1、第二節(jié) 常見的酵母基因表達(dá)系統(tǒng),第八章 酵母基因工程,酵母菌表達(dá)載體,酵母基因表達(dá)宿主系統(tǒng),第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系,第四節(jié) 酵母基因工程應(yīng)用舉例-利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗,酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng),第三節(jié) 影響外源基因表達(dá)的因素,酵母菌的分類學(xué)特征,酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、半知菌類，共由56個屬和500多個種組成。,酵母菌是比較成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。,第一節(jié) 酵母基因表達(dá)體系 -宿主系統(tǒng),作為宿主細(xì)胞的酵母需滿足的基本要求,安全無毒，沒有致病性。 遺傳背景清楚，容易進(jìn)行遺傳操作。 外源DNA容易導(dǎo)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率高。

2、 培養(yǎng)條件簡單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵。 有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力。 有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工能力。,酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢,全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便,能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中,具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng),大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉,不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認(rèn)定,為安全的基因工程受體系統(tǒng),酵母菌是最簡單的真核模式生物,常用的酵母宿主菌,目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：,釀酒酵母屬 如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,克魯維酵亞母屬 如乳酸克魯維

3、酵母（Kluyveromyces lactis）,畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）,裂殖酵母屬 如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）,解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）,其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，,但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。,假絲酵母屬 產(chǎn)朊假絲酵母 (Candida utilis),酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇,釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油,醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng),酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源

4、蛋白獲得成功表達(dá)。,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得,有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能,大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來彌補(bǔ)。,乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源,蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也,乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng),能穩(wěn)定遺傳40代以上。,乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu),于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。,巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在甲醇培養(yǎng)基中生,巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),長，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)。,表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢： 生長迅速、強(qiáng)啟動子（

5、乙醇氧化酶基因AOX1） 、可誘導(dǎo)表達(dá),由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以,外源基因序列一般整合入受體的染色體DNA上。其外源基因,20余種具有經(jīng)濟(jì)價值的重組蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。,的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有,多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列,多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng),HARS已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體， HARS質(zhì)粒,能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上（可連續(xù)整合100多,目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該,個拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。,系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。,釀酒酵母中的2m環(huán)狀質(zhì)粒,

6、同源重組,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)50至100個。,IRs 反向重復(fù)序列，600 bp，重組,FLP 編碼產(chǎn)物驅(qū)動IRs的同源重組,REP 編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性,STB REP的結(jié)合位點(diǎn),接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及,克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質(zhì),粒類似。,第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系-載體,第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系-載體,酵母質(zhì)粒載體既可以在大腸桿菌復(fù)制與擴(kuò)增、又可以在酵母系統(tǒng)中復(fù)制與擴(kuò)增，故此類載體又稱為穿梭載體（shuttle vector）。 酵母菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體是由來自酵母的部分核酸序

7、列和細(xì)菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，這兩個部分主要是作為在大腸桿菌宿主時增殖和篩選組分。酵母部分包括酵母轉(zhuǎn)化子的篩選組分，主要是與宿主互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及編碼特定蛋白的基因啟動子和終止子序列。,第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系 -載體,1酵母載體的基本結(jié)構(gòu),DNA復(fù)制起始區(qū)：2質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)及酵母基因組的 自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence，ARS）,篩選標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型篩選或者抗

8、性篩選,整合介導(dǎo)區(qū),有絲分裂穩(wěn)定區(qū),表達(dá)盒：,啟動子 ，基因（分泌信號序列 ），終止子,2 酵母載體的種類,酵母整合型質(zhì)粒YIp： 缺乏酵母的復(fù)制起始位點(diǎn)，不能在酵母中自主復(fù)制，含有酵母的篩選標(biāo)記ura3基因。具有整合介導(dǎo)區(qū)， 所以，它只有整合到酵母染色體中才能穩(wěn)定(a)。,酵母克隆表達(dá)載體根據(jù)其在酵母中復(fù)制形式來分類。分為下列五類 ：,酵母載體按照用途不同可分為克隆載體和表達(dá)載體兩類,含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建,在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母

9、菌特定的染色體DNA區(qū)域。,酵母附加體質(zhì)粒YEp：含有釀酒酵母2m質(zhì)粒DNA復(fù)制有關(guān)的序列，該載體在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定，拷貝數(shù)可達(dá)60-100。轉(zhuǎn)化效率高（b）。,酵母復(fù)制型質(zhì)粒YRp：含有來源于酵母的DNA復(fù)制起始區(qū)(ARS)，能在酵母染色體外自主復(fù)制的一種自主復(fù)制型載體，雖然其轉(zhuǎn)化效率高，在宿主的拷貝數(shù)可以達(dá)上百個（c）。,ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8-1.5kb，,染色體上每30-40 kb就有一個ARS元件。,以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp,上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個，,以2m質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YEp,但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-

10、70%，主要是由于 分配不均勻所致。,2 酵母載體的種類,酵母著絲粒質(zhì)粒YCp：含有酵母染色體著絲粒的DNA片段，這種載體在細(xì)胞分裂過程中，在母細(xì)胞和子細(xì)胞之間平均分配，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性(d)。 CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列,將CEN DNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp .YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1 - 5個。,酵母人工染色體YAC：酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。 YAC具有自主復(fù)制序列（ARS）、著絲粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)

11、菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。 YAC載體在宿主細(xì)胞中以線性雙鏈DNA存在，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn)?？山邮?00-1000kb的外源DNA片段。,主要結(jié)構(gòu)： 兩個可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； 酵母菌著絲粒序列 (centromere4,CEN4)； 一個自主復(fù)制序列(ARS1)； 兩個來自嗜熱四膜蟲 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重復(fù)序列(TEL)，以保持重組YAC為線狀結(jié)構(gòu)； 在兩個末端序列中間，有一段填充序列(stuff, HIS3)，以便pYAC4在細(xì)菌細(xì)胞中穩(wěn)定擴(kuò)增； Ampr抗性及細(xì)菌質(zhì)

12、粒復(fù)制原點(diǎn)； 一個EcoR克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于酵母菌Sup4 tRNA基因內(nèi)。,酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng),酵母菌的轉(zhuǎn)化方法,用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因,酵母菌轉(zhuǎn)化方法,原生質(zhì)球法：酶解酵母細(xì)胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，原生質(zhì)體在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允許DNA進(jìn)入，然后使原生質(zhì)球再生新的細(xì)胞壁?？梢詫?shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。,Li+鹽轉(zhuǎn)化方法 ：釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）處理后，在PEG存在下和熱休克之后可高效吸收質(zhì)粒DNA。醋酸鋰對釀酒酵母有效，對畢赤酵母無效，畢赤酵母轉(zhuǎn)化一般用氯化鋰有效,優(yōu)點(diǎn)：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA（相差80倍）,酵母菌

13、轉(zhuǎn)化方法,電擊轉(zhuǎn)化法：原理是通過利用高壓電脈沖作用，造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，形成可逆的瞬間通道，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)胞，也有利于外源DNA等大分子進(jìn)入 優(yōu)點(diǎn)：不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件；適用范圍廣；轉(zhuǎn)化率高（達(dá)105 / mg DNA）。,PEG轉(zhuǎn)化法：PEG 1000,酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化特點(diǎn),單、雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化，但單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10-30倍,單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制（含有復(fù)制子）或,同源整合入染色體（不含復(fù)制子）,克隆在YIp上的外源基因，會發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50-80%,用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因,營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核

14、苷酸生物合成基因，如：,LEU、TRP、HIS、LYS、URA 等,但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難,營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因,用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因,其編碼產(chǎn)物只要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白,顯性標(biāo)記基因,aph 氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶 抗G418,cat 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 抗氯霉素,dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1 銅離子螯合物 耐受銅離子,suc2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 耐受高濃度蔗糖,ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑,標(biāo)記基因,編碼產(chǎn)物,遺傳表型,第二節(jié) 常見的酵母基因表達(dá)系統(tǒng),一、 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng),1，啟動子,組成型表達(dá)的啟動子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）啟動子

15、、甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH或GAPl）啟動子,可控性啟動子：半乳糖啟動子（GAL）、酸性磷酸酶啟動子（PHO）、乙醇脫氫酶（ADH2）啟動子、Cu2+螯合蛋白啟動子（CUPI）以及交配a型阻遏系統(tǒng)（MATa/a）,酵母菌啟動子的可控性,pho4TS-PHO5啟動子：,釀酒酵母PHO5啟動子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開,PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動子的正調(diào)控因子,因此，裝在pho4TS-PHO5啟動子下游的外源基因在35時關(guān)閉,23誘導(dǎo)表達(dá),溫度控制型啟動子,PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在35時失活,酵母菌啟動子的可控性,a a 型啟動子,釀酒酵母有a和a兩種

16、單倍體，分別由MATa和MATa兩個等位基因決定。 a1因子決定a細(xì)胞特征表達(dá)a2因子阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)a1-a2阻遏a細(xì)胞特征表達(dá) 編碼a2因子的基因突變型hmla2-102能產(chǎn)生a2變體，它能滅活a1，同時阻遏a型,溫度控制型啟動子,a 型啟動子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型啟動子,受體細(xì)胞基因組 重組質(zhì)粒,a 型啟動子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型啟動子,a2,a1,25,35,（）,酵母菌啟動子的可控性,釀酒酵母,超誘導(dǎo)型啟動子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,基因基底水平表達(dá),GAL1,GA

17、L7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖誘導(dǎo)時，GAL4高效表達(dá)，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達(dá),GAL10,Promoter,的半乳糖,利用酶系,由GAL1,GAL7和,GAL10,基因編碼,雜合啟動子：將釀酒酵母的乙醇脫氫酶基因（ADH2）所屬啟動子的上游調(diào)控區(qū)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）所屬啟動子的下游基本區(qū)重組在一起，構(gòu)建出ADH2-GADPH型雜合啟動子,釀酒酵母表達(dá)載體,目前已建立的釀酒酵母表達(dá)載體有（1）酵母附加體質(zhì)粒(YEp) （見右圖）；（2）酵母復(fù)制型質(zhì)粒(YRp)；（3）酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp) ；（4）酵母整合型質(zhì)粒 (YIp)；（

18、5）酵母人工染色體(YAC)。前三類統(tǒng)稱為游離自主復(fù)制型質(zhì)粒載體。含有來自酵母基因組的復(fù)制起始區(qū)ARS或者酵母天然質(zhì)粒2m復(fù)制起點(diǎn)序列，能夠自主復(fù)制，通常為多拷貝數(shù),釀酒酵母宿主,有些蛋白酶缺陷有利于重組異源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。如pep4-3突變株中蛋白酶的活性顯著降低，對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的降解作用較小。,提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌,能導(dǎo)致釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量提高或質(zhì)量改善的突變類型,ssc1 改善重組蛋白分泌 鈣離子依賴型的ATP酶,ssc2 提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄后加工,rgr 1 提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平,ose1 提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平,ssc11 改善重組蛋白分泌 羧肽酶Y

19、,rho- 提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平,突變類型,生物效應(yīng),作用位點(diǎn),釀酒酵母宿主,為了減少目的蛋白的過度糖基化，目前已從野生型的釀酒酵母中分離出許多類型的糖基化途徑突變株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突變株、天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷的alg突變株以及外側(cè)糖鏈缺陷型的och突變株等。在這些突變株中，具有重要實(shí)用價值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因?yàn)樗鼈儾荒茉诋愒吹鞍椎奶扉T冬酰胺側(cè)鏈上延長甘露多聚糖長鏈。,抑制超糖基化作用的突變宿主菌,能抑制超糖基化的突變類型,mnn 甘露糖生物合成缺陷型,alg 天冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型,och 外側(cè)糖鏈添加缺陷型,突變類型,生物效應(yīng),

20、許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，,它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側(cè)糖,鏈兩部分組成。,酵母菌普遍擁有蛋白,質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生,型釀酒酵母對異源蛋白的,糖基化反應(yīng)很難控制，呈,超糖基化傾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要。,減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌,泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用,蛋白酶體,Lys,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌,酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因,酵母菌有四個泛素

21、編碼基因：,UBI 1 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對數(shù)生長期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉,UBI 2 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對數(shù)生長期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉,UBI 3 編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 對數(shù)生長期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉,UBI 4 編碼泛素五聚體 對數(shù)生長期關(guān)閉 穩(wěn)定期表達(dá),酵母菌有七個泛素連接酶基因：,UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7,減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌,泛素降解途徑衰減的釀酒酵母,釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表達(dá)，UBI 4-突變株能,UBI 4缺陷型： 外源基因表達(dá)理想的

22、受體,正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，,UBA 1缺陷型：減少蛋白降解,UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位,基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解,Ubc4 - ubc5 雙突變型： 減少蛋白降解,七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效,二、畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng),1. 啟動子,（1） AOX1和AOX2啟動子,（2）三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldeyde 3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH）啟動子,（3）甲醛脫氫酶（formaldehyde dehyd

23、rogenase, FLD）啟動子,2 畢赤酵母表達(dá)載體類型,胞內(nèi)表達(dá)載體pPICZ A,B,C,分泌型表達(dá)載體pPICZa A,B,C,畢赤酵母表達(dá)載體上無酵母復(fù)制起點(diǎn)，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重組整合入酵母染色體DNA中，并隨酵母的生長傳代穩(wěn)定地存在。整合的方式可以是單交換插入，亦可雙交換插入，一般來說前一種方式更容易發(fā)生 。,3 載體的整合方式,依據(jù)具體整合位點(diǎn)及相應(yīng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子的類型可分為三種情況：,5 AOX1和3 AOX1與染色體發(fā)生同源重組，使受體染色體帶有一個拷貝的外源基因。這種情況有功能的AOX1基因被替換而丟失后，只能利用弱的AOX2基因啟動合成AOX，就產(chǎn)生

24、His+MutS表型(methanol utilization slow)，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長緩慢。此時，甲醇利用率很低，但它表達(dá)外源基因的效率高,染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發(fā)生置換，使得一個或多個表達(dá)單位插入在his4位點(diǎn)，產(chǎn)生的表型也是His+ Mut+,染色體AOX1區(qū)與載體質(zhì)粒的AOX1區(qū)發(fā)生單位點(diǎn)互交換，外源基因的表達(dá)單位插入在基因區(qū)AOX1基因的上游或下游，這一過程可重復(fù)發(fā)生，使得更多拷貝的表達(dá)單位插入基因組中。這種情況AOX1基因仍然有活性，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長正常，產(chǎn)生的表型是His+Mut+。,在畢赤酵母中有3種方法可以得到多拷貝表達(dá)菌株。 第一種方法直接構(gòu)

25、建含高拷貝外源基因的表達(dá)載體，在體外利用同尾酶向載體中多次插入首尾相連的表達(dá)盒。此法的優(yōu)點(diǎn)是一次整合，即可有多個表達(dá)盒插入染色體。但體外基因操作較繁瑣。 第二種方法是利用含有kanr基因的載體。細(xì)菌來源的卡那霉素抗性基因在酵母中賦予宿主抵抗真核抗生素G418。G418的抗性水平大致與載體的拷貝數(shù)相關(guān)。提高抗生素G418的濃度可以得到含高拷貝表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株。 第三種方法是用含有Zeocin抗性標(biāo)記基因Sh ble的載體來構(gòu)建多拷貝菌株。來源于細(xì)菌的Sh ble在酵母中賦予宿主對抗生素zeocin的抵抗能力，通過提高zeocin濃度可篩選出含高拷貝表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株。然而與G418篩選相似，大

26、多數(shù)能抵抗高水平 zeocin 的轉(zhuǎn)化子并不含有多載體拷貝。,4 宿 主,常用的畢赤酵母受體菌株有：組氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16， 其中SMD1168為蛋白酶缺陷型，以其作為宿主表達(dá)蛋白可以降低表達(dá)產(chǎn)物的降解。這些表達(dá)宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生來的。最常用的受體菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一個組氨醇脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含His4 的載體而具有 His+表型來篩選轉(zhuǎn)化子。 根據(jù)對甲醇利用的情況，畢赤酵母可劃分為三種表型。菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長速率與野生型類似，稱為

27、甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；當(dāng)AOX1被其他基因取代，則需依賴AOX2，但其甲醛代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。當(dāng)AOX基因全部缺失，則不能利用甲醇，稱為甲醇利用負(fù)表型（Mut-），如MC100-3。后兩者胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白質(zhì)有時優(yōu)于野生株，且需甲醇較少。 此外為增加分泌蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4, prb1)。,第三節(jié) 影響外源基因表達(dá)的因素,外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度,優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA的二級結(jié)構(gòu)，提高外源基因mRNA的翻譯活性,酵母菌對密碼子的偏愛性,在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘

28、油醛-3-磷酸脫氫酶,GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%,以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的,一、轉(zhuǎn)錄水平控制,二、表達(dá)載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性,三、其他因素,優(yōu)化工程菌發(fā)酵工藝,避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的降解，選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主,第三節(jié) 影響外源基因表達(dá)的因素,利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗,第四節(jié) 酵母基因工程應(yīng)用實(shí)例,由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重,的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其,中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒,還沒有一種有效的治療藥物

29、，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對預(yù)防病毒,感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其,廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。,利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗,產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母,乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母,乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒呈,乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu),球面狀，直徑為42 nm，基因組僅為3.2 kb。病毒顆粒的主要,結(jié)構(gòu)蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化,和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白包括核心抗原（ HBcAg ）、,此外，被乙肝病毒感染的人肝臟還能合成并釋放大量的22,病毒DN

30、A聚合酶、微量病毒蛋白。,nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是各種未裝配的包裝蛋白的,1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽。,乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因,ATG,ATG,ATG,TAA,108 aa,55 aa,226 aa,preS1,preS2,S,S 多肽,226 aa,M 多肽,281 aa,L 多肽,399 aa,乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的,傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備,乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞膜上提取出來的。這種來源的,疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。,產(chǎn)乙肝表面

31、抗原的重組釀酒酵母,20世紀(jì)80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，主要工作包括,將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活,性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平,均顆粒直徑為 22 nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中,的病毒顆粒相同。,目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞,總蛋白量的1%-2%。,進(jìn)一步的研究表明，M多肽和L多肽對S型疫苗具有顯著的增效作,用，由三者（或兩者）構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對 S抗,原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。,產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母,整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建,PARS2,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,Bgl II,pBSAG151,11 kb,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,his+的轉(zhuǎn)化子,重組分子,轉(zhuǎn)化his-的受體細(xì)胞,染色