǎng)細胞的生長條件,細胞培養(yǎng) 將組織塊用機械或消化的方法分散成單個細胞，用培養(yǎng)基制成單個細胞懸液，在體外適宜條件下進行培養(yǎng)生長。 細胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)主要不同點： - 原始培養(yǎng)的對象不同 細胞培養(yǎng)：單個細胞懸液 組織培養(yǎng)：組織塊（0.51 mm3）或薄片（厚 0.2 mm） 器官培養(yǎng)：器官原基/器官的一部分/整個器官,

5、(一) 細胞培養(yǎng)的基本概念,病毒學(xué)： 病毒分離培養(yǎng)及傳代；研究病毒細胞間相互作用；抗病毒藥物篩選 免疫學(xué)：單克隆抗體制備、免疫機制研究等 遺傳學(xué)：研究基因功能；染色體基因圖譜 生物醫(yī)學(xué)工程：蛋白表達、抗體工程；藥物安全性研究；生物相容性研究 分子細胞生物學(xué)：基因功能研究；細胞生物學(xué)行為研究 腫瘤學(xué),(二) 細胞培養(yǎng)的應(yīng)用,(三)體外培養(yǎng)細胞的種類,初代培養(yǎng)物/原代培養(yǎng)物 細胞系（cell line） 細胞株（cell strain）,初代培養(yǎng)物/原代培養(yǎng)物 即從供體取得的組織細胞在體外進行培養(yǎng)后的首次培養(yǎng)物。 初代培養(yǎng)物一旦進行傳代培養(yǎng)后，就成為細胞系。 （傳代培養(yǎng)：指將細胞從一個培養(yǎng)容器移植

6、到另一個培養(yǎng)容器中培養(yǎng)）,2. 細胞系（cell line） 初代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細胞系。包括： - 有限細胞系（finite cell line） 生存期有限的細胞系。不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限 - 連續(xù)細胞系或無限細胞系（infinite cell line）,獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系。能連續(xù)傳代。 大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞系。 有的只有永生性，但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性。 有的既有永生性，又有異體接種致瘤性，說明已惡性化。,3. 細胞株（cell strain） 通過篩選或克隆化從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得

7、的具有特殊性質(zhì)或標志的細胞。這些特性（有一定的標記染色體、特殊的抗原性等）在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。包括： - 有限細胞株（finite cell line） 生存期有限的細胞株。不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限 - 連續(xù)細胞株或無限細胞株（infinite cell line） 已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞株。能連續(xù)傳代。 亞株（substrain） 由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群,二倍體細胞系或株 細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍體細胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細胞占75以上）的細胞群。在正常情況下具有限生命期，屬有限細胞系。 隨供體年齡和組織來源的不同，壽命長短各異。

8、- 人胚肺成纖維細胞可傳4060代 - 人胚腎只有810代 - 人胚神經(jīng)膠質(zhì)細胞1530代 為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或25代即大量凍存作為原種（stock cells），用時再進行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細胞的衰老。 假二倍體：僅數(shù)目相同，而核型不同，即染色體形態(tài)有改變者。,遺傳缺陷細胞系或株 從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養(yǎng)的細胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細胞，都屬遺傳缺陷細胞。這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。,腫瘤細胞系或株 是現(xiàn)有細胞系或細胞株中最多的一類，我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾

9、十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。,細胞系或細胞株的命名,HeLa： 為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）CHO： 中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary） 宮-743： 宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立；每3天傳代，每次接種3105 細胞毫升。,細胞系或株的鑒定、管理和使用,ATCC（American type culture collection）入庫細胞要求檢測項目如下：,培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細胞已傳代數(shù)等

10、 凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱 細胞活力：融解前后細胞接種存活率和生長特性 培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量,細胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細胞等，融解后細胞生長特性 核型：二倍體或多倍體，有無標記染色體 無污染檢測：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等 物種檢測：檢測同工酶，主要為G6PD和LDH，以證明細胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測 免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測 細胞建立者：建立者姓名，檢測者姓名,（四）體外培養(yǎng)細胞的生長方式及類型,體外培養(yǎng)細胞大多培養(yǎng)在瓶皿等容器中，根據(jù)它們是否能貼附在支持物上生長的特性，可分為： - 貼附生長型 - 懸浮生長型,貼附生長型

11、,必須貼附于支持物表面才能生長。大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞。 判斷細胞形態(tài)時不能按照體內(nèi)組織學(xué)標準判定，僅大致分成以下四型： 上皮細胞型 成纖維細胞型 游走細胞型 多型細胞型,1. 成纖維細胞型 胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維細胞類似時皆可稱之為成纖維細胞型。,名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的 來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維 細胞、心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮 形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細

12、胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則 三角形，胞質(zhì)向外伸出23個長短不等的突起， 中有卵圓形核 生長特點：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片， 細胞細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨 的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起,成纖維細胞,2. 上皮型細胞 細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。,名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全相同 來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細胞, 如： 皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤 形態(tài)：

13、類似體內(nèi)的上皮細胞，扁平、不規(guī)則多角形，中有圓 形核 生長特點：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀 生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動,上皮型細胞,3.游走細胞型 來源于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細胞，呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。 4.多型細胞型 有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。,懸浮型 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于少數(shù)特殊的細胞，如某些癌細胞和血液白細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。,概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

14、 或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 來源：自血、脾或骨髓，尤其是血中白細胞、癌腫細胞 特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團 優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)， 易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點：觀察不方便，很多細胞不能懸浮生長(尤其是正常 細胞),Hepatocytes,單個細胞生長過程：細胞周期 培養(yǎng)細胞一代生長過程：生長曲線 細胞系生長過程：培養(yǎng)細胞生命期,（五）體外培養(yǎng)細胞的生長過程,1. 單個細胞的生長過程細胞周期（cell cycle）一個母細胞分裂結(jié)束后的細胞至其再分裂形成兩個子細胞的這段時期，可分為間期和M（分裂期）兩個階段。 間期：細胞完成生長過程，D

15、NA合成 DNA合成前期：G1期 DNA合成期：S期 DNA合成后期：G2期 M期：細胞有絲分裂期 細胞周期間期(G1 期+S 期+G2 期)+M 期，可簡稱之為GSM 周期。,細胞周期時間（time of cell cycle, Tc） 完成一次細胞周期所需要的時間 Tc的長短與物種的細胞類型有關(guān)，不同類型細胞的G1長短不同，是造成Tc差異的主要原因 測定Tc的方法 標記有絲分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）,小鼠十二指腸上皮細胞 10小時 人類胃上皮細胞 24小時，骨髓細胞18小時 培養(yǎng)的人成纖維細胞 18小時，CHO細胞14小時，HeLa細胞21

16、小時,標記有絲分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）,原理：對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標記細胞，通過統(tǒng)計標記有絲分裂細胞百分數(shù)的辦法來測定細胞周期。,待測細胞經(jīng)3H-TdR標記后，所有S期細胞均被標記。 S期細胞經(jīng)G2期才進入M期，所以一段時間內(nèi)PLM=0。 開始出現(xiàn)標記M期細胞時，表示處于S期最后階段的細胞，已渡過G2期，所以從PLM=0到出現(xiàn)PLM的時間間隔為TG2。,S期細胞逐漸進入M期，PLM上升，到達到最高點的時候說明來自處于S最后階段的細胞，已完成M，進入G1期。所以從開始出現(xiàn)M到PLM達到最高點（100%）的時間

17、間隔就是TM。 當PLM開始下降時，表明處于S期最初階段的細胞也已進入M期，所以出現(xiàn)PLM到PLM又開始下降的一段時間等于TS。 從PLM出現(xiàn)到下一次PLM出現(xiàn)的時間間隔就等于Tc，根據(jù)Tc=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1長度。,事實上由于一個細胞群體中Tc和各時相不盡相同，第一個峰常達不到100%，以后的峰會發(fā)生衰減，PLM不一定會下降到零，所以實際測量時，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM。,細胞周期各階段的時間與PLM的關(guān)系,傳代：體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需

18、要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存。,2. 培養(yǎng)細胞一代生長過程生長曲線,細胞“一代”：指培養(yǎng)細胞從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為細胞培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（generation）或倍增（doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增36次。,培養(yǎng)細胞生長曲線,以貼附型細胞為例： （1）潛伏期（latent phase） 細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)

19、束。貼附于支持物后的細胞，經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。 各種細胞貼附速度不同，與細胞種類、培養(yǎng)基成分和底物理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細胞貼附慢，可長達1024小時或更多；連續(xù)細胞系和惡性腫瘤細胞系貼附快，1030分鐘即可貼附。,細胞處在潛伏期時，可有運動，基本無增殖，少見分裂相。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約2496小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅624小時；細胞接種密度大時潛伏期短。 當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入對數(shù)增生期。,（2）對數(shù)增生期（logarithmic growth phase） 是細胞增殖最旺盛的階段，細胞分裂相增多。對數(shù)增生期細胞分裂相

20、數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。 是細胞一代中活力最好的時期，因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。,接觸抑制 在接種細胞數(shù)量適宜情況下，對數(shù)增生期持續(xù)35天后，隨細胞數(shù)量不斷增多，生長空間漸趨減少，最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（contact inhibition）。 惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。,密度抑制 細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少

21、，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（density inhibition），導(dǎo)致細胞分裂停止。,判斷細胞生長的指標： 對數(shù)生長期內(nèi)細胞分裂活動的程度(增殖活性)可作為判斷細胞生長是否旺盛的重要指標 有絲分裂指數(shù)(MI) 細胞群體倍增時間 細胞增殖活性測定： MTT法 標記核苷酸(3H-TdR)摻入法,有絲分裂指數(shù)(MI),指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)1000個細胞。 一般細胞的MI約為0.10.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞高，可達3%5%。,操作步驟 消化細胞，將細胞懸液接至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。

22、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，使細胞長在蓋片上。 取出蓋片，按下列順序操作： PBS漂洗3分鐘甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘Giemsa液染色10分鐘自來水沖洗。 蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。 計算： 分裂指數(shù)=分裂細胞數(shù)/總細胞數(shù)100%,細胞群體倍增時間,培養(yǎng)物中細胞數(shù)量翻倍的平均時間 公式 TtLog2/Log(N/No) t：從接種到測細胞數(shù)的時間 N：時刻t測定的細胞數(shù) No：接種的細胞數(shù),MTT法,反映細胞內(nèi)一種酶活性程度 MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下，生成藍色的formazan結(jié)晶，fo

23、rmazan結(jié)晶的生成量僅與活細胞數(shù)目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。 還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標儀測定570 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。,標記核苷酸(3H-TdR)摻入法：反映DNA,3H-TdR uptake (cpm),（3）停滯期（stagnate phase） 細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期（plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸

24、趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。 此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳12兩代，通過換液淘汰死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復(fù)后，才能再用。,指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間 人胚二倍體成纖維細胞培養(yǎng)，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳3050代，相當于150300個細胞增殖周期，能維待一年左右的生存時間，最后衰老凋亡 如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；如培養(yǎng)的為其它細胞如肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代

25、只有當細胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時，細胞的生存期才可能發(fā)生改變 正常細胞培養(yǎng)時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致經(jīng)歷以下三個階段：原代培養(yǎng)期、 傳代期、衰退期,3. 細胞系的生長過程培養(yǎng)細胞生命期,（1）原代培養(yǎng)期從體內(nèi)取出組織細胞接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)14周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大，多呈二倍體核型，是檢測藥物很好的實驗對象。 細胞群是異質(zhì)的，細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞克隆形成率（cloning efficiency）很低，即細胞獨立生存性差?？寺⌒纬陕始醇毎罕幌♂尫稚⒊蓡蝹€細胞進行培養(yǎng)時，形成細胞小群（克?。┑陌俜謹?shù)。,（2）傳代期初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱為細胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細