1、一、微小核糖核酸的引入微小核糖核酸是一種1928nt的調(diào)節(jié)性核糖核酸分子，主要包括微小核糖核酸(MicroRNA)和小干擾核糖核酸(siRNA)。其中，微小核糖核酸已成為繼小核糖核酸之后的新的研究熱點之一，在2002年和2003年的十大科學(xué)成就中名列前茅。微小核糖核酸是長核糖核酸序列的一部分，長核糖核酸序列是一種相對較短的單鏈小核糖核酸，類似于小核糖核酸。它通常來源于染色體的非編碼區(qū)，由大小約為70 nt的發(fā)夾狀前體加工而成。它與其靶基因分子的3-非翻譯區(qū)(3 UTR)互補，導(dǎo)致其翻譯受到抑制。mirbase (/)中有來自不同物種的1W以上的miRN

2、A序列。一種檢測微小核糖核酸的方法要了解微小核糖核酸在基因調(diào)控中的作用，一個關(guān)鍵的方法是快速準確地檢測微小核糖核酸的基因表達。因此，檢測微小核糖核酸的表達水平已經(jīng)成為科學(xué)家們研究的熱點。然而，由于小核糖核酸是一種小分子，一些小核糖核酸的表達水平可能很低，因此需要極其靈敏的定量分析工具。常用的檢測方法有：1.1北方印跡1.2基于該方法的核糖核酸酶保護分析和液相雜交。1.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)也用于檢測微小核糖核酸前體的表達水平?；诰酆厦告湻磻?yīng)技術(shù)檢測微小核糖核酸的其他方法包括：引物延伸法，在引物的5-末端添加特異性標(biāo)記，定量測定低豐度核糖核酸的含量；原位雜交(CISH，熒光原位雜交)可以方便地檢

3、測微小核糖核酸的時空表達差異。1.4微陣列技術(shù)46，47是研究miRNA表達的快速方法。二、逆轉(zhuǎn)錄引物的分類和設(shè)計原則實時聚合酶鏈反應(yīng)克服了短miRNA分子(22 nt)帶來的最大定量問題，引入了靶向特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，可與成熟miRNA結(jié)合形成逆轉(zhuǎn)錄引物/成熟miRNA復(fù)合物，并在miRNA的5端延伸。這樣，獲得了一個長的逆轉(zhuǎn)錄擴增因子，為進一步的實時定量聚合酶鏈反應(yīng)提供了一個滿意的模板。有兩種類型的逆轉(zhuǎn)錄引物：1.寡核苷酸特異性逆轉(zhuǎn)錄引物(主要是QIAGEN產(chǎn)物)它由特定序列(t) 20左右的附加堿基v或VN組成。(所有的微小核糖核酸可以共享一個寡核苷酸逆轉(zhuǎn)錄引物，但是核糖核酸需要在逆轉(zhuǎn)錄前

4、被聚腺苷酸終止)2.具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物(主要是ABI產(chǎn)品)它由一個特定的序列組成，該序列可以是環(huán)莖形的6-8個末端反向互補堿基。(一個微小核糖核酸序列特異性地對應(yīng)于一個具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物)。3.引物探針設(shè)計因為反轉(zhuǎn)錄后獲得的基因是一個復(fù)雜的片段。上游引物可以在miRNA自身的序列上找到。如果氣相色譜含量太低，可以在上游引物的5端加入保護堿基，如氣相色譜。下游引物位于逆轉(zhuǎn)錄引物的反向互補序列中。也就是說，上游引物對每個微小核糖核酸都是唯一的，而下游引物是通用引物。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法包括SYBR綠色染料法和TaqMan探針法。前者需要調(diào)整引物濃度和引物擴增效率，并將引物二聚體

5、調(diào)整得盡可能??；探針規(guī)則要求設(shè)計熒光探針，其中推薦使用MGB探針(未做廣告)，因為其堿基數(shù)量少且特異性好。探針有三個設(shè)計位置：與微小核糖核酸序列完全相同，位于微小核糖核酸和逆轉(zhuǎn)錄引物的交叉點，完全位于逆轉(zhuǎn)錄引物上；其中，有兩種正負互補的情況。至于探頭應(yīng)該設(shè)計在哪里，根據(jù)我自己的測試情況，我認為效果差不多。四、測試操作流程1.核糖核酸提取在上述兩種逆轉(zhuǎn)錄引物中，Ologod(T)特異性引物所需的核糖核酸盡可能小，用專用試劑盒提取，而莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物需要常規(guī)的核糖核酸提取。此外，由于不同樣品的核糖核酸提取方法不完全相同，普通組織樣品和細胞可用三唑+氯仿研磨提??；血液和植物樣品需要預(yù)處理，然后用三唑+氯仿或特殊試劑盒提取。2.反轉(zhuǎn)錄已經(jīng)證實，當(dāng)使用寡核苷酸特異性逆轉(zhuǎn)錄引物時，核糖核酸應(yīng)該用3聚腺苷酸進行跟蹤。對逆轉(zhuǎn)錄酶沒有特殊要求，所以請遵循每種逆轉(zhuǎn)錄酶的說明。這里需要注意的是，逆轉(zhuǎn)錄中使用的逆轉(zhuǎn)錄引物(常規(guī)的是隨機引物、寡核苷酸和特異性引物)是上述的寡核苷酸特異性引物和莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，它們分別屬于寡核苷酸和特異性引物，在逆轉(zhuǎn)錄中不需要添加其他的逆轉(zhuǎn)錄引物。在確定逆